高智俊，周國(guó)平，鄭 嵐，肇翊同，王 迅，何智純（上海市血液中心,上海 200051）

室內(nèi)質(zhì)量控制（internal quality control, IQC）由實(shí)驗(yàn)室工作人員，采取一定的方法和步驟，連續(xù)評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室工作的可靠性程度，以監(jiān)控本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)工作的精密度，確定實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否可靠，可否發(fā)出報(bào)告的一項(xiàng)工作[1]。血液感染性疾病篩查的對(duì)象為健康獻(xiàn)血者，在缺乏病史和體征的情況下，更多依賴于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[2]，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果從健康獻(xiàn)血者中挑出疑似感染者，因此血液篩查需要實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果具有更高的穩(wěn)定性和可靠性。血液篩查的質(zhì)量控制是保證檢測(cè)結(jié)果可靠的有效手段[3]。然而，病毒標(biāo)記物檢測(cè)的血液篩查不同于一般的化學(xué)檢測(cè)，傳統(tǒng)的基于正態(tài)分布原理的質(zhì)控方法可能并不適合非正態(tài)分布的病毒標(biāo)記物檢測(cè)[3]。特別是核酸檢測(cè)的IQC 具有更多的復(fù)雜性，其IQC 方法一直是業(yè)內(nèi)討論的熱點(diǎn)。本文對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行了分析，以當(dāng)前所使用的室內(nèi)質(zhì)控方法作為標(biāo)準(zhǔn)，在判斷在控的檢測(cè)批次中再用兩種不同的IQC 方法進(jìn)行了分析，為探討合適的血液核酸檢測(cè)IQC 方法提供幫助。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)控品 本文使用兩種室內(nèi)質(zhì)控品。一種為本實(shí)驗(yàn)室在用質(zhì)控品產(chǎn)自北京康徹斯坦公司。用于羅氏核酸混樣檢測(cè)時(shí)，HBV DNA，HCV RNA，HIV RNA 濃度分別為 50 IU/ml，1 000 IU/ml，1 000 IU/ml；用于蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)時(shí)，HBV DNA，HCV RNA，HIV RNA 濃度分別為 50 IU/ml，50 IU/ml，200 IU/ml。另一種為澳大利亞國(guó)立血清學(xué)參比實(shí)驗(yàn)室（National serdogical Reference Laboratory,NRL）提供的QConnect 質(zhì)控品(評(píng)估的質(zhì)控品)，濃度分別為HBV DNA 50 IU/ml，HCV RNA 50 IU/ml，HIV RNA 250 IU/ml，羅氏核酸混樣檢測(cè)的質(zhì)控品為三種標(biāo)記混合在一起的多標(biāo)記樣品，本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)時(shí)與5 支陰性血漿混合。蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)的質(zhì)控品為單一標(biāo)記樣品。

1.2 儀器與試劑 本實(shí)驗(yàn)室主要采用Roche COBAS TaqScreen s201 MPX v2.0 聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法（簡(jiǎn)稱：羅氏）和Grifoles procleixTMTIGRIS Ultrio plus 轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(transcription-mediated amplification,TMA)方法（簡(jiǎn)稱：蓋立復(fù)）對(duì)血液感染性病毒進(jìn)行核酸檢測(cè)，本文數(shù)據(jù)均來(lái)自這兩種檢測(cè)系統(tǒng)。

1.3 方法 兩種質(zhì)控品與常規(guī)血液樣品一起進(jìn)行檢測(cè)。收集2019年1月14日～5月31日兩種質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果，將北京康徹斯坦質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果錄入Excel 表格，將澳大利亞QConnect 質(zhì)控品的檢測(cè)數(shù)據(jù)錄入EDCNet 軟件。

1.3.1 本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)室內(nèi)質(zhì)控方法：羅氏檢測(cè)系統(tǒng)每天采用混樣模式檢測(cè)一套室內(nèi)質(zhì)控品（1 支HBV DNA，1 支HCV RNA，1 支HIV RNA 陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品與3 支陰性室內(nèi)質(zhì)控品的混樣樣品），蓋立復(fù)檢測(cè)系統(tǒng)每個(gè)工作列表必須包含一套室內(nèi)質(zhì)控品，室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè)模式與檢測(cè)樣本一致。質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果在控的標(biāo)準(zhǔn)：陰性室內(nèi)質(zhì)控品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為內(nèi)標(biāo)有效的無(wú)反應(yīng)性，陽(yáng)性質(zhì)控品使用羅氏檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)Ct 值（cycle threshold value）須在30 ≤Ct 值＜40 范圍內(nèi)，使用蓋立復(fù)檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)S/CO 值(absorbance signal of sample/cutoff value)須在5 ＜S/CO 值≤25 范圍內(nèi)。

1.3.2 Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法：將日常血液核酸篩查IQC 結(jié)果作Levey-Jennings 圖，以在用批號(hào)的試劑和室內(nèi)質(zhì)控品前20 個(gè)點(diǎn)計(jì)算均數(shù)（x）和平均差（s），并在圖上劃出x，x±2s 和x±3s 質(zhì)控限，根據(jù)Westgard 多規(guī)則判斷當(dāng)批檢測(cè)是否在控。

1.3.3 NRL 質(zhì)控限法：在使用NRL 同一濃度新批號(hào)QConnect 室內(nèi)質(zhì)控品監(jiān)控核酸試驗(yàn)的有效性和穩(wěn)定性之前，采集來(lái)自全球30 個(gè)國(guó)家的約300 個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用該批號(hào)NRL QConnect 質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果計(jì)算NRL 質(zhì)控限[4]，以此來(lái)監(jiān)控以后的核酸試驗(yàn)的有效性和穩(wěn)定性。NRL 質(zhì)控限的計(jì)算方法參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]，計(jì)算時(shí)考慮了不同實(shí)驗(yàn)室間正常的檢測(cè)變異，也考慮了試劑批號(hào)之間的變異。鑒于NRL質(zhì)控限計(jì)算的數(shù)據(jù)來(lái)自國(guó)外核酸單人份檢測(cè)，因此，蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)方法可直接使用根據(jù)國(guó)外數(shù)據(jù)計(jì)算得出的NRL 質(zhì)控限，而國(guó)內(nèi)羅氏核酸混樣檢測(cè)方法不能直接使用NRL 質(zhì)控限，本文羅氏核酸混樣檢測(cè)方法 NRL 質(zhì)控限是根據(jù)同一研究階段本實(shí)驗(yàn)室、深圳市血液中心、大連市血液中心和山東省血液中心對(duì)QConnect 質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果重新計(jì)算而得。如果QConnect 質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果在NRL 質(zhì)控限范圍內(nèi)，則當(dāng)批檢測(cè)在控，否則為失控。

2 結(jié)果

2.1 本實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制情況 2019年1月14

日～5月31日期間應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室核酸室內(nèi)質(zhì)量控制方法，羅氏核酸混樣檢測(cè)康徹斯坦質(zhì)控品在控批次為122 批，失控批次為2 批，失控率1.64%；蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)康切斯坦質(zhì)控品，在控批次為275 批，失控批次為0 批，失控率0。在此期間，使用羅氏核酸混樣方法，檢測(cè)NRL QConnect 質(zhì)控品332 次，使用蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)方法檢測(cè)QConnect 質(zhì)控品183 次。

2.2 Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法在控和失控情況 見(jiàn)圖1 和圖2。使用羅氏核酸混樣方法檢測(cè)康徹斯坦HCV RNA 質(zhì)控品和使用蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)方法檢測(cè)康徹斯坦HIV RNA 質(zhì)控品的質(zhì)控圖?？梢?jiàn)在根據(jù)日常質(zhì)控規(guī)則判斷為在控的檢驗(yàn)批次中，如果采用Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法判斷HCV RNA 質(zhì)控情況，又出現(xiàn)2 個(gè)13s失控和1 個(gè)10x失控，其中2 次超出+13s，提示弱陽(yáng)性質(zhì)控品的檢測(cè)值偏低；在蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)HIV RNA 質(zhì)控品中，又出現(xiàn)6 個(gè)13s失控和1 個(gè)22s失控，其中有5 個(gè)失控點(diǎn)低于-13s，表明弱陽(yáng)性質(zhì)控品的檢測(cè)值偏低。其他檢測(cè)項(xiàng)目的質(zhì)控圖基本與圖1 和圖2 類似。統(tǒng)計(jì)所有檢測(cè)項(xiàng)目的失控情況匯總見(jiàn)表1。

圖1 羅氏HCV RNA 檢測(cè)質(zhì)控圖

圖2 蓋立復(fù)HIV RNA 檢測(cè)質(zhì)控圖

表1 使用Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法判斷失控情況匯總

2.3 NRL 質(zhì)控限法在控和失控情況 使用NRL QConnect 質(zhì)控品，蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)，在本實(shí)驗(yàn)室核酸質(zhì)控方法判斷在控的檢測(cè)批次中，使用NRL 質(zhì)控限進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量IQC，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)失控情況；羅氏核酸混樣檢測(cè)，在本實(shí)驗(yàn)室核酸質(zhì)控方法判斷在控的檢測(cè)批次中，使用NRL 質(zhì)控限的計(jì)算方法，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)控限，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在HBV DNA 核酸檢測(cè)和HIV RNA 核酸檢測(cè)中各有1 個(gè)失控結(jié)果（0.30%）見(jiàn)表2。圖3 和圖4 分別為羅氏核酸混樣檢測(cè)HIV RNA 質(zhì)控品和蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)HCV RNA 質(zhì)控品的質(zhì)控結(jié)果，其他檢測(cè)項(xiàng)目與該結(jié)果相似。

3 討論

血液篩查感染性病毒核酸檢測(cè)作為一種定性檢測(cè)，其室內(nèi)質(zhì)量控制方法一直是業(yè)內(nèi)討論的熱點(diǎn)。目前各血站常用的室內(nèi)質(zhì)量控制技術(shù)有：①選擇2 ～5 倍檢測(cè)限濃度的質(zhì)控品作定性監(jiān)測(cè)；②以質(zhì)控品的Ct值作質(zhì)控圖，并以Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法判斷是否在控；③在定性監(jiān)測(cè)基礎(chǔ)上，設(shè)定一系列判定指標(biāo)，綜合分析核酸檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控。

表2 使用QConnect 質(zhì)控品，按NRL 質(zhì)控限方法進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控的結(jié)果

圖3 使用QConnect 質(zhì)控品按NRL 質(zhì)控限法進(jìn)行羅氏HIV RNA 室內(nèi)質(zhì)量控制

圖4 使用QConnect 質(zhì)控品按NRL 質(zhì)控限法進(jìn)行蓋立復(fù)HCV RNA 室內(nèi)質(zhì)量控制

第一種方法單獨(dú)使用時(shí)存在一定的缺陷，因?yàn)楹怂釞z測(cè)是單管獨(dú)立反應(yīng)，室內(nèi)質(zhì)控品的檢測(cè)情況并不能完全代表待檢樣品的真實(shí)反應(yīng)情況，簡(jiǎn)單的定性監(jiān)測(cè)不一定能發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室的系統(tǒng)偏差和大部分的隨機(jī)偏差。

第二種是以室內(nèi)質(zhì)量控制結(jié)果作Levey-Jennings 圖，加以Westgard 多規(guī)則質(zhì)控的方法在國(guó)內(nèi)一些血液篩查核酸實(shí)驗(yàn)室用以判斷檢測(cè)是否在控[4-6]。該方法雖然比單純定性監(jiān)測(cè)能提供更多的穩(wěn)定性和重復(fù)性信息，但由于樣本間的Ct值是指數(shù)關(guān)系，而不是線性關(guān)系，不能使用t檢驗(yàn)或方差分析等這些正態(tài)分布的方法對(duì)Ct值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[7-8]，因此，按Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法以Ct值作為指標(biāo)判斷PCR 檢測(cè)結(jié)果是否在控時(shí)，可能會(huì)造成許多“假失控”[9]。本研究結(jié)果表明，蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)方法出現(xiàn)假失控的概率會(huì)高于羅氏方法，這主要是因?yàn)樯w立復(fù)的轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增（transcription-mediated amplification, TMA）技術(shù)是一種終點(diǎn)檢測(cè)方法，其S/CO 值與樣品中的核酸濃度沒(méi)有相關(guān)性，因此Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法不適宜對(duì)TMA 的結(jié)果進(jìn)行分析。如果日常檢測(cè)中經(jīng)常出現(xiàn)“假失控”，實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)投入更多的精力去調(diào)查失控原因、復(fù)檢該批樣品、延遲報(bào)告發(fā)出時(shí)間，不僅會(huì)造成人、財(cái)、物和時(shí)間上的浪費(fèi)，時(shí)間久了還可能會(huì)讓實(shí)驗(yàn)室的員工對(duì)質(zhì)量控制工作失去信心。因此本文研究結(jié)果表明，Westgard 多規(guī)則質(zhì)控方法不適合用于目前國(guó)內(nèi)血篩核酸檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控。

第三種為在定性監(jiān)測(cè)基礎(chǔ)上，設(shè)定一系列判定指標(biāo)，綜合分析核酸檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控。本實(shí)驗(yàn)室自2011年起即開(kāi)始采用該方法對(duì)血篩核酸檢測(cè)進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)量控制。除了試劑盒自帶質(zhì)控符合系統(tǒng)設(shè)定的要求、第三方弱陽(yáng)性室內(nèi)質(zhì)控品的定性結(jié)果與預(yù)期相符以外，還對(duì)室內(nèi)質(zhì)控品的檢測(cè)值建立了在控范圍，同時(shí)還對(duì)日常檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。這樣的綜合判斷指標(biāo)來(lái)源于核酸擴(kuò)增的基本原理和本實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)方法性能驗(yàn)證數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)室日常監(jiān)測(cè)核酸混樣陽(yáng)性拆分反應(yīng)率、單人份反應(yīng)率、鑒別陽(yáng)性率、無(wú)效批次率及無(wú)效結(jié)果率等數(shù)據(jù)也為檢測(cè)結(jié)果的有效性提供必要的支持，也與最近發(fā)布的《血站血液檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量監(jiān)測(cè)指標(biāo)》（T/CSBT 004-2019）和《可經(jīng)輸血傳播感染病原體核酸篩查技術(shù)要求》（T/CSBT 008-2019）相符。因此本文以本實(shí)驗(yàn)室核酸檢測(cè)所用質(zhì)控限的室內(nèi)質(zhì)量控制方法是可行的。在符合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際運(yùn)行狀況下，既避免其他質(zhì)控方法帶來(lái)的假失控風(fēng)險(xiǎn)，又能及時(shí)發(fā)現(xiàn)檢測(cè)中的問(wèn)題，保證血液篩查質(zhì)量。

為了探討目前澳大利亞核酸室內(nèi)質(zhì)控技術(shù)在我國(guó)應(yīng)用的可行性，本文采用NRL 的QConnect 質(zhì)控品，并使用互聯(lián)網(wǎng)EDCNet 軟件分析其日常質(zhì)控的結(jié)果。在本實(shí)驗(yàn)室羅氏核酸常規(guī)質(zhì)控方法判斷在控的批次中，利用QConnect 質(zhì)控品及NRL 質(zhì)控限的方法進(jìn)行判斷，在HIV RNA 項(xiàng)目中發(fā)現(xiàn)1 個(gè)“失控”結(jié)果。這個(gè)“失控”結(jié)果也可能是“假失控”，主要是因?yàn)镼Connect 用于羅氏檢測(cè)方法的質(zhì)控品HIV RNA 濃度只有250 IU/ml，這一濃度在國(guó)外均用于單人份檢測(cè)，結(jié)果變異范圍較小，而在國(guó)內(nèi)開(kāi)展的混樣檢測(cè)中，該濃度相對(duì)偏低，結(jié)果變異范圍較大。因此，在研究中所使用QConnect 質(zhì)控品的濃度并不適合用于羅氏核酸混樣檢測(cè)。但根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的穩(wěn)定結(jié)果推測(cè)，如果提高該質(zhì)控品濃度，可以達(dá)到對(duì)其進(jìn)行室內(nèi)質(zhì)控的目的。在蓋立復(fù)核酸常規(guī)質(zhì)控方法判斷在控的批次中使用NRL 質(zhì)控限進(jìn)行判斷，未發(fā)現(xiàn)失控情況。表明當(dāng)前QConnect質(zhì)控品濃度配合NRL 質(zhì)控限方法，與本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)行質(zhì)控限的方法均適合用于蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控。

綜上所述，在選擇適宜濃度的質(zhì)控品情況下本實(shí)驗(yàn)室在用質(zhì)控限的方法與NRL 質(zhì)控限的方法均可用于羅氏核酸混樣檢測(cè)和蓋立復(fù)核酸單人份檢測(cè)的室內(nèi)質(zhì)控。