陳加雄，李偉濱，黃乙書，廖小珊，林傳旭

（1.中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所，廣州 510301；2.汕頭市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣東 汕頭 515041）

在自然界中，海洋綠藻長(zhǎng)莖葡萄蕨藻（Caulerpa lentillifera）主要分布于中國(guó)南海、東南亞、日本沖繩、中國(guó)臺(tái)灣、大洋洲等熱帶和亞熱帶海域［1，2］，因其含有大量的粗多糖和粗纖維、蛋白質(zhì)和氨基酸、不飽和脂肪酸、礦物質(zhì)和多種微量元素，其中氨基酸種類齊全且呈味氨基酸占比較高［3-5］，是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的美味食品。此外，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻因?yàn)楹修г灞栋胼啤⒍嗵堑壬锘钚晕镔|(zhì)，可以用于治療痛風(fēng)、肥胖癥、Ⅱ型糖尿病等疾病，其提取純化物硫化多糖（SP1）具有顯著的免疫刺激活性［6-8］，所以長(zhǎng)莖葡萄蕨藻還是一種潛在的醫(yī)藥保健品原料。近年來(lái)由于需求量不斷增大，只有開(kāi)展人工養(yǎng)殖才能滿足市場(chǎng)需要，中國(guó)在養(yǎng)殖技術(shù)方面主要是研究溫度、鹽度、光照強(qiáng)度、氮磷營(yíng)養(yǎng)條件對(duì)無(wú)機(jī)碳的吸收和長(zhǎng)莖葡萄蕨藻對(duì)硒元素的富集作用以及生物量增加的影響［9-13］。在規(guī)?；B(yǎng)殖試驗(yàn)方面，有工廠化養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)研究、自然海區(qū)和室內(nèi)外水泥池養(yǎng)殖試驗(yàn)等［14-16］，但由于長(zhǎng)莖葡萄蕨藻對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求比較嚴(yán)格，生態(tài)因子稍有變化即會(huì)影響其正常生長(zhǎng)甚至死亡，規(guī)?；B(yǎng)殖技術(shù)尚未成熟。在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖過(guò)程中，經(jīng)常出現(xiàn)藻體和附著基發(fā)生細(xì)菌和雜藻污損的現(xiàn)象，細(xì)菌和硅藻附著在藻體上導(dǎo)致其生長(zhǎng)緩慢甚至腐爛死亡，絲藻則主要是爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)和附著基影響長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的生長(zhǎng)，這些雜藻抗逆性很強(qiáng)不易清除［15］。傳統(tǒng)方法通過(guò)人工清除費(fèi)時(shí)費(fèi)力，也有用二氧化鍺抑制硅藻的生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)光照控制絲藻繁殖和套養(yǎng)小型草食性海洋動(dòng)物控制絲藻等方法［13，17，18］，張艷楠等［19］則用抗生素對(duì)黑褐病致病菌溶藻弧菌等細(xì)菌性病害進(jìn)行防除，以上這些方法繁瑣、效果有限，二氧化鍺有殘毒且成本較高，并且不適用于生產(chǎn)。

水體中的pH 決定著碳酸平衡體系的CO2、HCO3-、CO32-之間的比例相關(guān)，藻類繁殖光合作用吸收 CO2使水體 pH 上升，呼吸作用釋放 CO2使 pH 下降，不同藻類對(duì)pH 的適應(yīng)性不同［20］。水體中的各種有機(jī)、無(wú)機(jī)物質(zhì)的存在和轉(zhuǎn)化，都與氧化還原反應(yīng)有關(guān)，氧化還原電位影響著水體中的硝化與反硝化作用和磷的釋放，決定著水體的富營(yíng)養(yǎng)化程度，而水體的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)變化直接影響了微藻的生長(zhǎng)和種群結(jié)構(gòu)演變［21-23］。因此，本研究在工廠化養(yǎng)殖長(zhǎng)莖葡萄蕨藻水體中裝置pH 計(jì)和氧化還原電位測(cè)定儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)水體pH 和Eh，觀察微藻群落結(jié)構(gòu)變化并分析其關(guān)聯(lián)性，通過(guò)監(jiān)測(cè)水體的pH 和Eh 預(yù)示污損微藻群落結(jié)構(gòu)變化，改良水質(zhì)抑制污損微藻的繁殖，為長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的健康養(yǎng)殖提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料長(zhǎng)莖葡萄蕨藻購(gòu)自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗(yàn)基地。取色澤鮮艷、無(wú)腐爛、生長(zhǎng)旺盛的植株，用消毒海水清洗除去雜質(zhì)，在解剖鏡下挑選干凈的藻體，暫養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱中，備用。培養(yǎng)箱設(shè)定溫度為24 ℃，光照度2 000 lx，光照周期為12 h∶12 h。培養(yǎng)液為添加NaNO3和KH2PO4至濃度分別為15 mg/L 和1.5 mg/L 的高壓消毒天然海水，鹽度為32‰。

1.2 試驗(yàn)設(shè)施

1.2.1 養(yǎng)殖水池 養(yǎng)殖水池用玻璃材料粘貼成水族箱形狀，分上下兩部分。上部分為養(yǎng)殖池，規(guī)格為200 cm×40 cm×35 cm，在水面上方10～30 cm 處安裝LED 燈，測(cè)定水面處的光照度，調(diào)整光源距離使水面處的光照度為6 000 lx，保持水深30 cm 恒定不變，在池的尾端離底板30 cm 處開(kāi)一個(gè)溢洪排水口，用水管連接至下池過(guò)濾框上；下部分為水處理池，分為過(guò)濾池、充氣池和抽水池三部分互相連通，過(guò)濾池上方安放塑料框，用濾棉布過(guò)濾，充氣池底部安放多個(gè)開(kāi)孔的充氣管，抽水池安裝水泵，把水抽至上部養(yǎng)殖池進(jìn)水口，下池安裝浮球控制水位，用過(guò)濾自來(lái)水自動(dòng)補(bǔ)充蒸發(fā)水分，安裝pH 計(jì)和氧化還原電位儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)pH 和Eh（圖1）。養(yǎng)殖池安裝于室內(nèi)，將空調(diào)溫度設(shè)置為25 ℃。

1.2.2 附著基 夾苗板用塑料水管連接成43 cm×23 cm 的長(zhǎng)方形框架，上下2 層封聚乙烯網(wǎng)，上層網(wǎng)孔徑為1.0 cm，下層網(wǎng)孔徑為0.3 cm，苗種夾于2 層網(wǎng)中間，框架下方裝5 cm 高墊腳，使苗種與底部保持間隔空間（圖1）。

圖1 養(yǎng)殖水池、水質(zhì)監(jiān)測(cè)儀和夾苗板

1.2.3 養(yǎng)殖用水 養(yǎng)殖用水為經(jīng)過(guò)砂濾和過(guò)濾棉2級(jí)過(guò)濾的天然海水，水質(zhì)指標(biāo)符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)（GB 11607—1989）》和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《無(wú)公害食品海水養(yǎng)殖用水水質(zhì)（NY 5052—2001）》的要求，鹽度為 34‰，添加濃度為 15 mg/L 的 NaNO3和1.5 mg/L 的KH2PO4作為氮、磷營(yíng)養(yǎng)。養(yǎng)殖用水循環(huán)使用，蒸發(fā)水分用過(guò)濾自來(lái)水補(bǔ)充。

1.3 方法

1.3.1 掛板試驗(yàn) 取厚度約2 mm 的PVC 塑料板材，裁剪規(guī)格為2 cm×2 cm 的正方形塑料板45 塊，平鋪固定于無(wú)種苗的空白夾苗板上面，與其他夾苗板同時(shí)投放于養(yǎng)殖池中并置于中間位置。

1.3.2 取樣檢測(cè) 養(yǎng)殖開(kāi)始后至第90 天，每隔10 d小心提取試驗(yàn)板5 塊，分別于夾苗板的四周和中間位置，同時(shí)記錄pH 和Eh。用刮刀刮取表面附著藻類，5 塊樣板樣品合并處理，用去離子水清洗干凈后一并置于容量瓶中，加去離子水至刻度，容量瓶大小視藻類密度選擇，充分震搖使藻類分散均勻。樣品在光學(xué)顯微鏡下參照金德祥等［24］、夏邦美［25］和錢樹(shù)本等［26］的方法進(jìn)行種類鑒定，采用0.1 mL 浮游生物計(jì)數(shù)框在光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，重復(fù)3 次，取平均值。優(yōu)勢(shì)度采用公式Y(jié)=（ni/N）×fi計(jì)算，式中，ni為i物種的個(gè)體數(shù)，N為群落樣本個(gè)體總數(shù)，fi為該物種出現(xiàn)的頻率。個(gè)體總量占10%以上為優(yōu)勢(shì)種，占1%～10%為常見(jiàn)種，1%以下為稀有種。

1.3.3 相關(guān)性分析 經(jīng)過(guò)顯微種類鑒定和計(jì)數(shù)結(jié)果，按照污損微藻分類合并優(yōu)勢(shì)度，采用Microsoft Excel 2007 軟件分析pH 和Eh 與微藻種群優(yōu)勢(shì)度的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH 和 Eh 隨時(shí)間的變化

2019 年7—10 月，從試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)觀察安裝于養(yǎng)殖水池中的pH 計(jì)和氧化還原電位儀，記錄初始pH和氧化還原電位，以后每隔10 d 記錄1 次數(shù)據(jù)至第90 天為止（表1）。從表1 可以看出，在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖后的前50 d pH 明顯呈上升趨勢(shì)，后40 d 趨于穩(wěn)定，變化不大。Eh 則在90 d 內(nèi)一直呈上升趨勢(shì)。這可能是前期隨著長(zhǎng)莖葡萄蕨藻生物量的增長(zhǎng)和其他藻類植物的繁殖，藻類光合作用快速消耗水中的CO2，破壞水體碳酸平衡體系，使pH 上升，后期因?yàn)閜H 的升高使其接近 pH 補(bǔ)償點(diǎn)而上升不明顯［27］，而光合作用釋放的O2使水中的還原性物質(zhì)轉(zhuǎn)化成氧化態(tài)，氧化還原電位逐步上升。

表1 pH 和Eh 隨時(shí)間的變化

2.2 附著藻類及優(yōu)勢(shì)種群分析

2019 年 7—10 月，從養(yǎng)殖試驗(yàn)開(kāi)始至第 90 天，每天觀察長(zhǎng)莖葡萄蕨藻生長(zhǎng)及藻體污染情況，20 d后肉眼能見(jiàn)到硅藻附著于藻體的假根和匍匐枝，60 d 后開(kāi)始見(jiàn)到絲狀藍(lán)藻生長(zhǎng)，后期長(zhǎng)滿整個(gè)夾苗板（圖2）。

圖2 污損微藻附著

每隔10 d 提取試驗(yàn)掛板5 塊收集附著藻類，樣品混合后用去離子水稀釋至容量瓶刻度，在顯微鏡下鑒定種類并計(jì)數(shù)，記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算并分析各種類優(yōu)勢(shì)度。經(jīng)過(guò)9 批次鏡檢共檢出硅藻4 屬4 種，分別是線性雙眉藻（Amphora lineata）、舟形藻（Naviculasp.）、雙壁藻（Diploneis aspera）和長(zhǎng)菱形藻（Nitzschia longissima）；檢出藍(lán)藻4 屬 4 種，分別是水生集胞藻（Synechocystis aquatilis）、絲狀鞘絲藻（Lyngbya confervoides）、龐氏顫藻（Oscillatoria bonnemaisonii）、海生螺旋藻（Spirulina subsalsa）（表2）。

從表2 可以看出，長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖前期污損微藻以硅藻種群（線性雙眉藻、舟形藻、雙壁藻、長(zhǎng)菱形藻）為主，后期則以藍(lán)藻（水生集胞藻、絲狀鞘絲藻、龐氏顫藻、海生螺旋藻，其中水生集胞藻為單細(xì)胞藍(lán)藻，其他3 種為絲狀藍(lán)藻）為主，除了長(zhǎng)菱形藻以外，其他種類均在不同時(shí)間成為優(yōu)勢(shì)種群（圖3），前30 d 僅有硅藻附著，后30 d 僅有少量線性雙眉藻和舟形藻，絲狀鞘絲藻、龐氏顫藻、海生螺旋藻3 種絲狀藍(lán)藻為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)種群，水生集胞藻在50～60 d的過(guò)渡期間成為優(yōu)勢(shì)種。

圖3 污損微藻優(yōu)勢(shì)種

表2 各采樣時(shí)間污損微藻群落主要種類及其優(yōu)勢(shì)度

2.3 pH 和Eh 與種群優(yōu)勢(shì)度的相關(guān)性

將8 種污損微藻歸并成硅藻門（Bacillariophyta）和藍(lán)藻門（Cyanophyta），合并其優(yōu)勢(shì)度（表3），采用Microsoft Excel 2007 軟件分析 pH 和Eh 與微藻種群優(yōu)勢(shì)度的相關(guān)性。結(jié)果表明，pH 與藍(lán)藻和硅藻優(yōu)勢(shì)度的相關(guān)系數(shù)（r）分別為 0.769 和-0.769，Eh 與藍(lán)藻和硅藻優(yōu)勢(shì)度的相關(guān)系數(shù)分別為0.876 和-0.876。

表3 pH 和Eh 及藍(lán)藻門、硅藻門優(yōu)勢(shì)度

分析結(jié)果表明，pH 和Eh 與污損藍(lán)藻門種群優(yōu)勢(shì)度呈正相關(guān)，與硅藻門呈負(fù)相關(guān)。水體酸堿度和氧化還原電位較低時(shí)適合于硅藻類的生長(zhǎng)繁殖，較高時(shí)則適合藍(lán)藻類生長(zhǎng)，pH 和Eh 與污損微藻種群結(jié)構(gòu)具有顯著相關(guān)性。

3 討論

當(dāng)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻夾苗板和試驗(yàn)掛板浸入海水后，蛋白質(zhì)和多糖等大分子物質(zhì)及一些無(wú)機(jī)化合物通過(guò)范德華力、氫鍵和靜電等相互作用沉集在其表面構(gòu)成基膜；然后細(xì)菌、真菌和硅藻等微小生物聚集在基膜上，通過(guò)胞外大分子物質(zhì)與基膜黏結(jié)形成生物膜，藻類具有較大的生物量，是生物膜中重要的組成部分［28］；之后隨著其他生物的附著種類和個(gè)體數(shù)不斷增多，群落演替使密度大、生長(zhǎng)迅速的物種成為污損生物的優(yōu)勢(shì)種，經(jīng)過(guò)優(yōu)勝劣汰優(yōu)勢(shì)種充分生長(zhǎng)，群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定［29］。本試驗(yàn)長(zhǎng)莖葡萄蕨藻工廠化養(yǎng)殖的水體與外界隔離，污損生物種類簡(jiǎn)單，群落變化僅在硅藻和藍(lán)藻之間演變，最終以絲狀藍(lán)藻為優(yōu)勢(shì)物種，進(jìn)而形成穩(wěn)定的群落結(jié)構(gòu)。

試驗(yàn)早期，水體在弱堿性和還原狀態(tài)下，內(nèi)源性磷不斷輸入水中，磷酸鹽PO43-濃度和亞鐵離子Fe2+濃度升高［23］，在氮素營(yíng)養(yǎng)占比相對(duì)較高的情況下，硅藻快速生長(zhǎng)，生物量不斷增多，其光合作用大量吸收水體中的CO2和有機(jī)酸使pH 上升，釋放O2使氧化還原電位上升，至試驗(yàn)中后期，pH 接近9.0，水體轉(zhuǎn)變成氧化態(tài)，氮磷營(yíng)養(yǎng)比發(fā)生變化，水體污染程度較大，污損微藻優(yōu)勢(shì)種由硅藻類轉(zhuǎn)變成藍(lán)藻類［30，31］。

4 小結(jié)

種群結(jié)構(gòu)變化結(jié)果與pH 和Eh 變化分析表明，pH 和Eh 與污損藍(lán)藻門種群優(yōu)勢(shì)度呈正相關(guān)，與硅藻門呈負(fù)相關(guān)，水體酸堿度和氧化還原電位較低時(shí)適合于硅藻類的生長(zhǎng)繁殖，較高時(shí)則適合藍(lán)藻類生長(zhǎng)，pH 和Eh 與污損微藻種群結(jié)構(gòu)具有顯著相關(guān)性。因此，在長(zhǎng)莖葡萄蕨藻養(yǎng)殖過(guò)程中，通過(guò)監(jiān)測(cè)pH 和Eh 分析預(yù)測(cè)污損微藻群落結(jié)構(gòu)變化情況，調(diào)節(jié)水質(zhì)防控污損微藻，有利于長(zhǎng)莖葡萄蕨藻的健康養(yǎng)殖。