張志鵬 鄧?yán)罴t 王壽富 黃夢(mèng)婷 李 玲 魏 梅

廣東一方制藥有限公司，廣東佛山 528244

馬鞭草為馬鞭草科植物馬鞭草Verbena officinatis L.的干燥地上部分[1]，多年生草本植物，花期在每年的6～8 月，在中國主要分布于江蘇、河南、貴州等地。馬鞭草主要含環(huán)烯醚萜類、黃酮類、揮發(fā)油類等化學(xué)成分[2-5]，具有鎮(zhèn)咳、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[6]，其中抗炎鎮(zhèn)咳的有效成分主要為環(huán)烯醚萜類和黃酮類[7]?！吨袊参镏尽穂8]中記載馬鞭草植物形態(tài)為莖四方形，多分枝，葉對(duì)生，穗狀花序頂生和腋生等。目前，學(xué)者們多對(duì)馬鞭草整株藥材進(jìn)行含量測(cè)定和指紋圖譜的研究[9-14]，而本研究通過測(cè)定馬鞭草藥材、根、主莖、側(cè)枝、葉、花穗的指紋圖譜，對(duì)不同形態(tài)部位的色譜圖進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別研究，為保證馬鞭草藥用的科學(xué)合理性提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。

1 儀器與材料

1.1 儀器

H-Class 型超高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；XP26 型、ME204E 型分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；111B 型二兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）；MiliQ Direct 8 型超純水機(jī)（默克密理博實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 材料

5-羥基馬鞭草苷對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq18110104，純度＞98.0%）；馬鞭草苷對(duì)照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)：M-042-180517，純度＞99.36%）；毛蕊花糖苷對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111530-201714，純度＞92.5%）；甲醇、乙腈（色譜純，默克股份有限公司）。

11批馬鞭草藥材（編號(hào)：A1～A11）經(jīng)魏梅主任藥師鑒定為馬鞭草科植物馬鞭草Verbena officinatis L.，產(chǎn)地信息見表1。將11 批馬鞭草藥材不同部位分開，分別得根（編號(hào)：B1～B11）、主莖（編號(hào)：C1～C11）、側(cè)枝（編號(hào)：D1～D11）、葉（編號(hào)：E1～E11）、花穗（：編號(hào)F1～F11）。

表1 藥材產(chǎn)地信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性

Waters HSS T3 色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；以乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相，梯度洗脫，洗脫程序：0～2 min，2%→10%A；2～12 min，10%→18%A；12～16 min，18%A；16～23 min，18%→25%A；23～28 min，25%→35%A；28～33 min，35%→60%A；33～35 min，60%→75%A；35～45 min，75%→95%A；45～50 min，95%→2%A。柱溫35℃；流速0.3 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量1 μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取5-羥基馬鞭草苷、馬鞭草苷、毛蕊花糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml 含5-羥基馬鞭草苷45 μg、馬鞭草苷66 μg、毛蕊花糖苷123 μg 的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末（過二號(hào)篩）約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇50 ml，搖勻，密塞，稱定重量，加熱回流120 min，冷卻，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)重，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜，濾過，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察 取藥材（A3）粉末約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)，重復(fù)進(jìn)樣6 次。以毛蕊花糖苷為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜3%，提示儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性考察 取藥材（A3）粉末約1.0 g，精密稱定，平行6 份，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)。以毛蕊花糖苷為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜1%，相對(duì)峰面積RSD＜3%，提示該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 取藥材（A3）粉末約1.0 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，室溫放置，分別在樣品制備后0、2、4、8、12、24 h 按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)。以毛蕊花糖苷為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD＜2%，相對(duì)峰面積RSD＜3%，提示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 超高效液相色譜指紋圖譜研究

取11 批馬鞭草藥材、根、主莖、側(cè)枝、葉和花穗，按“2.3”項(xiàng)下制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下檢測(cè)，采集不同部位的色譜圖，并將其導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 版）處理，分別以A1、B1、C1、D1、E1 和F1 圖譜作為參照，生成藥材、根、主莖、側(cè)枝、葉和花穗的指紋圖譜共有模式及其對(duì)照指紋圖譜，見圖1。藥材及花穗標(biāo)定共有峰22 個(gè)，葉21 個(gè)，主莖和側(cè)枝20 個(gè)，根14 個(gè)。通過對(duì)照品比對(duì)，指認(rèn)了7 號(hào)峰為5-羥基馬鞭草苷、8 號(hào)峰為馬鞭草苷、12 號(hào)峰為毛蕊花糖苷，見圖2。計(jì)算11 批馬鞭草不同部位超高效液相色譜指紋圖譜的相似度，結(jié)果顯示藥材與側(cè)枝的相似度較高，均＞0.98；與根的相似度較低，相似度＜0.95的有10 批，提示藥材與根整體差異較大。

圖1 馬鞭草不同部位超高效液相色譜指紋圖譜及對(duì)照?qǐng)D譜

圖2 馬鞭草藥材共有對(duì)照指紋圖譜與混合對(duì)照品色譜圖

2.6 化學(xué)模式識(shí)別研究

2.6.1 聚類分析 采用HemI 1.0 軟件對(duì)11 批馬鞭草藥材及其不同部位超高效液相色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行熱圖和聚類分析（空白處記為色譜峰缺失）。熱圖分析結(jié)果顯示，花穗、葉、側(cè)枝各共有特征峰顏色偏暖，提示各成分含量較高；根、主莖各共有特征峰顏色偏冷，提示各成分含量較低。聚類分析結(jié)果表明藥材與側(cè)枝的一致性較高，且與根和主莖區(qū)分明顯。見圖3。

圖3 馬鞭草不同部位熱圖和聚類分析樹狀圖

2.6.2 主成分分析 采用SIMCA-P 14.0 軟件對(duì)11 批馬鞭草藥材及其不同部位超高效液相色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，見圖4。不同部位樣品能夠分別集中聚在一起，根和主莖區(qū)分界線清晰，但距離較近，提示根和主莖在形態(tài)學(xué)部位上相連接，化學(xué)成分較為接近，仍可以通過主成分分析區(qū)分；藥材和側(cè)枝聚集在一起，無法區(qū)分，提示側(cè)枝與藥材無明顯差異。

圖4 馬鞭草不同部位的主成分分析二維得分散點(diǎn)圖

2.6.3 偏最小二乘法判別分析 結(jié)合VIP 值對(duì)11 批馬鞭草藥材及其不同部位超高效液相色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行偏最小二乘法判別分析，以VIP＞1.0 作為標(biāo)準(zhǔn)篩選對(duì)模型貢獻(xiàn)較大的7 個(gè)變量，由大到小依次為色譜峰7、17、16、3、21、2、8 號(hào)，提示這些成分是引起馬鞭草不同部位成分差異的主要標(biāo)志性成分。

3 討論

通過指紋圖譜進(jìn)行中藥的多組分研究分析更能體現(xiàn)藥材質(zhì)量的整體性[15-21]，基于超高效液相色譜指紋圖譜研究藥材去除非藥用部位的質(zhì)量評(píng)價(jià)研究具有十分重要的指導(dǎo)意義[22-25]。本研究結(jié)果顯示，色譜峰16 號(hào)僅出現(xiàn)在花穗中；葉中17 號(hào)峰含量非常低，而花穗中含量較高，推測(cè)藥材中色譜峰16、17 號(hào)峰主要來自于花穗，可將其作為6～8 月開花時(shí)采收的標(biāo)志性化學(xué)成分，保證化學(xué)成分合成和富集。偏最小二乘法判別分析分析顯示5-羥基馬鞭草苷是形成不同部位差異的重要指標(biāo)，其在藥材中質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高，具有抗炎、抗菌等作用，作為評(píng)價(jià)馬鞭草不同部位差異的指標(biāo)具有重要意義[6,26]。

本研究建立的指紋圖譜和化學(xué)模式識(shí)別分析方法能較好地反映馬鞭草不同形態(tài)部位化學(xué)成分的分布規(guī)律及差異性，但不同部位化學(xué)成分的差異及所占藥材比例不同與臨床療效是否緊密相關(guān)，尚需結(jié)合藥效學(xué)及安全性評(píng)價(jià)進(jìn)行系統(tǒng)性研究。