張建華， 楊延鈞， 呂彥鵬， 金雯雯， 陳傳亮

(1.鄭州大學(xué) 電氣工程學(xué)院，河南 鄭州 450001； 2.河南省人民醫(yī)院 放射科，河南 鄭州 450003)

0 引言

近年來(lái)，針對(duì)腫瘤治療的研究，出現(xiàn)了許多腫瘤治療新技術(shù)，其中脈沖電場(chǎng)電穿孔技術(shù)在腫瘤治療中已經(jīng)取得了卓越成效，是目前腫瘤治療的研究熱點(diǎn)[1-3]。所謂電穿孔(electroporation，EP)是指當(dāng)細(xì)胞置于高壓脈沖電場(chǎng)時(shí)，細(xì)胞膜的通透性瞬間提高，平時(shí)不能通過(guò)完整細(xì)胞膜的外源分子能夠輕易地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中分為可逆電穿孔(reversible electroporation，RE)與不可逆電穿孔(irreversible electroporation，IRE)?？赡骐姶┛资侵该}沖電場(chǎng)撤去后，細(xì)胞膜通透性逐漸恢復(fù)，細(xì)胞的正常生理活動(dòng)未受影響[4]。當(dāng)脈沖場(chǎng)強(qiáng)足夠高或者作用時(shí)間足夠長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞膜的通透性在脈沖電場(chǎng)撤去后不能恢復(fù)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，這種現(xiàn)象叫做不可逆電穿孔[5]。

基于可逆電穿孔的原理，微秒脈沖電場(chǎng)(mirosecond pulsed electric fields，μsPEF)已成功應(yīng)用于腫瘤的化學(xué)藥物治療。μsPEF具有靶向作用于細(xì)胞膜的特點(diǎn)，被用來(lái)提高很難滲透進(jìn)細(xì)胞的藥物在癌癥組織中的濃度，具有局部增強(qiáng)的細(xì)胞毒性效應(yīng)[6]，可有效減少抗腫瘤藥物的使用劑量從而降低毒副作用。當(dāng)前可逆電穿孔電化學(xué)療法多與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合使用，但是傳統(tǒng)化療藥物會(huì)對(duì)人體正常組織無(wú)差別殺傷，使人體產(chǎn)生多種不良反應(yīng)并且價(jià)格昂貴[7]。

近年來(lái)中醫(yī)藥在改善肺癌術(shù)后、放化療后的不良反應(yīng)以及抗腫瘤生長(zhǎng)方面發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用[8]。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)是中藥黃芪的主要揮發(fā)性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用，是重要的輔助治療藥物和保健品原料。研究證實(shí)，EPA對(duì)不同類型的癌細(xì)胞具有細(xì)胞活性抑制或誘導(dǎo)凋亡的作用，能抑制腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲及轉(zhuǎn)移[9]。并且研究顯示，EPA在對(duì)肺癌A-549細(xì)胞發(fā)揮特異性毒性的同時(shí)，合適劑量下對(duì)正常人體細(xì)胞無(wú)毒性[10]。但是單獨(dú)使用EPA對(duì)癌細(xì)胞的殺傷效果較弱，多與其他藥物聯(lián)合使用[11]。

為了探究μsPEF是否對(duì)EPA的藥效具有促進(jìn)作用，本文通過(guò)篩選合適的藥物濃度及電場(chǎng)強(qiáng)度參數(shù)，研究μsPEF產(chǎn)生的可逆電穿孔對(duì)EPA藥效的促進(jìn)作用，為后續(xù)電化學(xué)療法中藥物的選用提供新思路，并且為后續(xù)中藥成分干預(yù)癌癥的治療提供了重要的促進(jìn)手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

人肺癌細(xì)胞株A-549(ProcellCL-0016)、EPA(純度>99%，Sigma-Alidrich)、全自動(dòng)酶標(biāo)儀(SIGMA960)、1640培養(yǎng)基(索萊寶)、胎牛血清(索萊寶)、胰蛋白酶(索萊寶)、CCK-8試劑盒(索萊寶)、碘化丙啶(MedChemExpress)、無(wú)水乙醇(索萊寶)、電極杯(BTX)、脈沖發(fā)生設(shè)備(課題組自行研制)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肺癌A-549細(xì)胞培養(yǎng)傳代，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%以上時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液以備實(shí)驗(yàn)。

1.3 EPA毒性效果檢測(cè)

采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性，取培養(yǎng)完成的細(xì)胞消化離心，調(diào)整細(xì)胞數(shù)密度為4×105mL-1。各組分別加入不同EPA濃度的含藥培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱培育24 h，然后加入10 μL的CCK-8試劑，繼續(xù)孵育1.5 h。全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組在450 nm波長(zhǎng)的OD值，每組測(cè)5次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值，計(jì)算細(xì)胞活性。

1.4 脈沖發(fā)生設(shè)備

實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示，微秒脈沖發(fā)生設(shè)備為實(shí)驗(yàn)室自制，通過(guò)控制全固態(tài)絕緣柵雙極型晶體管(IGBT)開(kāi)關(guān)的開(kāi)斷來(lái)產(chǎn)生高壓脈沖電場(chǎng)。裝置產(chǎn)生的電壓：幅值0～3 kV可調(diào)，脈沖寬度1 μs～1 ms可調(diào)，頻率0.1～100 Hz可調(diào)。

圖1 高壓脈沖裝置示意圖Figure 1 Schematic diagram of high voltage pulse device

1.5 細(xì)胞膜通透性檢測(cè)

使用熒光染料碘化丙啶(PI)染色的方法檢測(cè)細(xì)胞膜穿孔率。PI是一種細(xì)胞核染色試劑，PI不能通過(guò)活細(xì)胞膜，但卻能穿過(guò)破損的細(xì)胞膜而對(duì)細(xì)胞核染色。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行μsPEF處理后，細(xì)胞膜表面形成電穿孔，使PI能夠進(jìn)入細(xì)胞對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。

1.6 μsPEF處理細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

對(duì)于電場(chǎng)殺傷實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)完成的細(xì)胞消化離心后重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量濃度為4×105mL-1，取120 μL細(xì)胞懸液放入電極杯中(電極間距0.4 cm)，用電場(chǎng)強(qiáng)度為750～2 000 V/cm(場(chǎng)強(qiáng)間隔為250 V/cm)，頻率為1 Hz，脈寬100 μs，個(gè)數(shù)10個(gè)的μsPEF處理，培養(yǎng)一定時(shí)間后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。

對(duì)于細(xì)胞通透性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)完成的細(xì)胞消化離心后重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量濃度為4×107mL-1。取10 μL細(xì)胞懸液加入50 μL的PBS以及6 μL濃度為1.5 mmol/L的PI，靜置3 min充分混勻后用μsPEF處理。然后從電極杯中取出50 μL細(xì)胞懸液放入EP管中避光3 min，再加入500 μL的PBS，對(duì)照組不進(jìn)行脈沖電場(chǎng)處理，其他操作與實(shí)驗(yàn)組完全相同。避光放置10 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PI染色率。

對(duì)于電場(chǎng)聯(lián)合藥物實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)完成的細(xì)胞消化離心后，分別加入含EPA以及不含EPA的培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞數(shù)量濃度為4×105mL-1。設(shè)置實(shí)驗(yàn)分組：①μsPEF+EPA實(shí)驗(yàn)組；②EPA組；③μsPEF組；④空白對(duì)照組。細(xì)胞重懸后立刻取120 μL細(xì)胞懸液放入電極杯中進(jìn)行μsPEF處理，空白對(duì)照組為相同體積不加EPA并且不經(jīng)過(guò)μsPEF處理的細(xì)胞懸液。處理后以每孔取20 μL(細(xì)胞數(shù)量8 000個(gè))的體積，加入96孔板各個(gè)復(fù)孔中，再加入各實(shí)驗(yàn)組相同藥物濃度的含藥培養(yǎng)基補(bǔ)充體積至每孔100 μL，培養(yǎng)24 h(48 h)后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)均進(jìn)行齊性檢驗(yàn)和正態(tài)檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS23.0軟件進(jìn)行分析。同一時(shí)間點(diǎn)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析。P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EPA對(duì)A-549細(xì)胞的毒性效果

A-549細(xì)胞活性與EPA濃度的關(guān)系如圖2所示，隨著EPA濃度的提高，A-549細(xì)胞活性呈逐漸下降的趨勢(shì)，并且與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。當(dāng)EPA濃度小于100 μmol/L時(shí)，對(duì)A-549細(xì)胞的活性影響很微弱，當(dāng)EPA濃度大于500 μmol/L時(shí)對(duì)A-549細(xì)胞的毒性過(guò)強(qiáng)。后續(xù)實(shí)驗(yàn)所用EPA濃度區(qū)間選擇100～400 μmol/L。

圖2 EPA對(duì)肺癌A-549細(xì)胞的毒性效果Figure 2 Toxic effect of EPA on lung cancer A-549 cells

2.2 細(xì)胞膜通透性

圖3為微秒脈沖電場(chǎng)作用下細(xì)胞膜穿孔率數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)圖。細(xì)胞穿孔率隨電場(chǎng)強(qiáng)度的升高而升高，當(dāng)場(chǎng)強(qiáng)達(dá)到1 000 V/cm時(shí)，細(xì)胞穿孔率顯著增高；而場(chǎng)強(qiáng)高于1 000 V/cm時(shí)，穿孔率提高的趨勢(shì)減緩；場(chǎng)強(qiáng)達(dá)到1 500 V/cm時(shí)，穿孔率已經(jīng)達(dá)到90%以上，此時(shí)大部分細(xì)胞都已經(jīng)發(fā)生了電穿孔。

圖3 不同場(chǎng)強(qiáng)處理下PI染色率Figure 3 PI dyeing rate under different electric field intensity

2.3 細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果

μsPEF對(duì)細(xì)胞活性的影響如圖4所示，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的升高，A-549細(xì)胞活性逐漸減弱。場(chǎng)強(qiáng)低于1 500 V/cm時(shí)A-549細(xì)胞能夠維持較高的細(xì)胞活性；場(chǎng)強(qiáng)高于1 500 V/cm時(shí)，細(xì)胞活性明顯降低；場(chǎng)強(qiáng)為1 750 V/cm和2 000 V/cm時(shí)，培養(yǎng)24 h細(xì)胞活性就已經(jīng)降低至80%以下。綜合考慮穿孔率和細(xì)胞活性，選擇高穿孔率、低殺傷率的場(chǎng)強(qiáng)參數(shù)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，盡可能降低脈沖電場(chǎng)本身對(duì)細(xì)胞的影響，脈沖場(chǎng)強(qiáng)范圍選擇1 000～1 500 V/cm。

圖4 不同場(chǎng)強(qiáng)的μsPEF對(duì)細(xì)胞活性的影響Figure 4 Effect of μsPEF with different electric field strength on cell viability

圖5～7分別是電場(chǎng)強(qiáng)度為1 000 V/cm、1 250 V/cm和1 500 V/cm的μsPEF聯(lián)合EPA作用對(duì)A-549細(xì)胞活性的影響。在不同場(chǎng)強(qiáng)的μsPEF作用下，細(xì)胞活性的整體變化趨勢(shì)基本相同。同一電場(chǎng)強(qiáng)度條件下，隨著EPA濃度的增加，細(xì)胞活性逐漸減弱，并且培養(yǎng)48 h比培養(yǎng)24 h時(shí)細(xì)胞活性更低，具有顯著性差異(P<0.05)。μsPEF聯(lián)合EPA共同作用與單獨(dú)施加EPA時(shí)相比，細(xì)胞活性明顯降低，說(shuō)明外加μsPEF能夠顯著增強(qiáng)EPA對(duì)A-549細(xì)胞的毒性效果。

圖5 1 000 V/cm的μsPEF聯(lián)合EPA對(duì)A-549細(xì)胞活性的影響Figure 5 Effect of 1 000 V/cm μsPEF combined with EPA on the viability of A-549 cells

圖6 1 250 V/cm的μsPEF聯(lián)合EPA對(duì)A-549細(xì)胞活性的影響Figure 6 Effect of 1 250 V/cm μsPEF combined with EPA on the viability of A-549 cells

圖7 1 500 V/cm的μsPEF聯(lián)合EPA對(duì)A-549細(xì)胞活性的影響Figure 7 Effect of 1 500 V/cm μsPEF combined with EPA on the viability of A-549 cells

從μsPEF對(duì)EPA毒性效果的提升程度來(lái)看，EPA濃度為300 μmol/L時(shí)，外加μsPEF對(duì)EPA細(xì)胞毒性效果提升程度最顯著。以EPA濃度300 μmol/L時(shí)為例，場(chǎng)強(qiáng)為1 000 V/cm時(shí)，μsPEF與EPA聯(lián)合作用下A-549細(xì)胞活性比單獨(dú)施加EPA時(shí)降低了32.77%(24 h)和39.35%(48 h)；場(chǎng)強(qiáng)為1 250 V/cm時(shí)，細(xì)胞活性降分別降低了36.17%(24 h)和41.86%(48 h)；場(chǎng)強(qiáng)為1 500 V/cm時(shí)，細(xì)胞活性分別降低了51.52%(24 h)和53.08%(48 h)。這也表明，在EPA濃度相同時(shí)，隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的升高，μsPEF與EPA的聯(lián)合作用效果也越強(qiáng)。

但值得注意的是，場(chǎng)強(qiáng)為1 500 V/cm的μsPEF單獨(dú)處理細(xì)胞后培養(yǎng)48 h，細(xì)胞活性就已經(jīng)下降到65%左右，此時(shí)脈沖電場(chǎng)本身就對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)的活性抑制效果，所以此參數(shù)下細(xì)胞活性減弱的主要原因可能是脈沖電場(chǎng)本身。

3 討論

有研究表明，μsPEF誘導(dǎo)細(xì)胞膜的電穿孔效應(yīng)與細(xì)胞尺寸大小相關(guān)，細(xì)胞半徑越大，在外加電場(chǎng)作用下形成的跨膜電位就越大，就更容易達(dá)到穿孔閾值[12]。本文所用A-549細(xì)胞直徑大約在15 μm，根據(jù)PI染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：場(chǎng)強(qiáng)為750 V/cm時(shí)，A-549細(xì)胞已出現(xiàn)了電穿孔，但是電穿孔率低；當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度高于1 000 V/cm時(shí)，PI染色率顯著增加。以上表明，在μsPEF作用下，細(xì)胞膜表面形成孔洞，使細(xì)胞膜通透性增加；并且細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果顯示，μsPEF對(duì)細(xì)胞的殺傷效果不強(qiáng)，沒(méi)有影響細(xì)胞的正常生理活性，即細(xì)胞膜表面出現(xiàn)了可逆電穿孔。

EPA是n-3多不飽和脂肪酸之一，人體自身不能合成，只能從食物中攝取。目前研究認(rèn)為，EPA有預(yù)防腫瘤的發(fā)生、抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。本研究結(jié)果顯示，EPA對(duì)A-549的細(xì)胞毒性始終呈現(xiàn)出劑量和時(shí)間依賴性：濃度越高，細(xì)胞毒性越強(qiáng)；并且在相同EPA濃度下，培養(yǎng)48 h要比培養(yǎng)24 h時(shí)對(duì)細(xì)胞毒性更強(qiáng)。有研究表明，不飽和脂肪酸可以對(duì)包括肺癌在內(nèi)的各種癌細(xì)胞產(chǎn)生選擇性細(xì)胞毒性，不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生不良影響[13]，EPA能誘導(dǎo)劑量和時(shí)間依賴性的細(xì)胞死亡[14]，并且能夠抑制肺癌A-549腫瘤細(xì)胞的增殖活性[15]，這與本文的EPA毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

綜合來(lái)看，脈沖電場(chǎng)作用后培養(yǎng)24 h和48 h，μsPEF都能夠顯著增強(qiáng)EPA對(duì)A-549細(xì)胞的毒性效果，并且其聯(lián)合作用效果(μsPEF對(duì)EPA抑制A-549細(xì)胞活性效果的促進(jìn)作用)并不是完全與EPA濃度和電場(chǎng)強(qiáng)度呈正相關(guān)。當(dāng)EPA濃度為300 μmol/L時(shí)聯(lián)合效果最佳，當(dāng)EPA濃度<300 μmol/L，其聯(lián)合作用效果與EPA濃度和電場(chǎng)強(qiáng)度呈正相關(guān)；當(dāng)EPA濃度>300 μmol/L，聯(lián)合作用效果隨EPA濃度升高和場(chǎng)強(qiáng)增加而逐漸減弱。

需要注意的是，相同EPA濃度下，電場(chǎng)強(qiáng)度越高，對(duì)EPA抑制A-549細(xì)胞活性效果的促進(jìn)作用也越強(qiáng)，不同場(chǎng)強(qiáng)的脈沖電場(chǎng)本身對(duì)細(xì)胞活性有不同程度的影響。進(jìn)一步對(duì)比分析可知，場(chǎng)強(qiáng)為1 250 V/cm時(shí)聯(lián)合作用效果比1 000 V/cm時(shí)略強(qiáng)，然而1 250 V/cm的μsPEF本身對(duì)細(xì)胞的殺傷作用也比1 000 V/cm時(shí)略強(qiáng)，故其聯(lián)合作用效果與1 000V/cm相比無(wú)顯著性差別。場(chǎng)強(qiáng)為1 500 V/cm時(shí)，脈沖電場(chǎng)本身對(duì)細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷作用，所以有更強(qiáng)的聯(lián)合作用效果，考慮到此時(shí)電場(chǎng)本身對(duì)細(xì)胞的強(qiáng)殺傷，綜合分析聯(lián)合作用效果不如場(chǎng)強(qiáng)為1 000 V/cm和1 250 V/cm時(shí)的作用效果。

4 結(jié)論

(1)EPA對(duì)A-549細(xì)胞的殺傷效果具有時(shí)間和濃度依賴性。

(2)μsPEF能夠增強(qiáng)A-549細(xì)胞膜通透性。隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增加，細(xì)胞通透性增強(qiáng)，細(xì)胞活性減弱。當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為1 000 V/cm和1 250 V/cm時(shí)，能夠保證對(duì)細(xì)胞的低殺傷率和高穿孔率，有利于藥物分子進(jìn)入細(xì)胞。

(3)μsPEF能有效增強(qiáng)EPA對(duì)A-549細(xì)胞的毒性效果。μsPEF聯(lián)合EPA處理A-549細(xì)胞后培養(yǎng)24 h和48 h，都是在EPA濃度為300 μmol/L時(shí)，μsPEF與EPA的聯(lián)合作用效果最佳，μsPEF能使EPA毒性效果提升40%以上。