曹玲華 肖光旭 賀 爽 朱 彥

(1 天津中醫(yī)藥大學(xué)組分中藥國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，301617； 2 天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院中藥新藥研發(fā)中心，天津，300457)

慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure，CHF)是多種不同疾病包括冠心病和高血壓等導(dǎo)致的臨床綜合征。在臨床上主要癥狀表現(xiàn)為心輸出量減少、組織器官灌注不足和靜脈系統(tǒng)淤血。

目前CHF的西藥治療多以“金三角”藥物為主，包括β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑類藥物和醛固酮受體拮抗劑三者合并用藥，同時(shí)也會(huì)輔以利尿藥和強(qiáng)心藥等，多采用聯(lián)合用藥。這些藥物主要以神經(jīng)內(nèi)分泌抑制劑為主，短期內(nèi)可以同步達(dá)到有效擴(kuò)張血管、降低心臟前后負(fù)荷、增加心肌收縮力的重要作用，改善CHF的絕大部分臨床癥狀。但是也伴隨著多種不良反應(yīng)的發(fā)生，并且西藥的作用靶點(diǎn)比較單一[1-2]，神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活在心室重構(gòu)甚至CHF的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。心室重塑是CHF進(jìn)展的重要階段，主要表現(xiàn)為心肌肥大和疾病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)增加。本研究選用神經(jīng)內(nèi)分泌刺激劑來(lái)誘導(dǎo)CHF，目前的防治目標(biāo)主要是緩解心室重塑的發(fā)展，并且降低患者的病死率和再入院率[3]。

中藥復(fù)方在防治CHF過(guò)程中具有多靶點(diǎn)、多通路和安全性高等特點(diǎn)。CHF在中醫(yī)中屬于“心悸”“心痹”和“心水”等。在中華文明幾千年臨床實(shí)踐中，中醫(yī)古籍記載了許多安全有效的經(jīng)典方劑。防己黃芪湯(FJHQD)就出自張仲景《金匱要略》，由防己、黃芪、白術(shù)和甘草4味中藥組成，具有益氣活血、健脾利水的功效。中藥中所含的活性化合物在基礎(chǔ)研究中表明具有抗炎，抗氧化應(yīng)激，免疫調(diào)節(jié)，增強(qiáng)心肌收縮力，減輕缺血再灌注損等功能[4-6]。同時(shí)臨床研究表明，防己黃芪湯對(duì)高血壓、射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭、穩(wěn)定型心絞痛等具有顯著療效，并且能夠改善CHF及其導(dǎo)致的水腫等癥狀[7-8]。

去氧腎上腺素(Phenylephrine，PE)是一種兒茶酚胺腎上腺素能受體激動(dòng)劑，作為一種重要的神經(jīng)體液激素，眾多研究表明其刺激心肌細(xì)胞會(huì)導(dǎo)致心肌肥大，最終造成CHF[9-13]。因此在本實(shí)驗(yàn)中使用PE誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞CHF模型作為研究對(duì)象。國(guó)內(nèi)和國(guó)際的CHF治療指南中心房利鈉肽(Atrial Natriuretic Peptide，ANP)和腦利鈉鈉肽(Brain Natriuretic Peptide，BNP)已成為重要的生物標(biāo)志物，目前臨床上血漿ANP和BNP肽水平已廣泛用于CHF患者的診斷和預(yù)后評(píng)估[14]。這2個(gè)最重要的生物標(biāo)志物分別主要由心房和心室產(chǎn)生和分泌[15]。PE過(guò)度激活心肌細(xì)胞上的G蛋白偶聯(lián)受體引起肥大效應(yīng)，因此在本實(shí)驗(yàn)中通過(guò)測(cè)量不同組別中的細(xì)胞面積和檢測(cè)胞內(nèi)ANP和BNP的水平來(lái)評(píng)估藥物對(duì)PE誘導(dǎo)的CHF的藥效。

近年來(lái)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的應(yīng)用在中藥研究中取得了顯著進(jìn)展[16-18]，網(wǎng)絡(luò)藥理研究采用系統(tǒng)生物學(xué)的方法，與傳統(tǒng)中醫(yī)理論中的“整體觀”相輔相成，在中藥藥效的機(jī)制通路預(yù)測(cè)中發(fā)揮著重要作用。因此，本研究運(yùn)用藥效實(shí)驗(yàn)與網(wǎng)絡(luò)藥理體系構(gòu)建分析相結(jié)合的方法進(jìn)行研究。見(jiàn)圖1。

圖1 本研究的工作流程注

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 防己黃芪湯由本課題組按原方劑量制備；去氧腎上腺素(北京索萊寶，批號(hào)：MB1602)；一抗α-actinin(1∶400，Proteintech武漢三鷹，批號(hào)：11313-2-AP)；熒光二抗Alexa Fluor 555(1∶1 000，美國(guó)Abcam，批號(hào)：GR3241278-3)；DMEM(Gibco，美國(guó)，批號(hào)：12800-017)；胰蛋白酶-EDTA(0.25%，Gibco，美國(guó)，批號(hào)：5200-072)；雙抗(Gibco，美國(guó)，批號(hào)：1514022)；H9c2心肌細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)上海細(xì)胞庫(kù))；胎牛血清(北京賽澳美，批號(hào)：SA211.02)；TRIzol? Reagent提取液(Ambion，美國(guó)，批號(hào)：15596018)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Roche，瑞士，批號(hào)：04897030001)；BestarTMqPCR MasterMix(Bestar，德國(guó)，型號(hào)：DBI-2043)；高內(nèi)涵篩選系統(tǒng)(PerkinElmer，美國(guó)，型號(hào)：Operetta)；NanoDrop微量分光光度計(jì)(Invitrogen，美國(guó)，型號(hào)：NanoDrop One2000)；PCR儀(Roche，瑞士，型號(hào)：LightCycler? 480)。

1.2 PE誘導(dǎo)的心肌肥大模型的建立 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2心肌細(xì)胞放于溫度37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至一定的密度后，消化傳代并將心肌細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)后，按照1.5×105個(gè)/孔的密度將心肌細(xì)胞接種至6孔板或按5×103個(gè)/孔的密度將心肌細(xì)胞接種至96孔透明底黑板中，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6孔板中的細(xì)胞用于PCR實(shí)驗(yàn)，96孔板中的細(xì)胞用于免疫熒光實(shí)驗(yàn)。24 h后從培養(yǎng)箱中取出孔板，用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基使細(xì)胞饑餓24 h，以達(dá)到同步化生長(zhǎng)的狀態(tài)。24 h后給藥組提前1 h預(yù)給藥，加入0.05 mg/mL防己黃芪湯溶液，除正常對(duì)照組(CON)加入杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)外，其余各組均加入10 μmol/L的去氧腎上腺素，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，重新放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá) 細(xì)胞造模結(jié)束后，吸棄孔中培養(yǎng)基，向細(xì)胞中加入TRIzol(一種新型總RNA抽提試劑)等試劑提取心肌細(xì)胞總RNA，注意保證在冰袋上操作。然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取到的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后在八連排中將cDNA與Master Mix和引物混合。隨后將其置于實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中以檢測(cè)mRNA表達(dá)水平。本實(shí)驗(yàn)所用的引物包括ANP和BNP均以GAPDH作為內(nèi)參，將所得Ct值按照2-△△Ct的方法進(jìn)行處理。引物序列由上海生工生物有限公司合成。本實(shí)驗(yàn)所用具體序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.4 細(xì)胞免疫熒光法評(píng)價(jià)藥物對(duì)細(xì)胞面積的影響 心肌細(xì)胞造模結(jié)束后，吸棄孔中培養(yǎng)基，分別先后向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.2% TritonX-100打孔，并用5%血清封閉2 h后，加入α-輔肌動(dòng)蛋白抗體過(guò)夜孵育，第2天用帶有熒光標(biāo)記的二抗和Hoechst 33342的染料共同孵育一段時(shí)間后，上機(jī)用高內(nèi)涵系統(tǒng)檢測(cè)每組的細(xì)胞平均面積(Cell Area)。本實(shí)驗(yàn)共分為3組，包括對(duì)照組(CON)，模型組(PE)，防己黃芪湯給藥組(FJHQD)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Graphpad Prism 7.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖。

1.5 防己黃芪湯中活性成分及其作用靶點(diǎn)篩選 本研究使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，(http://tcmspw.com)對(duì)防己黃芪湯中所含防己、黃芪、白術(shù)、甘草4味中藥進(jìn)行化學(xué)成分檢索以建立防己黃芪湯活性成分信息表[19]。每個(gè)成分的口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18時(shí)納入中藥活性成分[20]。并且以中藥名為關(guān)鍵詞在國(guó)家知識(shí)基礎(chǔ)設(shè)施數(shù)據(jù)庫(kù)(China National Knowledge Infrastructure，CNKI)和Pubmed(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選文獻(xiàn)報(bào)道的活性化合物加以補(bǔ)充。活性化合物的作用靶點(diǎn)篩選主要使用TCMSP并結(jié)合CNKI和Pubmed的文獻(xiàn)報(bào)道構(gòu)建。并利用UniProt(https://www.uniprot.org)數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)基因名稱校準(zhǔn)并剔除沒(méi)有靶點(diǎn)的化合物[21]，從而得到防己黃芪湯的活性成分及其分別對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息。

1.6 CHF相關(guān)靶點(diǎn)篩選 疾病相關(guān)靶點(diǎn)主要從PubMed數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards(https://www.genecards.org/)和國(guó)際藥學(xué)文摘(International Pharmaceutical Abstracts，IPA)數(shù)據(jù)庫(kù)，以“慢性心力衰竭”為關(guān)鍵詞對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行收集。在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中，Score值越高表明此靶點(diǎn)與此疾病相關(guān)性越高，因此本研究選擇Score值大于4倍Score值中位數(shù)的靶點(diǎn)作為CHF的潛在靶點(diǎn)，將所有數(shù)據(jù)庫(kù)中的靶點(diǎn)合并，去除重復(fù)值后整理出CHF的相關(guān)靶點(diǎn)。

1.7 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析 靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建遵循網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)指南的標(biāo)準(zhǔn)[22]，將防己、黃芪、白術(shù)和甘草4味中藥的靶點(diǎn)合并去除重復(fù)，得到防己黃芪湯的活性成分靶標(biāo)集。并利用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。利用Venny將防己黃芪湯(FJHQD)的活性成分靶標(biāo)集和CHF的靶點(diǎn)集取交集并繪制韋恩圖。將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING11.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，其中最小互相作用閾值設(shè)定為“Highest Confidence”(>0.95)，刪除沒(méi)有連接的靶點(diǎn)，其余均為默認(rèn)設(shè)置，將結(jié)果導(dǎo)出并用Cytoscape對(duì)其網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析和可視化處理。將潛在作用靶點(diǎn)與所對(duì)應(yīng)的化合物導(dǎo)入Cytoscape，繪制網(wǎng)絡(luò)圖，其中藍(lán)色菱形代表藥物活性成分，橙色橢圓形代表藥物作用的靶點(diǎn)。通過(guò)Cytoscape內(nèi)置的Network Analyzer分析防己黃芪湯防治CHF各個(gè)活性成分和靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)。

1.8 防己黃芪湯防治CHF的功能富集與作用通路的分析 為進(jìn)一步闡明防己黃芪湯在防治CHF過(guò)程中所改善的生物功能以及所作用的信號(hào)通路，本研究分別采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david-d.ncifcrf.gov/)進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析，R語(yǔ)言的ClusterProfiler包進(jìn)行京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。利用DAVID 6.7平臺(tái)對(duì)防己黃芪湯防治CHF的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，以P-value<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到的GO分析結(jié)果。GO富集分析分為3類：生物過(guò)程(Biological Process，BP)、細(xì)胞組分(Cell Component，CC)和分子功能(Molecular Function，MF)。

在GO富集中將基因列表導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行富集分析，篩選條件設(shè)定為P<0.05，并對(duì)得到的結(jié)果進(jìn)行分析。將GO分析結(jié)果按P-value值進(jìn)行排序，分別選取BP、CC和MF的前5繪制組合圖。使用R語(yǔ)言的ClusterProfiler包分析FJHQD防治CHF的作用通路并繪制氣泡圖。其中氣泡的大小與通路中受FJHQD調(diào)控的靶點(diǎn)數(shù)量成正比，顏色代表富集顯著性，即P值大小，顏色越紅表示在此通路富集越顯著。利用Bioconductor中的R包ClusterProfiler version 3.12.0，設(shè)置P<0.05進(jìn)行KEGG富集分析[23]，并將富集排名前20的通路繪制氣泡圖。

1.9 防己黃芪湯防治CHF靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 將潛在作用靶點(diǎn)和篩選出的前10條作用通路導(dǎo)入Cytoscape構(gòu)建潛在作用靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用Cytoscape構(gòu)建防己黃芪湯防治CHF靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖，并分析有效成分及靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，包括連接度(Degree)、介度中心性(Betweenness Centrality)、緊密度(Closeness Centrality)等，并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)預(yù)測(cè)發(fā)揮藥效的核心靶點(diǎn)及主要活性成分。其中紅色箭頭代表作用通路，橙色橢圓形代表潛在活性成分。形狀大小和透明度值與度值的大小成正比。

2 結(jié)果

2.1 防己黃芪湯對(duì)PE誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞的保護(hù)作用藥效實(shí)驗(yàn) 結(jié)果表明，與模型組(PE)比較FJHQD對(duì)心肌細(xì)胞在mRNA水平上ANP和BNP的表達(dá)有顯著降低作用。見(jiàn)圖2。同時(shí)結(jié)合免疫熒光(Immunofluorescence，IF)實(shí)驗(yàn)，對(duì)心肌細(xì)胞α-輔肌動(dòng)蛋白進(jìn)行染色并計(jì)算細(xì)胞面積。見(jiàn)圖3?？梢园l(fā)現(xiàn)PE誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞面積有顯著增大，并且FJHQD組細(xì)胞面積有明顯減小。見(jiàn)圖4。說(shuō)明防己黃芪湯用于防治CHF在細(xì)胞水平上具有顯著藥效。

圖2 FJHQD對(duì)PE誘導(dǎo)心力衰竭模型標(biāo)志物的影響

圖3 心肌細(xì)胞α-輔肌動(dòng)蛋白染色(細(xì)胞免疫熒光法，×20)

圖4 FJHQD對(duì)PE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞面積的影響

2.2 成分靶標(biāo)預(yù)測(cè) 通過(guò)整合防己黃芪湯所含活性化合物及靶點(diǎn)信息共得到111個(gè)活性成分和419個(gè)靶點(diǎn)，同法CHF共得到636個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)。共得到FJHQD防治CHF166個(gè)。見(jiàn)圖5。潛在作用靶點(diǎn)共得到275個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 639條邊。見(jiàn)圖6。Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析表明，槲皮素連接度(Degree)最高為138，介度中心性(Betweenness Centrality)為0.209 3，緊密度(Closeness Centrality)為0.466，預(yù)測(cè)槲皮素為防己黃芪湯調(diào)治CHF的主要成分；其次為芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷。排名前10的活性化合物見(jiàn)表2。PTGS2在網(wǎng)絡(luò)中度值最大，預(yù)測(cè)PTGS2為最關(guān)鍵靶點(diǎn)。ESR1、AR、NOS2、CALM1、GSK3B、CDK2、ADRB2、ESR2、MAPK14、BCL2亦為相對(duì)重要的靶點(diǎn)。排名前20的核心靶蛋白見(jiàn)表3。

圖5 FJHQD和CHF作用靶標(biāo)的韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn) PPI網(wǎng)絡(luò)中共有122個(gè)靶蛋白、417種PPI。節(jié)點(diǎn)大小與蛋白質(zhì)節(jié)點(diǎn)的度值大小成正比，節(jié)點(diǎn)的顏色由藍(lán)色變橙色也代表此節(jié)點(diǎn)度值由小變大。邊的粗細(xì)與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間結(jié)合分?jǐn)?shù)成正比，且邊的顏色由藍(lán)色變橙色也代表蛋白質(zhì)之間相互作用的結(jié)合分?jǐn)?shù)由小變大。對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，度>均值(6.83)且緊密度(Closeness Centrality)>均值(0.383 053 275)的關(guān)鍵靶蛋白有39個(gè)，靶蛋白STAT3、JUN、TP53、AKT1、MAPK1、TNF、VEGFA的度和緊密度均較大，說(shuō)明在整個(gè)互作網(wǎng)絡(luò)中作用較大，可視為防己黃芪湯防治CHF的核心靶點(diǎn)。見(jiàn)圖7。

圖6 化合物-疾病潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表2 排名前10的活性化合物

圖7 潛在作用靶標(biāo)的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 防己黃芪湯防治CHF的生物功能與通路分析 BP相關(guān)的條目最多有493條，主要涉及藥物反應(yīng)、基因表達(dá)的正向調(diào)控、缺氧應(yīng)答、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、炎癥應(yīng)答、細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管新生等方面。CC相關(guān)的條目56條，主要涉及細(xì)胞間隙、細(xì)胞表面、細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞核等方面。MF相關(guān)的條目98條，主要涉及蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、腎上腺素結(jié)合和一氧化氮合酶活性等方面。分析結(jié)果揭示FJHQD防治CHF的主要作用通路為AGE-RAGE Signaling Pathway、HIF-1 Signaling Pathway和PI3K-AKT Signaling Pathway等相關(guān)通路。見(jiàn)8～9。

表3 排名前20的核心作用靶點(diǎn)

圖8 GO功能富集分析結(jié)果

圖9 KEGG估計(jì)分析氣泡圖

2.5 活性成分-靶點(diǎn)-作用通路網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建 活性成分-靶點(diǎn)-作用通路網(wǎng)絡(luò)圖直觀地體現(xiàn)了防己黃芪湯多靶點(diǎn)、多通路防治CHF的作用機(jī)制，同時(shí)也符合中藥復(fù)方發(fā)揮療效的特點(diǎn)。見(jiàn)圖10。

圖10 靶點(diǎn)-前10個(gè)通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

CHF是目前最為常見(jiàn)的心血管疾病，中藥復(fù)方在防治CHF等慢性復(fù)雜性疾病方面具有一定優(yōu)勢(shì)，在臨床上已有大量應(yīng)用。越來(lái)越多的臨床研究表明，益氣活血利水方能明顯改善氣虛血瘀水飲證心力衰竭患者的臨床癥狀[24-26]，與西藥常規(guī)治療相比效果顯著。同時(shí)在《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)》中針對(duì)CHF的脾虛水腫患者，已推薦使用防己黃芪湯加減方對(duì)癥治療[27]。

本研究首先通過(guò)藥效實(shí)驗(yàn)研究的方法從細(xì)胞水平上闡明了防己黃芪湯在防治CHF中的顯著療效，為中醫(yī)藥經(jīng)典名方的開發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的藥效基礎(chǔ)。接下來(lái)基于公共數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)分別構(gòu)建防己黃芪湯和CHF的靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，為今后進(jìn)一步的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。篩選出的潛在活性成分主要為槲皮素、芒柄花黃素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷、山柰酚、粉防己堿、異甘草素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、甘草素等，這些成分均為湯劑所含中藥研究較多且具有代表性的成分。針對(duì)各個(gè)單體查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，這些單體在基礎(chǔ)研究中防治心血管疾病方面均已有報(bào)道。粉防己堿是防己中具有重要代表性的生物堿類成分，屬于鈣離子拮抗劑，能夠顯著降低細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量，在保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心室功能，降低血壓等方面具有良好的藥效[28-29]。黃芪甲苷屬于黃芪中具有代表性的皂苷類成分，在治療心血管疾病方面已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，可促進(jìn)脂肪酸氧化，改善線粒體功能，抑制心力衰竭的發(fā)展[30]。毛蕊異黃酮是黃芪中具有代表性的黃酮類成分，可以通過(guò)激活ERα/β并增強(qiáng)心肌細(xì)胞中的蛋白激酶B磷酸化而發(fā)揮抗凋亡作用，從而保護(hù)心肌細(xì)胞[31]。槲皮素在黃芪和甘草中均含有，在降血壓、降血脂和增加冠脈血流量等方面具有顯著藥效[32]。因此推測(cè)粉防己堿、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮等是防己黃芪湯發(fā)揮藥效的主要活性成分，并可通過(guò)發(fā)揮抗炎、降血壓、抗氧化應(yīng)激和保護(hù)心血管的作用來(lái)防治CHF。

此外從化合物-疾病靶點(diǎn)通路可以發(fā)現(xiàn)，防己黃芪湯防治CHF的靶點(diǎn)主要集中在前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(Prostaglandin-Endoperoxide Synthase 2，PTGS2)、一氧化氮合酶2(Nitric Oxide Synthase 2，NOS2)、鈣調(diào)素1(Calmodulin 1，CALM1)、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma，PPARG)、雄激素受體(Androgen Receptor，AR)、糖原合酶激酶3β(Glycogen Synthase Kinase 3 Beta，GSK3B)、腎上腺素受體Beta 2(Adrenoceptor Beta 2，ADRB2)，其中PTGS2屬于前列腺素合成中的關(guān)鍵酶，在抗炎和抑制細(xì)胞凋亡方面有顯著作用，從而進(jìn)一步保護(hù)心肌細(xì)胞。AR和ADRB2均屬于GPCR，下游與CALM1相關(guān)聯(lián)，直接參與心肌收縮和血壓相關(guān)的調(diào)節(jié)。CALM1通過(guò)和鈣結(jié)合介導(dǎo)下游對(duì)大量酶、離子通道、水通道蛋白的調(diào)節(jié)，在心血管疾病治療方面發(fā)揮重要作用[33]。

由PPI網(wǎng)絡(luò)可以發(fā)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3在網(wǎng)絡(luò)中處于核心位置，可以與較多的蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3在心血管疾病方面已有很多研究，眾多研究表明其對(duì)線粒體具有直接保護(hù)作用，可以參與體內(nèi)的自噬和炎癥反應(yīng)，并且信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3在小鼠心臟中的表達(dá)與心肌肥大相關(guān)，今后也可以作為研究重點(diǎn)關(guān)注的指標(biāo)[34]。KEGG通路富集分析結(jié)果表明，防己黃芪湯防治CHF的靶點(diǎn)的主要作用通路為AGE-RAGE信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)-1信號(hào)通路、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B(Phosphatidylinositol-3-kinase-protein Kinase B Pathway，PI3K/AKT)信號(hào)通路、和炎性腸病。糖化應(yīng)激主要通過(guò)糖化終產(chǎn)物(Advanced Glycation End Products,AGEs)與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(Receptor for Advanced Glycation End Products,RAGE)的結(jié)合作用激發(fā)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，在心臟成纖維細(xì)胞中會(huì)發(fā)生成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而導(dǎo)致心肌纖維化或細(xì)胞外基質(zhì)沉積等，在CHF的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用[35]。HIF-1屬于缺氧誘導(dǎo)因子，在缺血缺氧心肌中抑制脂肪酸的分解代謝，可以調(diào)節(jié)葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖和血管形成的蛋白質(zhì)表達(dá)并且還可以靶向線粒體抵抗氧化應(yīng)激[36-37]。此外，缺乏HIF-1會(huì)導(dǎo)致血管生成障礙和心肌纖維化，從而導(dǎo)致CHF[38]。PI3K屬于胞內(nèi)的磷脂酰肌醇激酶，AKT位于PI3K的下游，AKT磷酸化后通過(guò)影響下游效應(yīng)因子的活化狀態(tài)調(diào)控細(xì)胞凋亡，從而改善心臟收縮舒張等功能[39-41]。因此，推測(cè)防己黃芪湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)體內(nèi)細(xì)胞凋亡、炎癥和脂肪酸代謝等相關(guān)通路來(lái)改善心室重塑，增強(qiáng)心肌收縮力，調(diào)節(jié)心肌氧化代謝從而達(dá)到防治CHF的效果。

本研究不同于以往的網(wǎng)絡(luò)藥理研究思路[42]，而是在藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上再進(jìn)行靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，以期預(yù)測(cè)通路機(jī)制更具有說(shuō)服力。靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖利用大數(shù)據(jù)形象直觀地展示了防己黃芪湯通過(guò)多成分多靶點(diǎn)多通路發(fā)揮抗CHF的潛力，與西藥單一成分發(fā)揮療效相比具有不可替代的優(yōu)勢(shì)。一方面藥效實(shí)驗(yàn)與網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)相結(jié)合相輔相成，有理有據(jù)。另一方面為防己黃芪湯開發(fā)用于CHF的治療提供了科學(xué)依據(jù)，也為發(fā)掘傳統(tǒng)經(jīng)方提供了新的方向。但美中不足的是，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于現(xiàn)有研究結(jié)果的大數(shù)據(jù)分析，具有以下局限性。一是在機(jī)制通路研究的創(chuàng)新性上具有局限性，基于現(xiàn)有研究結(jié)果很難發(fā)現(xiàn)新的作用靶標(biāo)通路；二是中藥復(fù)方活性成分可能并不僅僅是單味中藥所含各個(gè)化合物的簡(jiǎn)單組合，在煎煮前后或者入血前后均會(huì)發(fā)生變化。但是靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建在研究初期可以為我們的研究提供更多思路，從整體觀的角度看待中藥復(fù)方。后續(xù)我們也將在此基礎(chǔ)上從動(dòng)物水平，并結(jié)合組學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)，進(jìn)一步明確防己黃芪湯在防治CHF方面的靶點(diǎn)和通路。