矯 巖，石 巖，韓文超，劉文東，王曉琴

(青島市市立醫(yī)院兒科，山東 青島 266000)

新生兒敗血癥是危重感染疾病之一，病原菌或條件致病菌感染后入血，并在血液中增殖，引起新生兒全身感染[1]。新生兒機(jī)體免疫球蛋白合成能力不足，免疫功能發(fā)育尚不完全，病原菌入血后呈爆發(fā)性進(jìn)展，且新生兒敗血癥前期癥狀隱匿，可能會(huì)造成臨床醫(yī)生誤判而延誤治療，造成新生兒出現(xiàn)多器官衰竭甚至死亡[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，影響機(jī)體生理病理進(jìn)程[3-4]，其在包括膿毒癥及敗血癥在內(nèi)的各炎癥性疾病中多有報(bào)道，如長(zhǎng)鏈非編碼RNA-腫瘤壞死因子相關(guān)異種核蛋白L(long non-coding RNA-tumor necrosis factor-related and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L-related immunoregulatory，lncRNA THRIL)對(duì)膿毒癥并發(fā)呼吸窘迫患者預(yù)后具有一定預(yù)測(cè)價(jià)值[5]。miR-21聯(lián)合降鈣素原(procalcitonin，PCT)對(duì)膿毒癥診斷和病情動(dòng)態(tài)變化都具有良好的預(yù)測(cè)價(jià)值[6]。但是目前l(fā)ncRNA和miRNA在新生兒敗血癥的作用如何還鮮有報(bào)道?；诖?，本研究探討lncRNA THRIL和miR-300在新生兒敗血癥患者的表達(dá)情況及與炎性因子的相關(guān)性，并探索兩者預(yù)測(cè)新生兒敗血癥預(yù)后的價(jià)值。

1資料與方法

1.1一般資料

將2016年6月至2021年9月青島市市立醫(yī)院收治的132例新生兒敗血癥患兒作為試驗(yàn)組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《新生兒敗血癥診斷及治療專家共識(shí)》中新生兒敗血癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cells，WBC)、PCT、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、血小板計(jì)數(shù)中兩項(xiàng)結(jié)果呈陽(yáng)性；②經(jīng)血培養(yǎng)顯示細(xì)菌感染；③日齡≤28d；④入院前未使用抗生素治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并遺傳代謝性疾病患兒；②合并免疫缺陷性疾病或嚴(yán)重血液系統(tǒng)傳染病患兒；③入院前使用抗生素或抗菌藥物治療患兒；④嚴(yán)重先天畸形，凝血功能異常者；⑤合并嚴(yán)重肝腎功能不全或先天心臟病患兒。另選擇同期住院的77例非敗血癥一般感染新生兒為對(duì)照組，兩組受試者監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

試驗(yàn)組患兒男60例，女72例；日齡1～28d，平均日齡(16.26±3.28)d；平均體重(3.89±1.29)kg。對(duì)照組患兒男41例，女36例；日齡1～28d，平均日齡(17.01±4.29)d；平均體重(3.92±1.32)kg。兩組患兒性別組成、年齡、體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 lncRNA THRIL和miR-300表達(dá)檢測(cè)

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time PCR，RT-PCR)檢測(cè)lncRNA THRIL和miR-300表達(dá)。兩組受試者入院時(shí)采集靜脈血5mL，3 000rpm離心15min(離心半徑10 cm)后抽取血清，采用TRIzol試劑盒(Sigma-Aldrich，美國(guó))抽提血清總RNA，瓊脂糖凝膠或分光光度計(jì)檢測(cè)其濃度及純度，對(duì)純度合格的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；取1μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA(miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，primescript RT reagent kit with gDNA Eraser試劑盒，Takara)和lnRcute lncRNA cDNA 鏈合成試劑盒(天根生物有限公司，中國(guó))反轉(zhuǎn)錄為cDNA；使用SYBR miRNA RT-PCR Kit(Takara，日本)和lnRcute lncRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒；RT-PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 5.0μL，PCR F Primer 0.2μL，PCR R Primer 0.2μL，cDNA模板2μL，ddH2O 2.6 μL。RT-PCR擴(kuò)增引物見表1，引物由上海生工設(shè)計(jì)合成，擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性15 min，(95℃ 30s，60℃ 35s)×35個(gè)循環(huán)；反應(yīng)完畢后，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用ABI700軟件分析，以GAPDH，U6為內(nèi)參按照2-△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 RT-PCR擴(kuò)增引物序列

1.3血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)炎性因子白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作(ELISA試劑盒購(gòu)自Abcam公司)；采用免疫色譜法檢測(cè)PCT，由HR201檢測(cè)儀分析；采用全自動(dòng)生化分析儀(Olympus公司)對(duì)新生兒血清進(jìn)行CRP和WBC檢測(cè)。

1.4預(yù)后及分組

根據(jù)患兒是否好轉(zhuǎn)分為預(yù)后良好組(n=91)和預(yù)后不良組(n=41)，預(yù)后良好組患兒敗血癥明顯好轉(zhuǎn)，WBC、PCT等血清學(xué)指標(biāo)恢復(fù)正常且無(wú)后遺癥；預(yù)后不良組患兒包括死亡、腦積水、支氣管肺發(fā)育不良等嚴(yán)重后遺癥。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1不同組受試者lncRNA THRIL和miR-300表達(dá)差異

對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，兩組數(shù)據(jù)均成正態(tài)分布(P>0.05)；試驗(yàn)組lncRNA THRIL表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2.32±0.53 vs 1.34±0.41，t=-8.283，P<0.001)；試驗(yàn)組miR-300表達(dá)量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.89±0.39 vs 1.28±0.30，t=-7.596，P<0.001)，見圖1。

圖1 不同組受試者lncRNA THRIL和miR-300表達(dá)差異

2.2兩組受試者血清學(xué)指標(biāo)差異

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組患兒血清WBC、PCT、CRP、IL-6、TNF-α水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t/Z值分別為-4.926、-28.327、-14.658、-15.451、-11.958，P<0.05)，見表2。

表2 兩組受試者血清學(xué)指標(biāo)差異

2.3 lncRNA THRIL、miR-300聯(lián)合PCT對(duì)新生兒敗血癥的早期診斷價(jià)值

采用ROC曲線評(píng)估lncRNA THRIL、miR-300、PCT對(duì)敗血癥患兒的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示三指標(biāo)聯(lián)合診斷的AUC最高，為0.975，敏感度、特異性分別為0.871、0.974，見表3、圖2。

表3 lncRNA THRIL、miR-300、PCT診斷敗血癥患兒的ROC曲線分析

圖2 lncRNA THRIL、miR-300、PCT診斷敗血癥的ROC曲線

2.4 lncRNA THRIL、miR-300與敗血癥血清學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性

采用Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)lncRNA THRIL和miR-300與敗血癥血清學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性，結(jié)果顯示lncRNA THRIL、miR-300與PCT、CRP、IL-6、TNF-α均呈正相關(guān)關(guān)系(r值介于0.269～0.441之間，P<0.05)，見表4。

表4 lncRNA THRIL和miR-300與敗血癥血清學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性

2.5 lncRNA THRIL、miR-300對(duì)敗血癥患兒的預(yù)后評(píng)估

繪制ROC曲線評(píng)估lncRNA THRIL和miR-300對(duì)敗血癥患兒預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示兩指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測(cè)AUC最高，為0.867，敏感度和特異性分別為0.780、0.824，見圖3、表5。

圖3 lncRNA THRIL、miR-300評(píng)估敗血癥患兒預(yù)后的ROC曲線

表5 lncRNA THRIL、miR-300評(píng)估敗血癥患兒預(yù)后的ROC曲線分析

3討論

3.1新生兒敗血癥嚴(yán)重影響新生兒的生命健康

敗血癥是由于感染的病原菌入血并在血液中增殖，隨著血液循環(huán)造成的全身感染。新生兒機(jī)體免疫功能低下，抗感染能力差，故新生兒敗血癥是新生兒科最為棘手的危重癥之一[8]。新生兒敗血癥早期無(wú)全身特異性臨床表現(xiàn)，與一般感染無(wú)異，但其病情進(jìn)展迅速，嚴(yán)重影響新生兒的生命健康。所以篩選多個(gè)生化標(biāo)志物，進(jìn)行多指標(biāo)聯(lián)合早期診斷對(duì)新生兒敗血癥的治療及預(yù)后尤為重要。

培養(yǎng)是新生兒敗血癥診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但所耗時(shí)間較長(zhǎng)，且培養(yǎng)率低。PCT作為血清降鈣素的前體，其血清水平與系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)密切，常被用來(lái)作為細(xì)菌真菌感染、肺炎及敗血癥的早期診斷[9]。本研究發(fā)現(xiàn)與一般感染的新生兒相比，敗血癥患兒PCT水平顯著升高，其作為新生兒敗血癥早期診斷的ROC曲線下面積為0.858，敏感度和特異性分別為0.735、0.882，該結(jié)果與以往報(bào)道一致[10]。

3.2 lncRNA THRIL、miR-300對(duì)新生兒敗血癥的早期診斷具有一定效能

lncRNA和miRNA是機(jī)體兩大類非編碼RNA，miRNA可以與靶基因的3′UTR結(jié)合，降低靶基因表達(dá)；lncRNA可以作為miRNA的“分子海綿”，與miRNA形成ceRNA網(wǎng)絡(luò)而調(diào)控下游基因的表達(dá)，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展、炎癥反應(yīng)進(jìn)展等各類生命活動(dòng)[11-12]。lncRNA THRIL和miR-300在炎癥疾病中發(fā)揮重要作用，Li等[13]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-300能通過(guò)激活A(yù)MPK/mTOR信號(hào)通路在膿毒癥中調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，他們發(fā)現(xiàn)miR-300靶向結(jié)合NAMPT基因來(lái)增強(qiáng)細(xì)胞自噬并抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞周期而影響膿毒癥進(jìn)展，以上結(jié)果表明miR-300能夠影響炎癥反應(yīng)發(fā)生并影響膿毒癥進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)miR-300在敗血癥患兒血清中高表達(dá)，其診斷敗血癥的曲線下面積為0.809；進(jìn)一步探究其與炎性因子TNF-α、IL-6、CRP和PCT的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-300與炎性因子水平呈明顯的正相關(guān)；且本研究發(fā)現(xiàn)miR-300對(duì)膿毒癥預(yù)后評(píng)估的AUC為0.770，該結(jié)果表明miR-300在新生兒敗血癥的早期診斷中有一定作用，且能通過(guò)影響炎性因子水平影響膿毒癥進(jìn)展，對(duì)膿毒癥預(yù)后有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。

THRIL可以通過(guò)調(diào)控TNF-α水平而影響炎癥反應(yīng)，Chen等[14]發(fā)現(xiàn)THRIL可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-424/ROCK2軸加重膿毒癥小鼠的急性肺損傷。另有研究表明THRIL在膿毒癥患者中表達(dá)上調(diào)，其可作為miR-19a的“分子海綿”進(jìn)而上調(diào)人支氣管上皮細(xì)胞中的TNF-α水平[15]。與膿毒癥相似，本研究發(fā)現(xiàn)新生兒敗血癥患兒中THRIL表達(dá)上調(diào)，且與TNF-α呈顯著正相關(guān)，對(duì)新生兒敗血癥的早期診斷AUC為0.838，預(yù)后預(yù)測(cè)的AUC為0.802；THRIL、miR-300和PCT對(duì)敗血癥早期診斷聯(lián)合分析，其AUC為0.975，該結(jié)果表明將各生化指標(biāo)聯(lián)合分析后，診斷效能大大提高，在后期臨床中也可使用多指標(biāo)聯(lián)合分析診斷新生兒敗血癥。THRIL和miR-300對(duì)敗血癥預(yù)后評(píng)估聯(lián)合分析，AUC為0.867，預(yù)測(cè)效能也明顯提高。

綜上，miR-300和lncRNA THRIL在新生兒敗血癥患兒血清中表達(dá)顯著提高，對(duì)新生兒敗血癥的早期診斷具有一定效能，可聯(lián)合常用的PCT、CRP等生化指標(biāo)用于新生兒敗血癥的早期診斷。兩者皆與炎性因子有顯著相關(guān)性，可能通過(guò)調(diào)控炎性因子水平從而影響敗血癥進(jìn)展，所以對(duì)敗血癥的預(yù)后有一定預(yù)測(cè)價(jià)值。在后期研究中我們還需進(jìn)一步探究?jī)烧邔?duì)炎性因子的調(diào)控機(jī)制。