侯菲，孫娜，高鳳春，戴瑩，李燕，金華

(1. 濟(jì)南市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心，山東 濟(jì)南 250001；2. 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院期刊)編輯部；3.濟(jì)南市婦幼保健院產(chǎn)科；4. 濟(jì)南市婦幼保健院檢驗(yàn)科；5. 濟(jì)南市婦幼保健院手術(shù)室)

近年來(lái)，新生兒出生缺陷的發(fā)生率逐漸升高，據(jù)報(bào)道，染色體異常是最常見(jiàn)的病因[1-3]。染色體非整倍性是指細(xì)胞的染色體數(shù)多或少了一條或多條。其中，21-三體綜合征(唐氏綜合征)、18-三體綜合征(愛(ài)德華氏綜合征)、13-三體綜合征(帕特氏綜合征)是最常見(jiàn)的三種染色體非整倍體疾病，其在新生兒的發(fā)病率分別為1/600～1/800、1/6000、1/10000[4]。染色體異常的患兒大多數(shù)表現(xiàn)為不同程度的智力低下，或同時(shí)合并器官畸形，通常伴有生活自理困難，給家庭、社會(huì)都造成了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，針對(duì)遺傳因素導(dǎo)致的出生缺陷尚無(wú)有效的治療手段，通過(guò)產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的方式，可以預(yù)防此類出生缺陷的發(fā)生[5-7]。

研究表明，80%～95%的母體DNA片段和5%～20%的胎兒游離DNA片段共同存在于母體的外周血中[8]。那么，當(dāng)胎兒為某染色體三體時(shí)，母體外周血中的胎兒游離DNA也同樣為三體，這使得母體外周血中該染色體的游離DNA比例與正常孕婦相比是升高的。這一比例改變可被高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模DNA分子序列分析時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)到，從而可以針對(duì)21-三體綜合征、18-三體綜合征或13-三體綜合征進(jìn)行產(chǎn)前輔助判斷[8-10]。因此，孕婦外周血胎兒游離DNA無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(NIPT)近年來(lái)廣泛應(yīng)用于胎兒染色體非整倍體的產(chǎn)前篩查。本文通過(guò)分析9470例孕婦外周血胎兒游離DNA NIPT檢測(cè)情況，探討此檢測(cè)在胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前篩查中的應(yīng)用價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

選擇于2017年7月至2020年7月在濟(jì)南市婦幼保健院進(jìn)行外周血NIPT的孕婦9470例，采集標(biāo)本前，所有孕婦均已簽署知情同意書(shū)。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

(1)35歲以上的高齡孕婦(以預(yù)產(chǎn)期日期計(jì)算，預(yù)產(chǎn)期年齡≥35歲的孕婦)；

(2)血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦；

(3)血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦；

(4)曾生育過(guò)染色體病患兒的孕婦；

(5)產(chǎn)前B超檢查懷疑胎兒可能有染色體異常的孕婦；

(6)夫婦一方為染色體異常攜帶者；

(7)醫(yī)師認(rèn)為有必要進(jìn)行產(chǎn)前診斷的其他情形。

符合以上條件之一的高危孕婦，即可入組進(jìn)行分析。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

孕婦近期曾接受過(guò)免疫治療、異體輸血、移植手術(shù)或造血干細(xì)胞治療等；溯源信息不完整的數(shù)據(jù)。

1.2 方法1.2.1 NIPT檢測(cè)方法

使用華大生物科技(武漢)有限公司胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測(cè)試劑盒(聯(lián)合探針錨定聚合測(cè)序法)，EDTA抗凝管采集孕婦外周血10 mL，離心并提取血漿中胎兒游離DNA，聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增建立文庫(kù)，采用基因測(cè)序儀(BGISEQ-500，深圳華大基因生物醫(yī)學(xué)工程有限公司)進(jìn)行高通量基因測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。

1.2.2 金標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)中國(guó)人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的《WS322.2-2010胎兒染色體異常與開(kāi)放性神經(jīng)管缺陷的產(chǎn)前篩查與診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)》第2部分：胎兒常見(jiàn)染色體異常的細(xì)胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)[11]，以介入性產(chǎn)前診斷手術(shù)結(jié)果(羊膜腔穿刺術(shù))和出生隨訪結(jié)果作為確診胎兒染色體非整倍體T21、T18、T13的對(duì)照“金標(biāo)準(zhǔn)”。NIPT結(jié)果為陽(yáng)性的孕婦介入性產(chǎn)前診斷為染色體異常的胎兒終止妊娠，NIPT結(jié)果為陰性的孕婦不需要進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷，通過(guò)出生后的隨訪作為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 介入性產(chǎn)前診斷

超聲引導(dǎo)下行羊膜腔穿刺術(shù)，抽取羊水25 mL，對(duì)羊水細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、觀察、消化、低滲、固定、滴片、烤片、分帶、G染色等步驟處理，最后進(jìn)行染色體核型分析計(jì)數(shù)。

1.2.4 妊娠結(jié)局隨訪

隨訪范圍包括進(jìn)行NIPT檢測(cè)的所有孕婦，隨訪內(nèi)容包括產(chǎn)前診斷結(jié)果、妊娠結(jié)局等。

1.2.5 數(shù)據(jù)收集及血清學(xué)、超聲篩查判定標(biāo)準(zhǔn)

收集可溯源的樣本編號(hào)、臨床診斷結(jié)果、孕周、孕婦年齡、唐氏血清學(xué)篩查結(jié)果、金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果等，記錄并保存。對(duì)全部收集數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

血清學(xué)唐篩高風(fēng)險(xiǎn)判定值：T21為1/270，T18為1/350。

血清學(xué)唐篩臨界風(fēng)險(xiǎn)判定值：T21為1/270～1/1000，T18為1/350～1/1000。

超聲NT篩查異常判定值：NT值≥3.0+

1.2.6 診斷效能

對(duì)陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率和一致性系數(shù)Kappa(K)值進(jìn)行評(píng)價(jià)。陽(yáng)性符合率、陰性符合率、總符合率：取值范圍在0%～100%之間，其值越接近于100%，結(jié)果越理想。Kappa值在0～1間判斷一致性才有意義，Kappa值越大，表示一致性越好。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

(1)四格表見(jiàn)表1。

表1 NIPT檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)配對(duì)四格表

(2)計(jì)算NIPT檢測(cè)的靈敏度、特異度和總符合率：

靈敏度=a/(a+c)×100%

特異度=d/(b+d)×100%

總符合率=(a+d)/(a+b+c+d)×100%

(3)計(jì)算一致性系數(shù)Kappa(Κ)值：

(4)計(jì)算NIPT檢測(cè)的陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值：

陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=a/(a+b)×100%

陰性預(yù)測(cè)值=d/(c+d)×100%

(5)靈敏度、特異度、總符合率、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值及陰性預(yù)測(cè)值95%CI：

①>90%，采用Wilson score方法計(jì)算95%CI；②<90%采用公式p±1.96×[p(1-p)/n]1/2計(jì)算。

(6)定性資料以[n(%)]表示。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)資料和分組

9470例孕婦病例中，孕婦預(yù)產(chǎn)期年齡18～49歲，平均(33.41±4.75)歲，其中高齡孕婦4867例(51.39%)，低齡孕婦4603例(48.61%)；孕婦孕周12.29～34.00周，平均(18.09±2.14)周；血清學(xué)篩查(T21或/和T18)高風(fēng)險(xiǎn)780例(8.24%)，血清學(xué)篩查(T21或/和T18)臨界風(fēng)險(xiǎn)3660例(38.65%)，染色體病患兒生育史0例(0%)，B超檢查異常(含NT篩查)128例(1.35%)，夫婦一方為染色體異常攜帶者0例(0%)，醫(yī)師認(rèn)為有必要的其他情形0例(0%)。

2.2 NIPT檢測(cè)結(jié)果

NIPT檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 NIPT檢測(cè)結(jié)果(n=9470)

2.3 金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果

9470例孕婦以出生隨訪結(jié)果作為“金標(biāo)準(zhǔn)”結(jié)果的有9402例(99.28%)，以介入性產(chǎn)前診斷(羊水穿刺/臍帶血穿刺/絨毛取材)結(jié)果為“金標(biāo)準(zhǔn)”的有68例(0.72%)。介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果(n=68)

2.4 NIPT檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

(1)按照年齡進(jìn)行分組，4867例高齡孕婦，NIPT檢出陽(yáng)性共39例，其中T21陽(yáng)性23例，T18陽(yáng)性7例，T13陽(yáng)性9例；“金標(biāo)準(zhǔn)”對(duì)照結(jié)果陽(yáng)性26例，其中T21陽(yáng)性21例，T18陽(yáng)性5例，T13陽(yáng)性0例。見(jiàn)表4。NIPT檢測(cè)的診斷效能見(jiàn)表5。

表4 高齡孕婦NIPT檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果比較

表5 高齡孕婦NIPT檢測(cè)的診斷效能

對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行Kappa一致性分析，算得Kappa=0.80，95%CI為0.69～0.91，P<0.05，表明在高齡孕婦組兩種方法總體比對(duì)結(jié)果有較好的一致性。

(2)4603例低齡孕婦NIPT檢出陽(yáng)性共30例，其中T21陽(yáng)性15例，T18陽(yáng)性10例，T13陽(yáng)性4例，T21/T18雙陽(yáng)性1例；“金標(biāo)準(zhǔn)”對(duì)照結(jié)果陽(yáng)性16例，其中T21陽(yáng)性14例，T18陽(yáng)性2例，T13陽(yáng)性0例。見(jiàn)表6。NIPT檢測(cè)的診斷效能見(jiàn)表7。

表6 低齡孕婦NIPT檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果比較

表7 低齡孕婦NIPT檢測(cè)的診斷效能

對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行Kappa一致性分析，Kappa=0.69，95%CI為0.54～0.85，P<0.05，表明在低齡孕婦組兩種方法總體比對(duì)結(jié)果有一定的一致性。

(3)T21/T18/T13三體總體結(jié)果分析

9470例孕婦中NIPT檢出陽(yáng)性共69例，其中T21陽(yáng)性38例，T18陽(yáng)性17例，T13陽(yáng)性13例，T21和T18三體雙陽(yáng)性1例；“金標(biāo)準(zhǔn)”對(duì)照結(jié)果陽(yáng)性42例，其中T21陽(yáng)性35例，T18陽(yáng)性7例，T13陽(yáng)性0例。見(jiàn)表8。NIPT檢測(cè)的診斷效能見(jiàn)表9。

表8 NIPT檢測(cè)與金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)結(jié)果比較

表9 NIPT檢測(cè)的診斷效能

對(duì)表中的數(shù)據(jù)進(jìn)行Kappa一致性分析，Kappa=0.76，95%CI為0.67～0.84，P<0.05，表明兩種方法總體比對(duì)結(jié)果有較好的一致性。

3 討論

近年來(lái)，利用母體外周血中胎兒游離DNA進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查胎兒染色體非整倍體已被廣泛應(yīng)用。孕婦外周血中游離DNA大部分來(lái)源于胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞，所以，正常情況下通過(guò)檢測(cè)孕婦外周血胎兒游離DNA水平就可以獲得與胎兒相同的結(jié)果[12]。與傳統(tǒng)的血清學(xué)產(chǎn)前篩查原理相比，NIPT檢測(cè)具有更高準(zhǔn)確性，同時(shí)，又在一定程度上可以降低因不必要的侵入性產(chǎn)前診斷帶來(lái)的流產(chǎn)、胎膜早破、宮內(nèi)感染等風(fēng)險(xiǎn)，為孕中期的高危孕婦提供了相對(duì)較為理想的產(chǎn)前篩查途徑，對(duì)降低出生缺陷具有重要的臨床價(jià)值[13-15]。

盡管如此，本文結(jié)果顯示孕中期高危孕婦的外周血胎兒游離DNA進(jìn)行無(wú)創(chuàng)性產(chǎn)前篩查與介入性產(chǎn)前診斷結(jié)果的比較，NIPT檢測(cè)相對(duì)產(chǎn)前診斷，具有一定的假陽(yáng)性。原因可能為:(1)2%的胎盤存在特異度嵌合體，胎盤特異度嵌合體指的是胎盤染色體是陽(yáng)性但胎兒染色體正常，或胎盤染色體是陰性但胎兒染色體異常的情況[16]。由于游離DNA檢測(cè)的DNA片段來(lái)自胎盤絨毛外層的滋養(yǎng)層細(xì)胞，因此，該種情況NIPT方法無(wú)法解決。(2)母體外周血中存在的胎兒游離DNA水平的濃度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性存在強(qiáng)相關(guān)性[17]。(3)母體染色體非整倍體和拷貝數(shù)變異影響。

總之，NIPT檢測(cè)與羊水細(xì)胞染色體檢查的定位不同，也就是說(shuō)，我們同樣不能忽略羊水細(xì)胞染色體檢測(cè)的重要性，例如超聲篩查提示胎兒存在結(jié)構(gòu)性異?；驊岩扇旧w異常，仍然需要以介入性產(chǎn)前診斷的方式進(jìn)行染色體檢查。介入性產(chǎn)前診斷是胎兒染色體異常診斷金標(biāo)準(zhǔn)[9]。

綜上所述，NIPT可用于胎兒染色體非整倍體疾病21-三體綜合征、18-三體綜合征或13-三體綜合征的產(chǎn)前篩查，與產(chǎn)前診斷技術(shù)或出生隨訪作為“金標(biāo)準(zhǔn)”對(duì)比，其總體準(zhǔn)確性和有效性符合臨床實(shí)際應(yīng)用的需求，值得推廣應(yīng)用。