張洪波,張 輝,黃 銘,陳 星，李 果

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科，武漢 430030）

根據(jù)《醫(yī)學實驗室質(zhì)量和能力認可準則》質(zhì)量要求（簡稱ISO15189）[1-2]，實驗室需要每年兩次對尿液化學試紙分析儀進行設(shè)備校準，就像尿沉渣分析儀一樣，以符合中國合格評定國家認可委員會(China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）的要求[3]。校準完成后，需要進行校準驗證，通常校準由授權(quán)的主管工程師進行，實驗室人員可以完成校準驗證。針對尿干化學分析儀而言，因其為定性導致其校準存在著一定的盲區(qū)，細節(jié)上也不符合質(zhì)量體系的要求，迫切需要尿干化學分析儀由定性向定量方向發(fā)展，因此以本文此前一篇紅細胞和反射率的研究為基礎(chǔ)，驗證了白細胞計數(shù)(WBC 計數(shù))與其反射率之間的關(guān)系，解析出其定量關(guān)系曲線，逐步驗證了尿干化學分析儀定量的可行性，從而有助于優(yōu)化尿干化學分析儀的校準流程，也為尿干化學分析儀各指標定量化進程奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗標本 UF1000i 尿沉渣分析儀白細胞計數(shù)＞1 000/μl，配以人工鏡檢確認，無上皮細胞，無結(jié)晶黏液絲干擾，其它結(jié)果無異常的尿標本。

1.2 儀器和試劑 UF1000i 尿沉渣分析儀（日本）及其原裝配套試劑；西門子Clinitek Atlas 自動尿液化學分析儀（ 德國 ）及其配套試劑，室內(nèi)質(zhì)控采用伯樂的尿干化學質(zhì)控品。湖北省室間質(zhì)評、衛(wèi)生部室間質(zhì)評、以及2020年進行的美國病理學家協(xié)會(CAP)質(zhì)量評價結(jié)果合格。

1.3 方法

1.3.1 獲得合格的尿標本，在200×g 離心5 min，輕輕吸棄上清尿液，加入生理鹽水洗滌，再在200×g 離心5 min，輕輕吸棄上清液，再加入生理鹽水，再離心棄上清，反復3 次。

1.3.2 將洗滌好的標本加生理鹽水配制成10 ml 的樣本備用，樣本分別在Clinitek Atlas 自動尿液化學分析儀和UF1000i 尿沉渣分析儀上檢測，然后補足生理鹽水至10 ml，再檢測，重復上述過程，直至尿干化學檢測白細胞脂酶（Leucocyte 1lipase, LEU）為陰性為止。尿干化學分析儀完成一次檢測需要0.6 ml 樣本，尿沉渣分析儀完成一次檢測需要0.8 ml樣本，即對樣本進行等比稀釋（q=0.86）的連續(xù)檢測。1.3.3 配制好的標本需要在1h 內(nèi)完成標本的檢測[4-5]，記錄干化學白細胞反射率的值和尿沉渣對應(yīng)的白細胞計數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計學分析 通過GraphPadPrism8 統(tǒng)計分析程序確定白細胞計數(shù)與反射率之間的關(guān)系，并通過KAPPA 檢驗確定WBC 定性分級的反射率臨界點(即陰性、微量和1+，2+，3+對應(yīng)的反射率臨界值）。

2 結(jié)果

圖1 白細胞計數(shù)和反射率關(guān)系曲線圖

2.1 建立白細胞計數(shù)和反射率關(guān)系曲線 見圖1。按1.3 方法構(gòu)建白細胞計數(shù)(X)和反射率(Y)之間的關(guān)系。在上述分析的同時，對原始尿液樣本進行Wright-Giemsa 染色后進行分類。在這份尿液標本中，中性粒細胞占白細胞總數(shù)的86%，淋巴細胞占5%，單核細胞占9%。由于UF1000i 檢測的是所有的白細胞，而干化學檢測的僅為中性粒細胞，所以對上述曲線進行了修正，修正后的關(guān)系曲線為：Y=109.14ln(X)+931.94。

2.2 定性等級的反射率臨界點驗證 見表1。與Clinitek Atlas 自動尿液化學分析儀的濃度等級（陰性、微量、1+，2+，3+）相對應(yīng)的反射率臨界點取決于儀器的設(shè)定，此處我們只能通過驗證的方式來獲取實際的濃度等級反射率臨界點。為此我們選擇了8 例患者標本，共計測試187 條有效數(shù)據(jù)點，并結(jié)合Kappa 檢驗，確定各等級的臨界反射率。

表1 臨界點反射率及Kappa 值統(tǒng)計表

2.3 基于反射率的白細胞臨界點驗證 見表2。通過將臨界反射率值代入白細胞計數(shù)與反射率的關(guān)系曲線（即3.1 節(jié)得到的關(guān)系曲線），可以得到白細胞臨界點的驗證濃度。

表2 反射率對應(yīng)的白細胞濃度（個/μl）

3 討論

3.1 選擇標本 本實驗在白細胞的制備上未能延續(xù)此前對紅細胞進行驗證時采用的梯度濃度的方法[6]，是因為在對白細胞進行鹽水洗滌時，細胞丟失不容易控制。因此，改進采用了洗滌后等比稀釋的模式。也就是說，對于10ml 制備好的標本，完成尿干化學檢測需要0.6ml，尿沉渣檢測需要0.8ml，共計1.4 ml，一次檢測完成剩余8.6 ml，再補足生理鹽水至10ml，進行下一次檢測，即整個過程采取以q=0.86 的等比稀釋模式。

同時，在選擇尿白細胞計數(shù)大于1 000/μl 的標本時，瑞氏-吉姆薩染色鏡檢排除因退變或巨噬細胞較多時對中性脂酶檢測的影響，基于此門診標本更合適，因為門診標本急性感染的可能性較大，白細胞在尿路中停留時間相對較短，使溶解和變性的可能性降低。所以此次標本主要來源于門診證實的尿路感染，但同時細菌感染也要被去除，特別是高上皮細胞標本[7]，以排除上皮細胞的干擾。

在對白細胞進行離心洗滌時，應(yīng)采取低速離心（實際將離心力由400g 降為200g），以排除因高速離心對白細胞進行解聚洗滌時造成的白細胞破裂導致脂酶釋放（即離心力越高，解聚難度越大），整個過程對標本的處理要輕，以避免白細胞被破壞導致中性脂肪酶溢出進而影響尿液化學分析儀的檢測。

事實上，我們也使用過細胞分離方法來獲得高純度的中性粒細胞，如使用solarbio 和TBD 品牌的人外周血中性粒細胞分離液來分離全血細胞中的中性粒細胞，但有其局限性。分離成功率不高，相同的分離條件分離全血的重復性不好，研究發(fā)現(xiàn)可能與全血的紅細胞平均體積有關(guān)：平均紅細胞體積越大，離心力越大，其他條件不變時分層效果越好。此外，即使分離中性粒細胞，如一些論文報道，分離液可以顯著分層細胞[8-9]，卻沒有適當?shù)姆椒▽⒎蛛x層中的中性粒細胞有效的剝離（將中性粒細胞剝離出來又不帶淋巴細胞和單核細胞），因此本研究未采用全血白細胞分離法。

同時需要說明的是，此處用UF1000i 替代金標準的手工方法來計數(shù)白細胞，是因為UF1000i 尿沉渣分析儀的性能符合要求，同時其對白細胞計數(shù)相對手工方便快捷，最現(xiàn)實的問題是尿干化學搭配尿沉渣對尿液進行檢測符合日常實際工作流程[10-13]。

3.2 白細胞臨界值濃度的解釋 從表2 中，白細胞計數(shù)的臨界濃度驗證與操作手冊中給出的值之間存在差異。這就需要我們對尿液化學試紙分析儀的校準進行反思。對于UF1000i 尿沉渣分析儀，每6 個月對設(shè)備進行校準，在Clinitek Atlas 自動化尿液化學分析儀的報告中只給出了每個指標的校準范圍，沒有給出標準濃度白細胞對應(yīng)的反射率值。如Clinitek Atlas 自動尿液化學分析儀校準報告所示，白細胞的反射率相對較寬，范圍為949 ～1 088，根據(jù)此范圍計算出WBC 反射率的變異系數(shù)約為2%，而中華人民共和國行業(yè)標準YYT0475-2011 尿干化學分析儀第3.2 節(jié)描述的重復性表明，尿干化學分析儀反射率測試結(jié)果的變異系數(shù)，即CV值應(yīng)不大于1%[14-15]，從這個角度來講，此設(shè)備的校準報告是不符合要求的。而白細胞計數(shù)和反射率曲線的建立，構(gòu)建修正后的關(guān)系曲線為：Y=109.14ln(X)+931.94，此關(guān)系曲線從計算方法上雖與先前報道的不同[16]，但方向一致同為對數(shù)曲線，這將有助于尿干化學分析儀由定性向定量方向改進，再利用標準濃度的校準品對設(shè)備進行校準并能有力的彌補現(xiàn)行的尿干化學分析儀設(shè)備校準環(huán)節(jié)的不足。

3.3 尿干化學分析儀在定量開發(fā)中的優(yōu)勢

3.3.1 精細尿干化學分析儀的校準：尿液化學分析儀向定量轉(zhuǎn)化后，檢測值可由間斷型向連續(xù)型轉(zhuǎn)化，以此有效彌補目前尿液化學分析儀在校準過程中存在的不足，定量改進已有相關(guān)文獻報道[17]。同時設(shè)計出定量尿干化學分析儀的定值校準品對設(shè)備進行校準，猶如目前用定值校準品對UF1000i 進行校準一樣，可以更容易檢測設(shè)備單元老化等問題，從而更好地提醒工程師準確調(diào)整激光單元的相關(guān)參數(shù)，將設(shè)備的狀態(tài)調(diào)整至最佳。

3.3.2 定量研發(fā)的邊際成本低：針對各尿干化學制造商而言，目前所要做的工作只需要將尿十項(隱血、白細胞、亞硝酸鹽、比重、pH、蛋白質(zhì)、葡萄糖、酮體、尿膽原、膽紅素)的關(guān)系曲線或者說擬合曲線植入到設(shè)備中，再設(shè)計出相應(yīng)的可視化界面將各項目的檢測值呈現(xiàn)給客戶就好。尿干化學分析儀在近20年技術(shù)革新不明顯，不尋求改變在日新月異的今天有被市場淘汰的風險，現(xiàn)在設(shè)備生產(chǎn)商只需要對設(shè)備軟件進行適當調(diào)整，給用戶提供以反射率為基礎(chǔ)的定量服務(wù)，在幾乎不需要投入新的研發(fā)成本的基礎(chǔ)上就能給用戶新的價值的體驗。

3.3.3 臨床需求：定量改進能更準確地反映病人的病情，在對醫(yī)生對尿常規(guī)的關(guān)注度調(diào)查中，當問及“參考尿常規(guī)在你的疾病領(lǐng)域的診斷中所占的比例是多少？”時，參考比例僅在0 ～25%之間，根本原因可能是尿常規(guī)給臨床提供的信息太少，目前尿干化學結(jié)果全部陰性對臨床意義更顯著，也就是特異度作用更顯著。從這個角度來看，尿液化學分析儀從定性到定量的發(fā)展也符合臨床需要,以充分發(fā)揮尿干化學的作用[18]。舉一個簡單的例子，在白細胞定性結(jié)果同在3+時，如果做到了定量改進，定量結(jié)果更能反映出患者病情的細微變化。

3.3.4 更及時的報告：關(guān)于報告的時間有效性，門診患者尿干化學分析的TAT 時間（turn around time）為40 min，本實驗對應(yīng)的尿生化TAT 時間為3h。尿干化學分析的定量改進能將TAT 時間由3h縮短為40min。這對確診后治療監(jiān)測的患者是省時又經(jīng)濟的。

3.3.5 雙贏的局面：事實上按照3.3.3，設(shè)備制造商和用戶是雙贏的，設(shè)備制造商為用戶提供了一個可視化的定量界面，用戶可以以此為基礎(chǔ)在白細胞領(lǐng)域開發(fā)新的檢測指標，用反射率定量檢測白細胞中性脂肪酶濃度，結(jié)合尿沉渣分析儀白細胞計數(shù)，我們可以得到一個新的檢測指標：平均白細胞脂酶含量，這個指標將有助于尿路感染的診斷，因為從理論上，尿路感染會使更多的白細胞吞噬細菌自溶、中性脂酶釋放，同時有形白細胞減少，從而使平均白細胞脂酶含量的值增加。這一理論的證實取決于設(shè)備制造商對設(shè)備的定量改進。

基于上述，尿干化學分析儀應(yīng)在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上加以改進，逐步向定量方向發(fā)展，以適應(yīng)實驗室質(zhì)量體系發(fā)展的需要，以更好地為臨床服務(wù)。更重要的是，定量改進對設(shè)備商、用戶及患者都是有益的。