鄭世榜 邱 華 李永強 廖思娜 廖小莉

廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣西南寧市 530021

藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury，DILI)是藥物、膳食補充劑和保健品引起常見的不良反應(yīng)之一。研究表明，中國的藥物性肝損傷的發(fā)生率達到每10萬人口就有約24人發(fā)病，而抗腫瘤藥物是引起DILI的第三大常見原因，占比8.34%[1]。臨床上常因藥物性肝損傷而導(dǎo)致抗腫瘤治療時間延長或者抗腫瘤藥物劑量降低，從而影響患者的治療效果，是目前臨床亟待解決的熱點問題之一。

水飛薊素是水飛薊(歸肝、膽經(jīng))的主要成分，是一種天然保肝的黃酮類化合物。它可通過抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗纖維化、刺激肝臟細胞再生等而發(fā)揮保肝作用[2]。中華醫(yī)學(xué)會的藥肝診治指南對DILI的保肝推薦藥物中水飛薊素是一線推薦用藥[3]。水飛薊制劑肝病臨床應(yīng)用專家共識提出對藥物性肝損傷，特別是毒蕈中毒所致肝損傷，首先推薦使用水飛薊素治療；使用水飛薊素可預(yù)防或減少抗結(jié)核藥物所致藥物性肝損害[4]。

然而不同藥物導(dǎo)致的肝損機制是不同的，且護肝藥物的療效也是不一樣的，鑒于水飛薊素具有多靶點的特點，為進一步更好指導(dǎo)臨床用藥，將采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對接的方法來篩選并且探討水飛薊素抗藥物性肝損傷主要的藥效靶點，為DILI的精準治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 水飛薊素靶點獲取 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取水飛薊素對應(yīng)的靶點蛋白信息輸入 Uniprot數(shù)據(jù)庫，將目標蛋白轉(zhuǎn)化為“智人”物種以及選擇對應(yīng)已驗證的基因符號，從而進行靶點蛋白和基因匹對，獲得作用靶點，在CTD數(shù)據(jù)庫中以水飛薊素為關(guān)鍵詞，初篩水飛薊素的作用靶點，將上述靶點合并且刪除重復(fù)靶點后，獲取水飛薊素作用靶點。

1.2 DILI疾病基因獲取及治療靶點的篩選 運用GEO數(shù)據(jù)庫下載芯片數(shù)據(jù)原始文件GSE54255，此芯片收集5例藥物性肝損傷肝臟切片和5例正常對照肝臟切片的基因測序信息的樣本，利用R語言軟件中的limma 包分析差異基因，設(shè)置調(diào)整后的P<0.05和|log 2倍變化(FC)|>1為截斷閾值。差異分析的結(jié)果使用ggplot2 軟件包將繪制成火山圖和熱圖。運用GeneCards數(shù)據(jù)庫和OMIM數(shù)據(jù)庫，以“Drug-induced liver injury”為檢索詞收集藥物性肝損傷的靶點。將GEO數(shù)據(jù)庫、GeneCards 和 OMIM 數(shù)據(jù)庫的疾病基因合并，刪除重復(fù)靶點后得到DILI疾病基因靶點。利用在線Venny2.1平臺繪制藥物靶點與疾病靶點的韋恩圖，篩選出水飛薊素抗藥物性肝損傷的治療靶點。

1.3 成分—靶點圖的繪制和蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、核心藥靶的篩選 將“1.2”項所得交集基因?qū)隒ytoscape軟件，進行藥效成分—靶標網(wǎng)絡(luò)的可視化，藥物活性成分和作用靶點以“節(jié)點”表示，節(jié)點之間的相互作用以“邊”表示，然后將交集基因輸入 String 數(shù)據(jù)分析平臺進行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，選擇物種為智人，選擇互動得分≥0.9，刪除游離的蛋白，獲取水飛薊素治療藥物性肝損傷的 PPI 網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)，并將PPI數(shù)據(jù)保存為TSV格式，將TSV格式文件導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖；為進一步篩選出水飛薊素抗DILI的核心基因，使用CytoNCA工具(Cytoscape插件)來分析靶基因的拓撲屬性，采用度中心性(DC)、間中心性(BC)、接近中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、局部邊連通性(LAC) 和網(wǎng)絡(luò)中心性(NC)六個參數(shù)來估計網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的中心屬性[5]，節(jié)點參數(shù)量化值越高，表明節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中重要性越大；在PPI網(wǎng)絡(luò)中，采用上述六個參數(shù)大于中位數(shù)1倍進行兩次篩選，獲取水飛薊素作用于DILI的核心靶點。

1.4 GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析 為進一步研究核心靶點功能及水飛薊素在治療DILI中的主要作用通路，利用R包clusterProfiler對“1.2”項中獲得的治療靶點進行 GO和 KEGG分析，設(shè)置P值和糾正后P值均<0.05進行可視化分析。

1.5 分子對接 從PubChem 數(shù)據(jù)庫下載水飛薊素和常用護肝藥還原性谷胱甘肽的二維化合物結(jié)構(gòu)，用Chemoffice軟件整合成三維結(jié)構(gòu)，并對三維結(jié)構(gòu)進行最小結(jié)合能的優(yōu)化，從PDB數(shù)據(jù)庫中下載“1.3”項篩選出的degree值前5核心靶點的3D結(jié)構(gòu)，運用 Pymol軟件進行預(yù)處理，移除靶蛋白中的原有配體和水分子。使用Autodock對預(yù)處理后的靶蛋白添加氫原子，并將處理后的受體(靶標蛋白)和配體(水飛薊素、還原性谷胱甘肽)文件保存為 PDBQT格式。設(shè)置Gridbox的坐標及大小，運行Autodock vina進行尋找柔性對接的最佳對接條件，記錄受體與配體的對接位置，以此來評估靶蛋白與化合物的結(jié)合情況，最后使用 Pymol軟件觀察和分析靶蛋白和化合物的對接結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 DILI相關(guān)靶點篩選結(jié)果 根據(jù)篩選條件，對 GEO 芯片數(shù)據(jù)庫的基因芯片進行分析獲得1 706個差異表達基因，其中上調(diào)基因872個，下調(diào)基因834個，運用 R 語言軟件繪制DILI相關(guān)芯片的差異表達基因的火山圖和聚類圖，見圖1。GeneCards數(shù)據(jù)庫設(shè)置相關(guān)系數(shù)≥10獲得428個DILI相關(guān)基因，OMIM數(shù)據(jù)庫獲得35個疾病相關(guān)基因，去除數(shù)據(jù)庫重復(fù)項后共獲得2 108個DILI相關(guān)靶點。

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2.2 水飛薊素治療肝損傷的潛在作用靶點預(yù)測結(jié)果 TCMSP以及CTD 數(shù)據(jù)庫中獲得水飛薊素的靶點 270個，GEO、GeneCards 以及 OMIM 數(shù)據(jù)庫中獲得DILI的相關(guān)靶點2 108個，通過利用在線工具Venny2．1取交集后顯示，水飛薊素與DILI形成的藥物—疾病交集靶基因有112個，見圖2。

2.3 成分—靶標的網(wǎng)絡(luò)以及靶標的獲取 成分靶點網(wǎng)絡(luò)圖共由113個節(jié)點組成，包括藥物節(jié)點(飛薊素)1個(黃色)，其余節(jié)點表示靶點，其中藍色節(jié)點表示水飛薊素對該基因相關(guān)蛋白有抑制作用，粉色節(jié)點表示存在雙向作用，紅色表示促進作用，綠色節(jié)點表示有一定的作用，但是作用方式未知，見圖3(來源：CTD數(shù)據(jù)庫)。在STRING數(shù)據(jù)庫中獲取藥物與疾病靶點的 PPI的TSV格式文件，導(dǎo)入Cytoscape軟件，得到潛在節(jié)點共 103個，邊458條的PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖4。利用插件 CytoNCA ，篩選條件為：BC、CC、DC、EC 、LAC 、NC參數(shù)均大于中位值，經(jīng)過兩個過濾篩選，最終得到9個核心靶點(按degree值從高到低),見表1。一般而言，高degree的蛋白更傾向于是關(guān)鍵蛋白。

圖3 “成分—靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)圖

表1 核心靶點按degree值(DC)從高到低

2.4 GO功能富集分析 運用R包clusterProfiler進行對“2.2”項中篩選的交集基因進行GO功能富集分析后共獲得條目2 479 條(其中生物過程2 335 個，分子功能 117個，細胞組成27個)，生物過程(BP)主要涉及炎癥應(yīng)激、免疫反應(yīng)、氧化應(yīng)激等方面；分子功能(MF)主要涉及細胞因子受體、細胞因子活性等方面；細胞組成(CC)主要涉及分泌性顆粒狀管腔、細胞質(zhì)囊泡腔等方面。各類別位于前五的條目,見圖5。

2.5 KEGG通路富集 運行R包clusterProfiler篩選得到165條信號通路(P<0.05)，其中排名前 30的通路繪制氣泡圖，見圖5。KEGG結(jié)果顯示與藥物性肝損傷密切相關(guān)的通路有：TNF信號通路、IL-17信號通路等。

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2.6 分子對接 經(jīng)過篩選最終選擇將“2.3”項的degree值(DC值)前3的關(guān)鍵靶蛋白STAT3、TNF、RELA作為核心靶點,相應(yīng)的化合物水飛薊素和還原型谷胱甘肽作為小分子，回顧文獻尋找活性中心后開展分子對接。分子對接親和力<-5.0kJ/mol，這表明水飛薊素與關(guān)鍵靶蛋白能穩(wěn)定的結(jié)合，結(jié)合信息及參數(shù)見表2， 其中結(jié)合自由能最小，常見的藥物性肝損傷的靶點TNF-α[6]的3D分子對接圖，見圖6。

表2 核心靶點—化合物的結(jié)合能(kcal/mol)

圖6 水飛薊素和核心靶點TNF的分子對接圖

3 討論

水飛薊疏肝利膽、清熱解毒，用于肝膽濕熱和黃疸。水飛薊素作為水飛薊的主要成分，是臨床上治療藥物性肝損傷的基礎(chǔ)藥物。目前水飛薊素已成為國內(nèi)多個權(quán)威肝病指南的推薦用藥[3,7-9]。而在針對抗結(jié)核藥物、毒蕈中毒引起的DILI治療中, 水飛薊素也成為我國專家共識的保肝用藥一線推薦[4]。然而水飛薊素抗藥物性肝損傷的治療主要基于臨床經(jīng)驗，其作用分子機制仍未完全明確。因此篩選和識別水飛薊素對DILI的治療靶點具有重要意義，為臨床的精準治療提供參考。

網(wǎng)絡(luò)分析篩選得到篩出最終核心靶點包括STAT3、TNF、RELA等藥效靶標。STAT3是一種細胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)錄因子，在介導(dǎo)肝損傷的過程中起著至關(guān)重要的作用[10]。如圖3所示，水飛薊素可以下調(diào)STAT3的表達。大量的動物實驗表明STAT3表達的下降可以保護小鼠免受多種藥物誘導(dǎo)的肝毒性[11-13]。因而水飛薊素或許是通過抑制STAT3的表達而發(fā)揮抗DILI作用。TNF-α是腫瘤壞死因子家族的成員,作為主要促炎的細胞因子，在肝臟的細胞凋亡、細胞增殖和免疫反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用。TNF-α在DILI進程中發(fā)揮加重肝損傷的作用[6]，它能通過激活鞘氨醇激酶來激活PI3K/Akt通路，從而調(diào)節(jié)肝細胞凋亡[14]。最近的一項研究證實了水飛薊素可能通過抑制TNF-α表達來減輕雷公藤內(nèi)酯誘導(dǎo)的DILI[15]，而圖3所示，水飛薊素調(diào)節(jié)TNF的表達是雙向的，這提示水飛薊素可通過精密調(diào)控TNF-α的濃度而發(fā)揮其抗DILI的作用。RELA是典型的NF-κB家族成員之一，用于調(diào)節(jié)控制炎癥，細胞死亡和增殖基因的轉(zhuǎn)錄。RELA參與肝臟損傷炎癥的調(diào)節(jié)[16]。研究表明RELA高表達水平在肝炎患者可以抗肝臟凋亡和減緩肝硬化程度，甚至可以降低死亡率[17-18]，但對于DILI來說，研究報道抑制RELA的表達能減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷[19]。值得注意的是，在GEO數(shù)據(jù)庫得出的差異基因中，肝損傷組RELA表達是上升的，而CTD數(shù)據(jù)庫中提示水飛薊素可以下調(diào)RELA，從而提示水飛薊素可能通過下調(diào)RELA，從而改善藥物性肝傷。

通路富集分析顯示水飛薊素主要作用于以TNF信號通路為主的炎癥或氧化應(yīng)激通路。TNF信號通路參與細胞損傷、免疫和炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，是控制肝穩(wěn)態(tài)的細胞內(nèi)通路[20]。TNF-α及其相關(guān)細胞因子在肝臟穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，它們可以激活肝細胞的促凋亡(主要是半胱天冬酶)和抗凋亡(主要是NF-κB通路)[21]。藥物可引起氧化還原變化，進而抑制TNF信號通路里面的抗調(diào)亡的生存途徑如 NF-κB。研究表明，亞毒性劑量的乙酰氨基酚能對 NF-κB 進行抑制，從而使肝細胞對腫瘤壞死因子 (TNF) 的細胞毒性作用愈加敏感[22]。

最終筆者篩出的STAT3、TNF、RELA等靶基因基本富集在TNF信號通路中，為進一步驗證水飛薊素的藥效靶點，采用分子對接的方法進行深入的探究，選取了排名degree值前3名的靶點與水飛薊素和還原型谷胱進行對接，結(jié)果表明水飛薊素與3個核心靶蛋白的結(jié)合能穩(wěn)定結(jié)合，水飛薊素的平均結(jié)合能高于還原型谷胱甘肽，尤其是與TNF-α的結(jié)合，達到了-10.4kcal/mol(圖6、表2)。Wullaert A等研究發(fā)現(xiàn)TNF-α的激活是肝臟炎癥發(fā)生的最早事件之一[23]，提示水飛薊素在DILI的炎癥早期或許就能發(fā)揮出較強抗炎作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以及分子對接的技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，水飛薊素治療DILI的核心藥靶為 STAT3、TNF、RELA等靶點，主要是通過調(diào)控TNF信號通路為主的涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細胞調(diào)亡的多條信號通路發(fā)揮抗藥物性肝損傷的作用，并通過分子對接驗證了藥效靶點與水飛薊素之間良好結(jié)合。然而本研究是基于現(xiàn)有文獻中的數(shù)據(jù)來挖掘水飛薊素抗藥物性肝損傷的藥效靶點，其結(jié)論仍需更多的研究進行驗證。