王文,趙家才，李雯，歐陽(yáng)曉芳

(云南省種畜繁育推廣中心，云南 昆明 650212)

二十世紀(jì)四十年代到六十年代，家畜人工授精的應(yīng)用取得了突破性進(jìn)展， Smith和 Polge研究牛精液的冷凍保存方法獲得了成功。當(dāng)前，牛冷凍精液人工授精技術(shù)得到普遍的推廣應(yīng)用，荷斯坦奶牛100%應(yīng)用冷凍精液人工授精，肉牛雜交改良人工授精普及率達(dá)90%以上。獨(dú)龍牛是云南省貢山獨(dú)龍族怒族自治縣的地方良種，屬于黃牛屬中獨(dú)立的一個(gè)種(Bosfrontalis)，處于半家養(yǎng)狀態(tài)的瀕危牛種，為國(guó)家二類保護(hù)動(dòng)物，種群數(shù)量?jī)H為2000余頭。獨(dú)龍牛精液冷凍稀釋液配方的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，有助于獨(dú)龍牛種質(zhì)資源保護(hù)和遺傳物質(zhì)保存，獨(dú)龍牛冷凍精液質(zhì)量與稀釋液成分、溫度變化的控制、抗凍劑的種類和含量、平衡時(shí)間、降溫和冷凍速度密切相關(guān)。稀釋液是生產(chǎn)冷凍精液的重要原料，稀釋液配方的好壞直接影響冷凍精液的質(zhì)量和產(chǎn)量。稀釋液的主要作用是為精子提供能量來(lái)源，防止低溫冷凍損傷，提供緩沖劑，調(diào)節(jié)酸堿平衡、防止pH值的有害變化，維持適當(dāng)?shù)臐B透壓和電解質(zhì)平衡，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，防止冷凍損傷[1]。糖類是精子能量的重要來(lái)源，其作用是補(bǔ)充精子的能量消耗；抗凍劑(如丙三醇、乙二醇和二甲基乙酰胺等)能夠降低溶液冰點(diǎn)，減少和避免冷凍、解凍過(guò)程對(duì)精子的損傷；氨基酸具有良好的營(yíng)養(yǎng)功能。

1 材料和方法

1.1 獨(dú)龍牛精液的來(lái)源和采精方法

供試驗(yàn)的獨(dú)龍牛從怒江州貢山獨(dú)龍族怒族自治縣九目當(dāng)保種場(chǎng)引進(jìn)5頭，年齡3～6歲，獨(dú)龍牛常年野牧，定時(shí)補(bǔ)飼食鹽，2010年遷地引入和風(fēng)土馴化，用電刺激法采精[2]。

1.2 基礎(chǔ)液的配制和精液稀釋

用電子天平(型號(hào)：DT-100A)準(zhǔn)確稱量所需各種試劑，制成濃度為0.2 M的三(羥甲基)氨基甲烷〔三(羥甲基)氨基甲烷2.42g、檸檬酸1.36g、果糖1.0g、卵黃20mL，雙蒸水加至80mL〕基礎(chǔ)液，每毫升基礎(chǔ)液分別加入500～1000μg鏈霉素、500～1000IU青霉素。用奧林巴斯相差顯微鏡(型號(hào)：BX43)測(cè)定精子活力，分光光度計(jì)(型號(hào)：RS232)測(cè)定精子密度，精液的稀釋采用一步稀釋法。按每支細(xì)管精液最終含2300萬(wàn)～2500萬(wàn)個(gè)精子，確定添加的稀釋量，一次性加入所需稀釋液，然后在4℃下平衡2～4h。加入稀釋液時(shí)，稀釋液的溫度和精液溫度相差不能超過(guò)5℃。精液品質(zhì)的檢查按國(guó)家牛冷凍精液標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，測(cè)定公牛的采精量、精子活力、精子密度等指標(biāo)[3，4]。

1.3 獨(dú)龍牛精液冷凍稀釋液添加防凍劑試驗(yàn)

獨(dú)龍牛精液冷凍稀釋液防凍保護(hù)劑濃度試驗(yàn)，在基礎(chǔ)液中分別添加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、13%和15%的丙三醇得到13個(gè)稀釋液，分別編號(hào)待用；在基礎(chǔ)液中分別添加2%、4%、6%、7%、8%、10%、12%的乙二醇得到7個(gè)稀釋液，編號(hào)備用；在基礎(chǔ)液中分別添加2%、3%、4%、5%和6%的二甲基乙酰胺得到5個(gè)稀釋液，編號(hào)備用。取同一頭公牛精液等量加入待試驗(yàn)的稀釋液，依次檢查記錄各個(gè)稀釋液稀釋后的精子活力和解凍活力。凍精制作程序、冷凍曲線、解凍溫度等完全一致。

1.4 獨(dú)龍牛精液冷凍稀釋液添加氨基酸的效果試驗(yàn)

獨(dú)龍牛精液冷凍稀釋液氨基酸添加量試驗(yàn)，在基礎(chǔ)液中分別添加0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、1.5%、1.75%的半胱氨酸制成7種稀釋液；在基礎(chǔ)液中分別添加0.5%、0.75%、1.0%、1.25%、2%的精氨酸制成5種稀釋液；在基礎(chǔ)液中分別添加0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、1.5%和2%的甘氨酸制成6種稀釋液，前述供試稀釋液逐一編號(hào)備用。處理方法同1.3。

1.5 冷凍稀釋液的優(yōu)選

按正交設(shè)計(jì)法要求分別將實(shí)驗(yàn)果糖、葡萄糖、丙三醇、乙二醇、二甲基乙酰胺和半胱氨酸、精氨酸和甘氨酸配比，使用L9(34)正交表確定稀釋液配方和安排試驗(yàn)，優(yōu)選出5個(gè)冷凍效果良好的組合，再進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)。

1.6 獨(dú)龍牛精液的分裝和冷凍

獨(dú)龍牛原精活力60%以上、精子密度為6.0億/mL以上，其他指標(biāo)無(wú)異常的精液，在等溫條件下用不同的冷凍稀釋液作相應(yīng)比例的稀釋，稀釋后的精液先緩慢降溫至室溫時(shí)再放入4℃的冰箱中繼續(xù)降溫平衡2～4h，經(jīng)平衡后的精液在低溫操作柜中用細(xì)管分裝一體機(jī)(型號(hào)：MRS-3)進(jìn)行分裝、封口和印字標(biāo)記。冷凍精液時(shí)把細(xì)管精液水平放于細(xì)管冷凍架上[5]，然后放入程控冷凍儀(型號(hào)：DIGITCOOL5300)中冷凍。冷凍程序：?jiǎn)?dòng)程控儀，從室溫以5℃/min的速度降溫至4℃，保持2min，放入精液后在4℃下保持0.5min，從4℃以5℃/min的速度降溫至-10℃，從-10℃以40℃/min的速度降溫至-100℃，從-100℃以20℃/min的速度降溫至-140℃，最后把冷凍后的凍精浸入液氮中隨機(jī)抽樣解凍，解凍溫度為(40±2)℃。檢查解凍后精液品質(zhì)。凍精解凍活力達(dá)35%以上者方可保存。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用生物統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[6]。

2 結(jié)果與分析

獨(dú)龍牛用電刺激法采精，采精量為(5.24±2.37)mL，原精活力為(67.51±15.47)%，精子密度為(4.43±4.59)億/mL，解凍活力為(36.35±2.29)%。

2.1 基礎(chǔ)液中不同濃度防凍保護(hù)劑試驗(yàn)結(jié)果

見(jiàn)表1。

2.2 基礎(chǔ)液中不同濃度氨基酸試驗(yàn)結(jié)果

見(jiàn)表2。

表2 不同濃度氨基酸試驗(yàn)結(jié)果 單位：%

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1乙二醇正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果

F因素(葡萄糖)：試驗(yàn)水平為F1(0.5%)、F2(1.0%)和F3(1.5%)；E2因素(甘氨酸)：試驗(yàn)水平為E21(0)、E22(0.25%)和E23(0.50%)；G因素(乙二醇)：試驗(yàn)水平為G1(4%)、G2(5%)和G3(6%)正交試驗(yàn)。結(jié)果是F和E2因素對(duì)精子冷凍解凍活力影響極顯著(P<0.01)，F(xiàn)1極顯著優(yōu)于F3，F(xiàn)2顯著好于F3，F(xiàn)1和F2間差異不明顯, 最佳組合為F1E21G3。

2.3.2二甲基乙酰胺正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果

D2因素(精氨酸)：試驗(yàn)水平為D21(0.250%)、D22(0.375%)和D23(0.500%)；B2因素(果糖)：試驗(yàn)水平為B21(0.50%)、B22(0.75%)和B23(1.00%)；H因素(二甲基乙酰胺)：試驗(yàn)水平為H1(2.0%)、H2(3.0%)和H3(4.0%)正交試驗(yàn)。結(jié)果顯示3個(gè)因素不同水平間差異不顯著(P>0.05)，最佳組合為D23B22H2。

2.3.3半胱氨酸正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果

A因素(半胱氨酸):試驗(yàn)水平為A1(0)、A2(0.25%)和A3(0.50%)；B1因素(果糖):試驗(yàn)水平為B11(0.5%)、B12(1.0%)和B13(1.5%)；C因素(丙三醇):試驗(yàn)水平為C1(5%)、C2(6%)和C3(7%)進(jìn)行正交試驗(yàn)[7]。結(jié)果顯示3個(gè)因素不同水平間差異均不顯著(P>0.05),最佳組合為A2B11C2。

2.3.4精氨酸正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果

D1因素(精氨酸):試驗(yàn)水平為D11(0)、D12(0.50%)和D13(0.75%)；B1因素(果糖): 試驗(yàn)水平為B11(0.5%)、B12(1.0%)和B13(1.5%)；C因素(丙三醇):試驗(yàn)水平為C1(5%)、C2(6%)和C3(7%)進(jìn)行正交試驗(yàn)。結(jié)果表明3個(gè)因素不同水平間差異不顯著(P>0.05)，D13優(yōu)于其他兩個(gè)水平，最佳組合為D13B11C2。

2.3.5甘氨酸正交試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果

E1因素(甘氨酸)：試驗(yàn)水平為E11(0)、E12(0.50%)和E13(0.75%)；B1因素(果糖):試驗(yàn)水平為B11(0.5%)、B12(1.0%)和B13(1.5%)；C因素(丙三醇)：試驗(yàn)水平為C1(5%)、C2(6%)和C3(7%)正交試驗(yàn)。結(jié)果表明E1因素對(duì)精子冷凍解凍活力影響顯著(P<0.05)，E13顯著低于E11，E11和E12以及E12和E13間差異不明顯， 最佳組合為E11B11C2。

2.4 不同配方稀釋液的試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，以不同正交試驗(yàn)效果最好的因素水平組合配制稀釋液，以基礎(chǔ)液+6%丙三醇稀釋液為對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同稀釋液對(duì)獨(dú)龍牛精液的稀釋、冷凍解凍效果

3 討論與小結(jié)

3.1 添加半胱氨酸對(duì)獨(dú)龍牛精子冷凍效果

由表3的結(jié)果得出，稀釋液中添加半胱氨酸較對(duì)照組顯著提高了獨(dú)龍牛精子冷凍解凍活力(P<0.05)，復(fù)蘇率高于對(duì)照組，但差異不明顯(P>0.05)，原精活力與對(duì)照組無(wú)明顯差異(P>0.05)。半胱氨酸有緩沖、抗氧化、抗菌、解毒等作用，可以降低體液冰點(diǎn)，是生物抗凍蛋白的主要成分，Bilodeau等在解凍后的牛冷凍精液中加入0.5μmol半胱氨酸，結(jié)果可以使精子活力在沒(méi)有外部氧化壓力的情況下維持較高水平達(dá)6h以上。添加半胱氨酸有助于提高獨(dú)龍牛精子冷凍效果。

3.2 添加精氨酸和甘氨酸對(duì)獨(dú)龍牛精子冷凍效果

表3結(jié)果表明，稀釋液中添加精氨酸獨(dú)龍牛精子冷凍解凍活力和復(fù)蘇率比對(duì)照組提高，但差異均不明顯(P>0.05)。精氨酸能產(chǎn)生具有許多生理功能的重要遞質(zhì)，參與殺滅微生物，介導(dǎo)一系列免疫過(guò)程，對(duì)機(jī)體起著全方位的保護(hù)作用；O Flaherty等的試驗(yàn)表明，精氨酸可以促進(jìn)冷凍解凍后牛精子的獲能和頂體反應(yīng)；本試驗(yàn)表明，冷凍稀釋液中添加精氨酸對(duì)獨(dú)龍牛精子冷凍保存是有益的。在稀釋液中添加甘氨酸，未能提高獨(dú)龍牛精子冷凍解凍活力和復(fù)蘇率，精子冷凍解凍活力極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

3.3 乙二醇對(duì)獨(dú)龍牛精子冷凍的影響

從表3得出，使用乙二醇為防凍保護(hù)劑，獨(dú)龍牛精子冷凍解凍活力極顯著低于使用丙三醇和二甲基乙酰胺的稀釋液(P<0.01)，精子復(fù)蘇率低于50%；制作獨(dú)龍牛冷凍精液時(shí)使用乙二醇為防凍保護(hù)劑的效果低于雞制作冷凍精液時(shí)使用乙二醇為防凍保護(hù)劑的效果，乙二醇不宜作為獨(dú)龍牛精子冷凍抗凍劑。

3.4 二甲基乙酰胺對(duì)獨(dú)龍牛精子冷凍的影響

表3顯示，使用二甲基乙酰胺作為獨(dú)龍牛精子冷凍保存的防凍保護(hù)劑，其效果優(yōu)于乙二醇，低于丙三醇，且差異均極顯著(P<0.01)，精子冷凍解凍活力能夠達(dá)到30%以上。

3.5 丙三醇對(duì)獨(dú)龍牛精子冷凍的影響

由表3的結(jié)果和正交試驗(yàn)結(jié)果可以得出，丙三醇作為獨(dú)龍牛精子冷凍保存的防凍保護(hù)劑，其效果最佳，極顯著優(yōu)于乙二醇和二甲基乙酰胺(P<0.01)；丙三醇能促使稀釋液呈過(guò)冷和微晶凍結(jié)狀態(tài)，使精液呈玻璃樣凍結(jié)狀態(tài)，其作用相當(dāng)于“鹽的緩沖液”，能溶解剩余的鹽，在冷凍解凍時(shí)，保持鹽濃度低于臨界限度。所以，獨(dú)龍牛精子冷凍解凍活力和復(fù)蘇率均較好，是最理想的防凍保護(hù)劑，不同配方中的用量均以6%最好。

3.6 優(yōu)選出冷凍保存效果較好的冷凍稀釋液

冷凍保存效果最好的冷凍稀釋液是A2B11C2，即半胱氨酸0.25g、果糖0.5g、丙三醇6mL、三(羥甲基)氨基甲烷2.42g、檸檬酸1.36g、卵黃20mL，雙蒸水加至100mL；其次是D13B11C2配方，即精氨酸0.75g、果糖0.5g、丙三醇6mL、三(羥甲基)氨基甲烷2.42g、檸檬酸1.36g、卵黃20mL，雙蒸水加至100mL；稀釋液添加0.5%葡萄糖和0.5%果糖均獲得良好的冷凍效果；添加3種氨基酸的試驗(yàn)中，0.25%半胱氨酸和0.75%精氨酸精子冷凍效果理想,凍精解凍活力均高于毛翔光等[8]的研究結(jié)果。防凍保護(hù)劑以6%丙三醇最好，乙二醇添加量為6.0%、二甲基乙酰胺為3.0%具有防凍保護(hù)作用?；A(chǔ)液添加葡萄糖和果糖，半胱氨酸、精氨酸和甘氨酸，丙三醇、乙二醇和二甲基乙酰胺是否存在互作效應(yīng)，本試驗(yàn)未進(jìn)行研究，有待今后深入開(kāi)展研究。

冷凍稀釋液是影響?yīng)汖埮＞豪鋬鲂Ч闹饕蛩?，還應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)地篩選，今后仍需做深入的試驗(yàn)，以期進(jìn)一步提高獨(dú)龍牛冷凍精液品質(zhì)。不同配方稀釋液間冷凍效果的差異明顯。

試驗(yàn)中不同配方冷凍稀釋液對(duì)獨(dú)龍牛原精的保存效果和精子冷凍解凍復(fù)蘇率無(wú)明顯影響，對(duì)精子的冷凍保存效果存在差異。丙三醇、乙二醇和二甲基乙酰胺為常用的滲透性防凍保護(hù)劑，此類防凍劑多屬低分子中性物質(zhì)，在溶液中易結(jié)合水分子發(fā)生水合作用，使溶液黏性增加，從而弱化了水的結(jié)晶過(guò)程，達(dá)到保護(hù)目的；糖類除了提供能量外，為非滲透性防凍保護(hù)劑，能溶于水，但不能進(jìn)入細(xì)胞，能使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)，即可在特定溫度下降低溶質(zhì)濃度，從而起到保護(hù)作用；檸檬酸、檸檬酸鹽和三(羥甲基)氨基甲烷為緩沖劑，檸檬酸和檸檬酸鹽是一種簡(jiǎn)單的緩沖物質(zhì)，三(羥甲基)氨基甲烷具有良好的緩沖性能，是維持pH值穩(wěn)定和滲透壓的重要物質(zhì)。研究表明，獨(dú)龍牛冷凍稀釋液中添加適量的半胱氨酸或精氨酸，能顯著提高精子冷凍解凍活力和復(fù)蘇率，添加甘氨酸則無(wú)前述之效果。本試驗(yàn)優(yōu)選得出具有良好保存效果的獨(dú)龍牛精液冷凍稀釋液，可制作質(zhì)量良好的冷凍精液。