鄭 婕 黃漢輝 劉 磊

廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 廣東廣州 510000

早期妊娠稽留流產(chǎn)(missed early miscarriage，MEM)患者是指妊娠12周內(nèi)超聲判定妊娠囊或胚胎停止生長(zhǎng)，或胎心消失且妊娠組織未排出體外者[1]。MEM病因復(fù)雜，其中胚胎絨毛染色體異?？筛哌_(dá)40%，還有約50%的MEM患者無(wú)法查明病因。而在不明原因的流產(chǎn)中，有相當(dāng)一部分是免疫因素導(dǎo)致的[1-2]。妊娠本身是一種典型的同種免疫移植過(guò)程，妊娠組織攜帶父源基因，正常情況下卻能抵抗母體免疫細(xì)胞的攻擊，目前其機(jī)制不明。現(xiàn)有研究顯示，自然殺傷(NK)細(xì)胞在胚胎植入及蛻膜形成過(guò)程中顯著增多，是妊娠子宮蛻膜中最主要的免疫細(xì)胞，并且其主要聚集在胎盤(pán)部位的蛻膜處，提示蛻膜NK細(xì)胞在母胎免疫耐受中可能起著非常重要的作用[3-4]。NK細(xì)胞表達(dá)何種功能取決于其表面受體的表達(dá)，受體通過(guò)相應(yīng)配體傳遞信號(hào)進(jìn)而調(diào)節(jié)NK細(xì)胞的功能。NK細(xì)胞表面受體種類較多，其中NKG2A和NKG2D分別是最重要的抑制性和活化性受體[5]。目前關(guān)于NKG2受體家族在妊娠組織中的表達(dá)及其功能研究較少，本研究通過(guò)檢測(cè)NK細(xì)胞表面受體NKG2A、NKG2D及其配體MHC-I類鏈相關(guān)分子A(MHC class I chain related protein A，MICA)在早期稽留流產(chǎn)蛻膜組織中的表達(dá)，來(lái)探討NKG2A、NKG2D及其配體MICA在免疫因素稽留流產(chǎn)中的意義，以期為免疫性流產(chǎn)患者的治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2019年6月—2021年6月在廣州市婦女兒童醫(yī)療中心就診的50例MEM患者為MEM組，另選同期50例社會(huì)因素人工流產(chǎn)孕婦為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：既往月經(jīng)周期規(guī)則、無(wú)異常妊娠史、無(wú)生殖器官畸形，無(wú)內(nèi)外科疾病、無(wú)傳染病史、無(wú)生殖道感染史、無(wú)家族遺傳病史、單胎、妊娠期間無(wú)異常陰道流血。兩組均排除：患者>35歲、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)史、自身免疫性疾病史、胚胎染色體檢查結(jié)果異常者。本研究經(jīng)過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書(shū)。兩組一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。

表1 兩組患者一般情況比較

1.2 研究方法

1.2.1 采用RT-PCR法檢測(cè)蛻膜組織中NKG2A、NKG2D和MICA mRNA的表達(dá) 采用負(fù)壓吸引術(shù)，在無(wú)菌操作下留取兩組蛻膜組織，使用PBS緩沖液沖洗。取100 mg蛻膜組織，加入Trizol細(xì)胞裂解液1 mL，按說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA，每份樣品取2.5 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)反應(yīng)合成cDNA，之后進(jìn)行RCR擴(kuò)增，同時(shí)擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)參照。各引物由GeneCore公司合成，采用RT-PCR試劑盒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，PCR循環(huán)參數(shù)設(shè)置為：94 ℃變性3 min；94 ℃和56～61 ℃分別為30 s，72 ℃為1 min，循環(huán)擴(kuò)增35次后，72 ℃延伸10 min。使用15%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，通過(guò)凝膠成像儀檢測(cè)結(jié)果。使用Imange J分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的條帶的吸光度容積與β-actin條帶吸光度容積的比值作為目的條帶的相對(duì)含量。引物序列、擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，見(jiàn)表2。

表2 擴(kuò)增物、引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.2.2 采用Western Blotting法檢測(cè)蛻膜組織中NKG2A、NKG2D和MICA蛋白的表達(dá) 采用負(fù)壓吸引，在無(wú)菌操作下留取兩組蛻膜組織，使用PBS緩沖液沖洗。按100 ∶400 ∶4比例在100 mg蛻膜組織中分別加入細(xì)胞裂解液、酶抑制劑，低溫離心提取蛋白，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白作為對(duì)照，采用酶標(biāo)儀測(cè)量OD值以計(jì)算蛋白濃度。使用Santa公司生產(chǎn)的兔抗人NKG2A、NKG2D和MICA抗體，樣品經(jīng)凝膠電泳后轉(zhuǎn)NC膜，使用脫脂奶粉封閉4 h后在4 ℃ 1 ∶200一抗中孵育過(guò)夜，復(fù)溫1 h后1 ∶1 000二抗孵育4 h，完成后使用BCIP/NBT顯色10～20 min。使用Image J分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的蛋白條帶的吸光度容積與β-actin條帶吸光度容積的比值作為目的蛋白的相對(duì)含量。

1.2.3 采用免疫組化(SP)法檢測(cè)MICA表達(dá)部位 使用10%甲醛固定蛻膜和流產(chǎn)絨毛，樣品經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟后加入0.1 moL/L枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液，加入30 mL/L過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常血清封閉20 min。加入1 ∶50兔抗人MICA抗體，4℃過(guò)夜；按羊抗兔SP試劑盒說(shuō)明書(shū)滴加鏈霉素抗生物素蛋白過(guò)氧化物酶復(fù)合物，采用DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 蛻膜組織中NKG2A、NKG2D和MICA mRNA的表達(dá)

如圖1所示，在MEM組和對(duì)照組蛻膜組織中，均可見(jiàn)NKG2A、NKG2D和MICA mRNA的表達(dá)。在表達(dá)量上，MEM組中NKG2A mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組，而NKG2D和MICA mRNA的表達(dá)水平則高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

注：1，MEM組；2，對(duì)照組

表3 兩組蛻膜組織中NKG2A、NKG2D和MICA mRNA的表達(dá)情況

2.2 蛻膜組織中NKG2A、NKG2D和MICA 蛋白的表達(dá)

如圖2所示，在MEM組和對(duì)照組蛻膜組織中，均可見(jiàn)NKG2A、NKG2D和MICA蛋白的表達(dá)。在表達(dá)量上，MEM組NKG2A蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組，而NKG2D和MICA 蛋白表達(dá)水平則高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

注：1，MEM組；2，對(duì)照組

表4 兩組蛻膜組織中NKG2A、NKG2D和MICA蛋白表達(dá)情況

2.3 MICA蛋白表達(dá)部位

如圖3 所示，免疫組化顯示在滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中均可見(jiàn)MICA蛋白的表達(dá)。

圖3 滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)細(xì)胞中均可見(jiàn)MICA表達(dá)(×400)

2.4 NKG2A、NKG2D及MCIA相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NKG2A與NKG2D、MCIA mRNA呈負(fù)相關(guān)(r=-0.68、-0.72，P<0.05)；NKG2A與NKG2D、MCIA 蛋白呈負(fù)相關(guān)(r=-0.77、-0.75，P<0.05)；NKG2D與MCIA mRNA呈正相關(guān)(r=-0.68、-0.72，P<0.05)。

3 討論

蛻膜化是指胚胎植入子宮過(guò)程當(dāng)中子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為蛻膜細(xì)胞的過(guò)程，在這個(gè)過(guò)程當(dāng)中絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞植能夠植入蛻膜化的子宮內(nèi)膜當(dāng)中，這一過(guò)程為胚胎的發(fā)育提供了物質(zhì)保障，同時(shí)蛻膜基質(zhì)細(xì)胞與母體局部免疫反應(yīng)密切相關(guān)，與蛻膜基質(zhì)相關(guān)的一些因素能夠?qū)е乱幌盗刑喝焉锓磻?yīng)，比如MEM的發(fā)生[6]。目前研究表明，免疫因素是在MEM發(fā)病的重要因素之一。胎兒與母體存在著類似于同種異體移植的免疫學(xué)關(guān)系：正常妊娠中，母胎之間免疫調(diào)控達(dá)到平衡，即免疫耐受；而免疫耐受一旦遭到破壞，母體會(huì)對(duì)胎兒產(chǎn)生免疫攻擊，由此引發(fā)流產(chǎn)[7]。各種免疫因素中，NK細(xì)胞是妊娠子宮中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞，這提示NK細(xì)胞可能在妊娠子宮內(nèi)免疫調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8-9]，其可通過(guò)各種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響胎兒發(fā)育的過(guò)程[10]。因而，對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程中NK細(xì)胞相關(guān)途徑進(jìn)行研究或許能夠揭示MEM發(fā)生的深層次原因。

在子宮蛻膜化過(guò)程中，NK細(xì)胞會(huì)急劇增加[11]，增加的NK細(xì)胞參與了多種進(jìn)程，維持了母體妊娠過(guò)程的正常進(jìn)行。NK細(xì)胞的功能取決于其表面受體，但NK細(xì)胞表面受體種類眾多，究竟何種受體作用最重要目前尚不清楚。目前，對(duì)于NKG2A和NKG2D這兩種受體的研究逐漸受到關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，在白血病、胰腺癌等惡性腫瘤中，二者間表達(dá)失衡的情況下會(huì)導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[12-14]。而在子癇前期患者，已有研究證實(shí)，患者外周血和臍血NK細(xì)胞數(shù)量顯著增高，且增殖活性和殺傷活性明顯增強(qiáng)；同時(shí)妊娠期子宮NK細(xì)胞NKG2A表達(dá)遠(yuǎn)高于外周血，推測(cè)子癇前期患者除存在全身免疫失衡外，還可能存在蛻膜局部免疫改變，從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能[15-16]。MEM與子癇前期有一致的病理生理基礎(chǔ)——滋養(yǎng)細(xì)胞侵蝕及螺旋動(dòng)脈重鑄，但在MEM患者子宮中是否有類似的免疫改變，目前研究還較少。

NKG2A是NK細(xì)胞最重要的抑制性受體，滋養(yǎng)層NKG2A與配體HLA-E特異性結(jié)合后，抑制子宮NK細(xì)胞活化，從而阻止其殺傷胚胎組織[17]。NKG2D則是NK細(xì)胞表面活化性受體之一，對(duì)NK細(xì)胞有較強(qiáng)的活化作用。本研究顯示在MEM患者當(dāng)中，相比于對(duì)照組，NGK2A表達(dá)降低而NGK2D表達(dá)升高，因此我們推測(cè)在子宮蛻膜當(dāng)中抑制性受體NKG2A與活化性受體NKG2D共同發(fā)揮作用，維持某種平衡，使得NK細(xì)胞的活性處于較為合適的程度并進(jìn)而形成母胎免疫，既確保了胎兒的正常發(fā)育又有效地行使著免疫功能。同時(shí)，相關(guān)性分析顯示NKG2A與NKG2D存在負(fù)相關(guān)，這也驗(yàn)證了二者之間存在某種聯(lián)系，共同調(diào)控MEM的發(fā)生，但這還需要進(jìn)一步的研究進(jìn)行驗(yàn)證。NKG2D作為活化性受體，與其他活化受體不同的是，其能通過(guò)自身形成同二聚體而發(fā)揮作用，但目前其作用途徑尚不清楚[18]。MICA是NKG2D的主要配體，是一種跨膜蛋白。研究顯示，NKG2D可通過(guò)與MICA結(jié)合，在多肽DAPL0的介導(dǎo)下激活NK細(xì)胞[19]。本研究顯示在MEM患者當(dāng)中，MICA蛋白廣泛分布于滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜基質(zhì)中，且其表達(dá)顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。這說(shuō)明在MEM患者當(dāng)中，MICA可能介導(dǎo)了NKG2D對(duì)NK細(xì)胞的激活作用：NKG2D表達(dá)量升高與高表達(dá)的MICA受體結(jié)合，向下游傳遞激活信號(hào)從而使得母體對(duì)胚胎產(chǎn)生殺傷性作用，導(dǎo)致MEM的產(chǎn)生。

綜上所述，本研究顯示MEM的發(fā)生可能是由于患者蛻膜組織中NK細(xì)胞抑制性受體NKG2A表達(dá)的減少，而活化性受體NKG2D及其配體表達(dá)的增高，這打破了二者之間的某種平衡，活化性受體NKG2D的表達(dá)上調(diào)，通過(guò)結(jié)合特異性信號(hào)蛋白MICA進(jìn)行信號(hào)傳遞，使患者發(fā)生母胎界面免疫失衡，從而導(dǎo)致MEM的發(fā)生。對(duì)其分子機(jī)制的進(jìn)一步探究可能為此類患者的治療提供一定理論基礎(chǔ)。