楊國(guó)尚，阮 黎，華 興

(1.暨南大學(xué)，廣東 廣州 510000；2.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院 暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬?gòu)V州紅十字會(huì)醫(yī)院泌尿外科，廣東 廣州 510000；3.廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院病理科，廣東 廣州 510000)

維生素D受體(VDR)是維生素D主要生理功能的載體，可通過(guò)表達(dá)與核激活決定維生素D 的功能,其基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有FokⅠ、BsmⅠ、ApaⅠ、TaqⅠ等單核苷酸多態(tài)性(SNP)[1]。目前發(fā)現(xiàn)VDR基因的多態(tài)性與人類幾種疾病相關(guān)[1]。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)VDR基因FokⅠ位點(diǎn)SNP與前列腺增生(BPH)合并組織學(xué)前列腺炎(HP)有相關(guān)性，而HP的發(fā)生與BPH臨床進(jìn)展關(guān)系密切[2]。張亞群等[3]研究發(fā)現(xiàn)核因子(NF-κB)作為能特異性與免疫球蛋白結(jié)合的一種核蛋白，其表達(dá)與組織學(xué)前列腺炎密切相關(guān)。本課題主要研究VDR基因FokⅠ位點(diǎn)SNP與BPH組織中NF-κB表達(dá)的相關(guān)性，分析NF-κB信號(hào)通路是否在VDR基因SNP與BPH臨床進(jìn)展之間發(fā)揮作用，從而指導(dǎo)進(jìn)一步的研究方向。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取2015年1月～2019年12月在我院行手術(shù)治療的BPH患者511例，通過(guò)經(jīng)尿道前列腺電切(TURP)獲得所有患者前列腺標(biāo)本。所有標(biāo)本病理結(jié)果均由兩位病理醫(yī)師確診。按照VDR基因SNP基因型分為三組：FF組120例，F(xiàn)f組225例，ff組166例。三組患者年齡分別為(68.1±4.6)歲、(69.3±3.5)歲、(70.2±2.9)歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。FF組、Ff組、ff組PSA值分別為(1.9±1.6)ng/ml、(2.1±1.8)ng/ml、(2.3±0.7)ng/ml,三組患者對(duì)應(yīng)的前列腺體積分別為(43.1±7.6)ml、(48.2±1.6)ml、(45.2±3.6)ml，三組患者PSA值和前列腺體積比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)本研究，患者均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1DNA的提?。撼槿⊙芯繉?duì)象2 ml靜脈血,加入抗凝管(含EDTA)，用TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒(廣州魯誠(chéng))提取目標(biāo)基因組。

1.2.2PCR擴(kuò)增：通過(guò)GenBank檢索到VDR的基因序列。廣州魯城公司利用Genefisher完成引物設(shè)計(jì)：上游序列5’ACTGACTCTGGCTCTGAC3’；下游序列5’ CACCTTGCTTCTTCTCCC 3’。對(duì)含有起始密碼FokⅠ的DNA相關(guān)片段進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期的產(chǎn)物片段為246 bp。PCR反應(yīng)體系:0.7 μl Taq DNA聚合酶、2 μl模板DNA 、2 μl dNTPs、 8 μl上下游引物和相應(yīng)的緩沖液，反應(yīng)總體積為50μl。反應(yīng)條件為:預(yù)變性96 ℃ 8 min， 94 ℃ 45 s，52 ℃ 60 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。72 ℃延伸10 min。

1.2.3分析多態(tài)性基因型分析：PCR擴(kuò)張目標(biāo)多態(tài)性位點(diǎn)。10 μl PCR產(chǎn)物、10×buffer 1 μl、DNA 7.5 μl、牛血清白蛋白1 μl、FokⅠ限制性內(nèi)切酶(廣州魯誠(chéng))0.5 μl組成總反應(yīng)體20 μl系，保持37 ℃過(guò)夜，自動(dòng)凝膠成像儀對(duì)2%的瓊脂糖凝膠電泳酶切產(chǎn)物成像，檢測(cè)基因型。

1.2.4NF-κB的表達(dá)：采用免疫組化SP法。將所有前列腺手術(shù)標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，脫蠟，梯度酒精水化。水化后的切片用PBS(pH7.4)沖洗3次，加入0.01 mmol/L檸檬酸緩沖液(pH6.0)進(jìn)行抗原修復(fù)。每張切片滴加50 μl 3%過(guò)氧化氫溶液，37 ℃恒溫箱孵育10 min，去除PBS，然后加山羊血清封閉。每張切片滴加50 μl NF-κB一抗(濃度為1∶1 000)后放置于4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗，去除PBS后加入二抗，37 ℃恒溫箱孵育15 min，PBS沖洗，去除PBS液后，向每張切片滴加50 μl新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液，然后用蘇木素復(fù)染2 min，0.1%鹽酸溶液分化，依次予蒸餾水、PBS沖洗。梯度酒精脫水干燥后，中性樹膠封片，最后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。陰性對(duì)照部分采用PBS代替一抗。

1.2.5NF-κB的結(jié)果判定：觀察著色細(xì)胞的染色強(qiáng)度和所占比率，兩者相乘的積作為總分。NF-κB蛋白的陽(yáng)性表達(dá)大多數(shù)位于細(xì)胞核，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：①0分為無(wú)色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為褐色及黑色；②陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占比率≤10%為1分，所占比率11%～50%為2分，所占比率51%～75%為3分，所占比率>75%為4分。兩種積分相乘，總分<3分為陰性，≥3為陽(yáng)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS19.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間計(jì)數(shù)資料以率(%)比較，采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1VDR基因FokⅠ位點(diǎn)SNP基因型的PCR-RFLP分析：目的片段產(chǎn)物經(jīng)FokⅠ 酶切后，檢測(cè)到3種基因型：①等位基因上存在兩個(gè)酶切位點(diǎn)的ff基因型，電泳顯示199 bp和59 bp 2條帶；②沒(méi)有酶切位點(diǎn)的FF基因型，電泳顯示246 bp 1條帶；③有一個(gè)酶切位點(diǎn)的Ff基因型，電泳顯示246、199和59 bp三條帶。見(jiàn)圖1。

注：1為未酶切；2為Ff基因型；3為ff基因型；4為FF基因型

2.2NF-κB的表達(dá)：見(jiàn)圖2。

NF-κB陽(yáng)性 NF-κB陰性

2.3VDR基因FokⅠ位點(diǎn)基因型的分布：入組人群的FokⅠ位點(diǎn)等位基因頻率分布符合Hardy-Weinberg定律，說(shuō)明該人群資料具有遺傳代表性，可進(jìn)一步研究和分析。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 入組人群FokⅠ位點(diǎn)基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)

2.4三組基因型患者中NF-κB表達(dá)具有差異性：FF、Ff以及ff基因型以及等位基因F和f在NF-κB表達(dá)陽(yáng)性與陰性之間的分布情況。見(jiàn)表2。

表2 NF-κB人群中FokⅠ基因型分布的差異性[n(%)]

3 討論

BPH是由許多生理癥狀組成的復(fù)雜疾病。現(xiàn)BPH被證明可能具有遺傳性[4],但其遺傳基礎(chǔ)可能由多個(gè)遺傳小效應(yīng)組成[5]。深入研究單核苷酸多態(tài)性(SNP)有助于闡明上述問(wèn)題。有關(guān)于單核苷酸多態(tài)性(SNP)與BPH發(fā)病機(jī)制研究中， Na 等[4]通過(guò)對(duì)不同人群的關(guān)聯(lián)性研究，認(rèn)為GATA3位點(diǎn)附近的SNP(rs17144046)對(duì)BPH 和LUTS的遺傳及病因起作用。目前發(fā)現(xiàn)部分具有與腫瘤相關(guān)性的基因位點(diǎn)對(duì)BPH的發(fā)病也可能起重要作用，如HOTAIR(HOX 轉(zhuǎn)錄反義RNA)[6]與INK4基因的多態(tài)性位點(diǎn)rs10757278、rs4977574和rs1333048[7]。另外RANBP3L 的 rs16902947中等位基因“G”被發(fā)現(xiàn)是發(fā)生BPH 的風(fēng)險(xiǎn)等位基因[8]。也有學(xué)者通過(guò)研究認(rèn)為Ⅲ型5α-還原酶基因SRD5A3中的AC短重復(fù)序列與BPH的臨床進(jìn)展有相關(guān)性[9]。在一項(xiàng)針對(duì)類固醇通路中多達(dá)90個(gè)位點(diǎn)的SNP 研究中發(fā)現(xiàn)，ESR1、ESR2、HSD17B2、CYP19A1 等SNP位點(diǎn)顯示了其在BPH 發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的相關(guān)作用[10]。據(jù)報(bào)道，環(huán)氧酶-2 (COX-2 )上的rs2745557 位點(diǎn)與BPH的發(fā)生有一定相關(guān)性，且與吸煙、糖尿病、肥胖共存導(dǎo)致BPH發(fā)展[11]。此外，高脂飲食誘導(dǎo)下的BPH，STAT3和NF-κB的細(xì)胞質(zhì)表達(dá)增加[12]。目前約50%患有BPH的患者合并代謝綜合征(MetS)，而雌激素的CYP19A1、rs700518的TT基因型被證明是MetS-BPH的危險(xiǎn)因素[13]。隨著研究的深入，SRD5A1 、SRD5A2 基因的SNP與BPH臨床特征顯著相關(guān)[14]。表皮生長(zhǎng)因子(EGF)基因rs11568943、rs11569017位點(diǎn)SNP與前列腺體積變化有一定關(guān)系[15]。SRD5A1基因中rs166050、SRD5A2基因的rs523349和rs612224與BPH治療效果具有相關(guān)性[14]，細(xì)胞色素P450酶系中的CYP2D6 位點(diǎn)影響坦索羅辛藥代動(dòng)力學(xué)[16]，對(duì)臨床治療也起重要指導(dǎo)作用。

目前關(guān)于VDR基因SNP導(dǎo)致BPH臨床進(jìn)展相關(guān)信號(hào)通路的研究較少。前期研究發(fā)現(xiàn)VDR基因FokⅠ位點(diǎn)SNP與BPH的臨床進(jìn)展有相關(guān)性[17]，為了分析該SNP導(dǎo)致BPH發(fā)生臨床進(jìn)展的具體分子生物學(xué)機(jī)制，本文進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。通過(guò)PCR-RFLP技術(shù)，發(fā)現(xiàn)前列腺組織中VDR基因啟動(dòng)子上的FokⅠ基因SNP與NF-κB表達(dá)的有相關(guān)性。改變VDR基因的FokⅠ的結(jié)構(gòu)，會(huì)影響基因的表達(dá)及其生物學(xué)特性。NF-κB作為一種氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)氧化刺激，參與炎性反應(yīng)和腫瘤的發(fā)生發(fā)展等過(guò)程[12]。有研究表明BPH組織中NF-κB呈高表達(dá)狀態(tài)[18]，清濁湯[18]、吡格列酮[19]等藥物均可抑制NF-κB活性。結(jié)合本課題前期相關(guān)研究，認(rèn)為VDR 基因SNP及NF-κB信號(hào)通路可能是BPH臨床進(jìn)展的其中機(jī)制之一。本課題研究結(jié)果提示NF-κB可能是VDR基因SNP導(dǎo)致BPH臨床進(jìn)展信號(hào)通路介質(zhì)，需要進(jìn)行進(jìn)一步的分析信號(hào)通路相關(guān)的機(jī)制，從而尋找準(zhǔn)確的信號(hào)通路，為研究BPH的臨床進(jìn)展提供依據(jù)。