黃銀娜，張小鳳，許旭輝，謝夏曼

（普寧市慢性病防治中心，廣東 普寧 515300）

肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌（MBT）感染引起的慢性呼吸道傳染病，發(fā)生于肺組織、氣管、支氣管和胸膜等部位［1］。據(jù)2019年WHO全球結(jié)核病報告［2］顯示，2018年在全球范圍內(nèi)約有1 000萬人罹患結(jié)核病，中國新發(fā)結(jié)核病患者約86.6萬例，發(fā)病率64／10萬，死亡數(shù)3.94萬例。近年來，基于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測（TB-DNA檢測）的分子診斷技術(shù)得到較快發(fā)展，其中實時熒光定量PCR技術(shù)以其高靈敏度、高特異性、操作簡單而廣泛應(yīng)用［3］。本研究探討TB-DNA檢測聯(lián)合羅氏固體培養(yǎng)在活動性肺結(jié)核診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2020年1月至2020年12月我院收治的活動性肺結(jié)核患者471例為肺結(jié)核組，其中男349例，女122例，年齡11～90歲，均符合肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；另選取同期就診的非肺結(jié)核患者287例為非肺結(jié)核組，其中男216例，女71例，年齡11～93歲。兩組均行TB-DNA檢測及TB培養(yǎng)。

1.2 儀器和試劑結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸檢測試劑購自廈門致善生物科技股份有限公司，核酸提取采用廈門致善Lab-Aid 824S核酸提取儀，核酸擴增儀采用上海宏石SLAN-96S全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)；分離培養(yǎng)采用改良羅氏培養(yǎng)基。

1.3 實驗方法①標(biāo)本采集：取三份痰標(biāo)本：即時痰（就診后深呼吸后咳出的痰液）、夜間痰（送痰前一夜，患者晚間咳出的痰液）、次日晨痰（患者晨起立即用清水漱口后，咳出的第二口、第三口痰液），取樣后放置于無菌容器中，盡早送檢；TB-DNA檢測：取痰涂片陽性最高的標(biāo)本進行檢測，若三份痰標(biāo)本結(jié)果一致，則取質(zhì)量最好（干酪痰、褐色血痰或含少量新鮮血液的血痰、粘液痰）標(biāo)本進行檢測；TB培養(yǎng)：取陽性最高的兩份標(biāo)本進行檢測，若三份痰標(biāo)本結(jié)果一致，則取質(zhì)量最好的兩份進行培養(yǎng)。②樣本檢測：進行TB-DNA檢測和TB培養(yǎng)、鑒定，嚴(yán)格按照試劑盒標(biāo)準(zhǔn)流程操作。③結(jié)果判斷：TBDNA檢測：通過待測樣品所得的擴增曲線C t值來判斷樣品中是否含有結(jié)核分枝桿菌。FAM通道為目的基因檢測通道，HEX通道為內(nèi)控檢測通道。C t值≤25即為陽性，C t值＞25或無擴增信號即為陰性。檢測樣品在HEX通道C t值＜26。TB培養(yǎng)和鑒定：TB培養(yǎng)分別于接種后第3天、第7天各觀察一次，以后每周觀察一次，記錄菌落生長及污染情況，生長物經(jīng)抗酸染色證實后報告分枝桿菌生長，滿8周后未見菌落生長者報告陰性。TB鑒定：37℃孵育4周時觀察結(jié)果，結(jié)核分枝桿菌PNB（-），否則為非結(jié)核分枝桿菌。

1.4 評價標(biāo)準(zhǔn)比較兩種檢測方法單獨及聯(lián)合診斷的靈敏度、特異度、陰性預(yù)測值和陽性預(yù)測值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以n（%）表示，行卡方檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TB-DNA檢測結(jié)果在肺結(jié)核組471例中，檢出陽性278例（59.02%），陰性193例（40.98%）；非肺結(jié)核組287例中，檢測全部為陰性。見表1。

2.2 TB培養(yǎng)結(jié)果在肺結(jié)核組471例中，檢出陽性201例（42.68%），陰性270例（57.32%）；非肺結(jié)核組287例中，檢出陽性8例，全部經(jīng)PNB培養(yǎng)基初步鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，占2.79%，檢出陰性279例，占97.21%。見表1。

表1 TB-DNA檢測和TB培養(yǎng)的結(jié)果比較（n）

2.3 聯(lián)合檢測結(jié)果在肺結(jié)核組471例中，檢出陽性291例，占61.78%，陰性180例，占38.22%；非肺結(jié)核組中，檢出陽性8例，占2.79%，全部經(jīng)PNB培養(yǎng)基初步鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，其中6例涂陽患者核酸經(jīng)廈門致善分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）均鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，檢出陰性279例，占97.21%。見表2。

2.4 診斷價值以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，TB-DNA檢測、TB培養(yǎng)及二者聯(lián)合的靈敏度分別為59.02%、42.68%、61.78%，特異度分別為100.00%、97.21%、97.21%，陰性預(yù)測值分別為59.79%、50.82%、60.78%，陽性預(yù)測值分別為100.00%、96.17%、97.32%；聯(lián)合檢測的靈敏度高于單項TB-DNA檢測及TB-培養(yǎng)（P＜0.05）。見表2和表3。

表2 不同診斷方法與臨床診斷的結(jié)果比較（n）

表3 不同檢測方案的診斷效能比較［%（n／n）］

3 討論

近年來，分子生物學(xué)在TB診斷中的應(yīng)用越來越廣泛，實時熒光定量PCR是近年來WHO向全球極力推薦的診斷技術(shù)［5-6］。本研究結(jié)果顯示，TB-DNA檢測的靈敏度顯著高于TB培養(yǎng)，說明熒光PCR具有快速、靈敏度高的優(yōu)點，其檢測時間短于TB培養(yǎng)，可以為結(jié)核病的早期診斷提供依據(jù)。本研究中肺結(jié)核組471例病例中，TB培養(yǎng)陽性而TB-DNA檢測陰性者13例，其中10例為涂陰病人，可能是TB-DNA檢測與TB培養(yǎng)為不同的痰標(biāo)本；3例為涂陽病人，進一步實驗確認(rèn)3例為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。此3例患者可能存在IS6110基因位點的缺失或突變，導(dǎo)致擴增不到目的引物，因此TB-DNA檢測亦存在一定的假陰性，有條件的情況下做進一步的鑒定更有利于結(jié)核病的及時診斷。287例非肺結(jié)核組患者中，8例為TB培養(yǎng)陽性，經(jīng)PNB鑒定均為非結(jié)核分枝桿菌，此8例TB-DNA檢測全部為陰性，對其中6例涂陽患者提取的核酸進行進一步實驗鑒定為非結(jié)核分枝桿菌，說明TB-DNA檢測陰性在涂陽患者中提示感染非結(jié)核分枝桿菌肺病的可能，進一步的菌型鑒定有利于結(jié)核病的鑒別診斷；TB培養(yǎng)是診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但結(jié)核分枝桿菌與大部分的非結(jié)核分枝桿菌均可在改良羅氏培養(yǎng)基上生長，同時做菌型鑒定有利于疾病的鑒別，否則也存在一定的假陽性。

TB-DNA檢測對結(jié)核病的診斷效果顯著，但特異性較差，存在一定假陽性、假陰性，使其難以發(fā)揮有效作用［7］。實時熒光PCR法對IS6110基因進行檢測，通過擴增信號的有無判斷是否存在結(jié)核分枝桿菌，檢測試劑采用預(yù)分裝干試劑，全程閉管，無需PCR后處理，加入UNG酶，可有效防止污染，杜絕假陽性，特別添加外源內(nèi)控檢測，可有效避免假陰性，使結(jié)果準(zhǔn)確可靠［8］，但其不能區(qū)分死菌跟活菌，不能作為療效觀察方法，TB培養(yǎng)可進一步做菌型鑒定和藥敏實驗，雖然特異性、靈敏度高，但所需時間較長，與TB-DNA檢測聯(lián)合應(yīng)用可以提高疾病的診斷率。

綜上所述，TB-DNA檢測可快速診斷結(jié)核病，TB-DNA檢測聯(lián)合TB培養(yǎng)的檢出率更高，可有效提高診斷率，有利于早期診斷結(jié)核病。