徐營營 程玲 張曉 孫琳 王允 畢建忠

(山東大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，山東 濟(jì)南 250033)

阿爾茨海默病(AD)是以進(jìn)行性記憶力下降和其他認(rèn)知功能障礙為特征的一種慢性神經(jīng)退行性疾病，是導(dǎo)致癡呆的最常見病因。2017年世界衛(wèi)生組織報告顯示，全球約有5 000萬癡呆患者，預(yù)計到2050年，全世界癡呆患者將超1.31億，其中約60%～70%為AD患者〔1〕。據(jù)統(tǒng)計，2015年中國AD患者超過700萬人，總花費超1.1萬億元，預(yù)計到2030年將達(dá)3.4萬億元，2050年將達(dá)到12.7萬億元〔2〕。隨著我國人口老齡化的加劇、AD患病率的增加，給家庭和社會帶來了極大的壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)〔2〕。因此，深入探討AD的發(fā)病機制、積極尋找新的治療藥物，具有重要的科研價值、經(jīng)濟(jì)效益和社會意義。

1 線粒體功能障礙與AD

盡管神經(jīng)病理學(xué)研究表明，β-淀粉樣蛋白(Aβ)在AD發(fā)病中起核心作用，但是，AD具有復(fù)雜的病因和發(fā)病機制，到目前為止尚未完全明確。目前研究發(fā)現(xiàn)，AD的發(fā)病機制主要包括基因突變、Aβ級聯(lián)反應(yīng)學(xué)說、tau蛋白學(xué)說、神經(jīng)炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激學(xué)說、神經(jīng)血管學(xué)說、線粒體功能障礙假說等〔3,4〕。

越來越多研究表明，線粒體功能障礙通過多種方式參與AD發(fā)病，包括線粒體DNA(mtDNA)的突變與缺失、線粒體生物合成功能障礙、線粒體自噬異常、線粒體動力學(xué)改變等方式〔4,5〕。線粒體基因的改變和損傷引起的線粒體功能障礙被認(rèn)為是AD發(fā)病的主要機制之一〔6〕。最近研究表明，線粒體基因存在表觀遺傳學(xué)改變，在許多線粒體功能障礙相關(guān)的疾病中發(fā)揮重要作用，因此，有學(xué)者提出，線粒體表觀遺傳學(xué)可能是導(dǎo)致AD的一種潛在發(fā)病機制〔7〕。

2 DNA甲基化與AD

表觀遺傳學(xué)是指在有絲分裂或減數(shù)分裂中可遺傳的基因功能的改變，這些變化不能用DNA序列改變來解釋〔8〕。主要的表觀遺傳學(xué)修飾模式包括DNA堿基的共價修飾(包括DNA甲基化、羥甲基化、醛基化和羧基化修飾)、組蛋白變異、組蛋白的翻譯后修飾、RNA修飾和非編碼RNA(ncRNA)等〔9〕。其中，DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳學(xué)模式，在生長、發(fā)育及調(diào)控基因表達(dá)等方面發(fā)揮重要作用〔10〕。DNA甲基化主要是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的催化作用下，甲基從S-腺苷甲硫氨酸(SAM)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的第5位碳原子上，使之變成5-甲基胞嘧啶(5mC)的共價修飾模式。在細(xì)胞核中，胞嘧啶甲基化主要發(fā)生在位于胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤(CpG)島內(nèi)的CpG雙核苷酸中〔8,10〕。DNA甲基化導(dǎo)致DNA分子結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶、拓?fù)洚悩?gòu)酶或抑制蛋白與DNA結(jié)合，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)功能障礙〔11〕。DNA甲基化與許多疾病密切相關(guān)，包括腫瘤、動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病、精神分裂癥、癲癇、自身免疫性疾病等多種疾病〔10〕。目前，人外周血中DNA甲基化檢測已經(jīng)開始用于癌癥患者的早期篩查和診斷。

既往多個研究發(fā)現(xiàn)，在AD中全基因組DNA甲基化水平及多個候選基因的甲基化水平存在異常改變，但結(jié)果并不完全一致，也存在一些相互矛盾的結(jié)果〔12,13〕。此外，AD患者外周血中DNA異常甲基化，也可作為AD早期診斷及病情發(fā)展的生物學(xué)標(biāo)志物〔13〕。此外，由于DNA甲基化是可逆的，研究DNA甲基化在AD發(fā)病中的機制，可以為進(jìn)一步治療干預(yù)提供新的靶點。

3 線粒體DNA甲基化

線粒體作為細(xì)胞內(nèi)的“動力工廠”，通過氧化磷酸化(OXPHOS)產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)為細(xì)胞提供能量〔7,14〕。線粒體是真核細(xì)胞中，除細(xì)胞核外，唯一存在遺傳物質(zhì)的細(xì)胞器。mtDNA獨立于核基因組，以母系、非孟德爾遺傳方式〔15〕。人類mtDNA是由富含鳥嘌呤的重鏈和富含胞嘧啶的輕鏈構(gòu)成的雙環(huán)狀結(jié)構(gòu)，大小為16 569 bp〔7〕。mtDNA中唯一的非編碼區(qū)，又稱D環(huán)區(qū)(D-loop)，長度為1 124 bp，含有mtDNA復(fù)制起始點和轉(zhuǎn)錄啟動子，是mtDNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)控區(qū)〔16〕。mtDNA的編碼區(qū)包含13個與電子傳遞鏈(ETC)或OXPHOS相關(guān)的基因，22個轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)基因和2個核糖體RNA(rRNA,包括12S rRNA和16S rRNA)基因。此外，mtDNA還包含一些編碼ncRNA的假基因〔17〕。其余1 158個線粒體蛋白質(zhì)由細(xì)胞核基因編碼并通過各種途徑轉(zhuǎn)運到線粒體中，以維持線粒體的功能〔18〕。線粒體是細(xì)胞中的關(guān)鍵細(xì)胞器，在細(xì)胞能量代謝、產(chǎn)生活性氧(ROS)、血紅素生物合成、鈣離子信號傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化和凋亡等許多生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的功能〔7〕。線粒體功能障礙與年齡、腫瘤、心臟病及AD、帕金森病(PD)、亨廷頓病等神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)〔19〕。

關(guān)于mtDNA能否甲基化一直存在爭議，直到2011年，有研究發(fā)現(xiàn)線粒體中存在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)1，其含有一個線粒體靶向序列，可以易位到線粒體中，與線粒體D-loop結(jié)合，在胞嘧啶甲基化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，才使得mtDNA甲基化逐漸引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注〔20〕。后來，其他研究檢測到mtDNA中也存在5mC和5hmC，并且在線粒體中發(fā)現(xiàn)了其他的甲基化酶，包括DNMT 3A和DNMT 3B〔21〕。mtDNA缺乏具有保護(hù)作用的組蛋白和有效的DNA修復(fù)系統(tǒng)，因此其對氧化應(yīng)激比核基因更敏感，易被ROS損傷，而ROS也是導(dǎo)致DNA甲基化的明確誘因〔22〕。雖然人mtDNA只占整個細(xì)胞DNA的不足1%，但mtDNA有435個CpG位點和4 747個非CpG位點的胞嘧啶，與核基因不同，mtDNA沒有經(jīng)典的CpG島〔23〕。盡管目前還有一些爭議，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為mtDNA的CpG位點、非CpG位點(包括CpA、CpT和CpC)的胞嘧啶和腺嘌呤均可發(fā)生甲基化〔24〕。但是，mtDNA發(fā)生甲基化和去甲基化的具體機制尚不清楚〔18〕。與核DNA相比較而言，mtDNA整體甲基化程度較低，有學(xué)者提出，線粒體D-looP平均甲基化水平約小于等于5%〔25〕。盡管缺乏直接證據(jù)，但mtDNA甲基化很可能通過調(diào)節(jié)mtDNA的復(fù)制和基因表達(dá)水平在許多病理生理過程中發(fā)揮重要作用〔26〕。

4 AD中mtDNA甲基化的研究

近年來，多項研究表明，mtDNA甲基化與年齡、環(huán)境污染、藥物及許多疾病相關(guān)，包括肌萎縮側(cè)索硬化(ALS)、PD、AD、糖尿病視網(wǎng)膜病變、非酒精性脂肪肝、腫瘤、心血管疾病等〔9,21,27～31〕。mtDNA甲基化有望成為疾病的一種重要的生物學(xué)標(biāo)志物和診斷工具，但目前對mtDNA甲基化參與疾病發(fā)病具體機制的相關(guān)研究較少，mtDNA甲基化是疾病的病因還是疾病的結(jié)果，目前也尚未明確〔18〕。

線粒體功能障礙是許多神經(jīng)退行性疾病的一個重要特征，有學(xué)者提出AD中的線粒體功能障礙也可以通過mtDNA異常甲基化來部分解釋〔32〕。近幾年的相關(guān)研究也表明，mtDNA甲基化與AD、PD、ALS等多種神經(jīng)退行性疾病相關(guān)，但僅限于少數(shù)幾項研究中〔33～35〕。在AD中，mtDNA甲基化的研究才剛起步。Blanch等〔34〕研究發(fā)現(xiàn)，8例AD患者腦標(biāo)本中，內(nèi)嗅皮層的線粒體D-loop甲基化水平升高，而線粒體ND1基因甲基化水平降低。而在3月齡、6月齡和12月齡的AD小鼠模型，即淀粉樣前體蛋白/早老素(APP/PS)1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦新皮質(zhì)中，檢測發(fā)現(xiàn)線粒體D-loop甲基化水平隨著疾病進(jìn)展，呈現(xiàn)出先升高后降低的動態(tài)變化。Stoccoro等〔33〕研究了133例晚發(fā)型AD(LOAD)和130例對照者外周血中線粒體D-loop的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)LOAD患者的外周血中線粒體D-loop甲基化水平較對照組明顯下降。而既往我們研究發(fā)現(xiàn)，9月齡的AD小鼠海馬中，線粒體12S rRNA基因甲基化水平較對照組小鼠升高，推測mtDNA甲基化可能在AD發(fā)病中起重要作用〔36〕。而AD中線粒體其他基因甲基化的研究較少，mtDNA甲基化與AD的關(guān)系尚不完全明確，且mtDNA甲基化是AD中線粒體功能障礙的病因還是結(jié)果，及mtDNA甲基化影響AD發(fā)病的具體機制，還有待于進(jìn)一步研究證實。近年來，隨著DNA甲基化編輯技術(shù)的發(fā)展，針對特定CpG位點進(jìn)行精確的靶向甲基化修飾，將有助于對mtDNA甲基化的具體生理功能和病理機制進(jìn)行更深入的研究，進(jìn)而為探討AD的發(fā)病機制提供新的方向〔37〕。此外，由于表觀遺傳修飾的可逆性，mtDNA甲基化的研究為AD中線粒體功能障礙的治療干預(yù)提供了新的途徑。

總之，mtDNA甲基化作為近年的一個新的熱點，其研究尚處于起始階段。有學(xué)者提出，mtDNA甲基化可能是導(dǎo)致AD的一種潛在的發(fā)病機制。但目前為止，只有幾項研究檢測了AD患者腦標(biāo)本、外周血及AD動物模型中mtDNA甲基化的變化，且多集中于D-loop，還需要進(jìn)一步研究來闡明mtDNA甲基化的生物學(xué)意義及其與AD的因果關(guān)系。