肖建勇，陳智超，朱育嫻，陳可文,3，黃梓芮,2，劉斌,2*

1. 福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院（福州 350002）；2. 福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心（福州 350002）；3. 西南民族大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)學(xué)院（成都 610041）

灰樹花（Grifola frondose）是一種食藥兩用菌，又被稱之為“千佛菌”，其在世界范圍內(nèi)分布廣泛，在日本、俄羅斯及中國(guó)的浙江、福建、四川等地均有種植，在日本還享有“舞茸”的稱號(hào)[1-2]。灰樹花不僅風(fēng)味獨(dú)特、口感豐富，而且富含如多糖、多肽、多酚及黃酮等生物活性物質(zhì)，其獨(dú)特的藥用與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值使其成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)?；覙浠ㄓ行С煞值难芯恐饕杏诙嗵牵覙浠ǘ嗵蔷哂锌寡趸痆3]、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤[4]、抗乙型肝炎病毒等生物活性，此外越來(lái)越多的研究開始關(guān)注其在預(yù)防和治療糖尿病、高血糖等疾病方面的潛力。

然而，市面上的灰樹花品類豐富，特征差異極大，有的灰樹花分支長(zhǎng)，葉片大，顏色灰白，而有的則菇型緊湊，分支適中，顏色呈灰褐色，大朵灰樹花的單朵質(zhì)量遠(yuǎn)超于小朵灰樹花。很多灰樹花工藝研究以及營(yíng)養(yǎng)學(xué)分析都未提及所用灰樹花的具體品類，這對(duì)灰樹花的后續(xù)研究有著較大的阻礙。最早開始研究灰樹花栽培技術(shù)的國(guó)家是日本，經(jīng)過(guò)多年的探索不僅保證產(chǎn)量逐年上升，而且實(shí)現(xiàn)周年化栽培。我國(guó)浙江省慶元縣和河北遷西縣在20世紀(jì)80年代開始野生灰樹花人工馴化栽培和菌棒式栽培，開創(chuàng)仿野生栽培方式、二次覆土栽培和二次無(wú)土栽培模式，在灰樹花栽培方面技術(shù)相對(duì)成熟[5]。然而優(yōu)良菌株是推動(dòng)灰樹花產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要?jiǎng)恿?，福建南平響?yīng)國(guó)家科技扶貧相關(guān)政策，近年來(lái)也開始對(duì)灰樹花進(jìn)行選育工作，雖然起步相對(duì)較晚，但部分地區(qū)已開展規(guī)?；耘唷Ｔ囼?yàn)通過(guò)與慶元的灰樹花品種相比較來(lái)培育和推廣生物活性物質(zhì)含量更高的新品種以促進(jìn)福建省灰樹花的開發(fā)利用。同時(shí)，灰樹花作為一種中溫型、喜光的木質(zhì)腐生菌，其生長(zhǎng)受環(huán)境因素影響較大，環(huán)境溫度、水分濕度及光照情況等都會(huì)影響其子實(shí)體的發(fā)育[6]。不同地區(qū)的氣候等條件有所差別，產(chǎn)自不同地區(qū)的灰樹花也具有不同的形態(tài)學(xué)方面的特征，但其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值以及生物活性物質(zhì)含量等方面是否具有顯著性差別則需要通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證。因此，試驗(yàn)針對(duì)產(chǎn)自浙江慶元以及福建南平的4種灰樹花的主要成分多糖進(jìn)行提取，并對(duì)獲得的多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行進(jìn)一步對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花（D1，福建南平大朵；D2，浙江慶元大朵；X1，福建南平小朵；X2，浙江慶元小朵；經(jīng)福建農(nóng)林大學(xué)菌草工程技術(shù)研究中心鑒定，烘干粉碎后備用）；普通型透析袋（3 500 Da，MD3525）、3, 5-二硝基水楊酸（DNS，R23236）、 DPPH（S30629）、2, 2’-聯(lián)氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS，S19198），均為上海源葉生物科技有限公司；BCA試劑盒（P0010BCA，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；10×PBS緩沖液（E607016，上海生工生物股份有限公司）；過(guò)硫酸鉀、FeSO4、H2O2、水楊酸、葡萄糖、無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚等化學(xué)試劑（均為國(guó)藥分析純）。

1.2 灰樹花多糖的制備

精確稱取20 g經(jīng)烘干粉碎的灰樹花粉末，加入其10倍體積的95%乙醇，在45 ℃恒溫水浴條件下按45 kHz超聲處理1 h，經(jīng)六層紗布過(guò)濾后按4 000 r/min離心15 min，濾渣烘干后加入25倍體積的去離子水，超聲1 h（45 ℃，45 kHz），于100 ℃水浴1 h，離心，將上清液經(jīng)減壓濃縮后加入4倍體積乙醇于4 ℃醇沉12 h，按4 000 r/min離心15 min獲得沉淀即為粗多糖。依次用無(wú)水乙醇、丙酮、無(wú)水乙醚洗滌，于40 ℃烘干乙醚，用Sevag法（V氯仿∶V正丁醇=4∶1）除去蛋白，并用3 500 Da的透析袋透析48 h，減壓濃縮后凍干，即制得灰樹花多糖。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 灰樹花多糖理化性質(zhì)測(cè)定

1.3.1.1 總糖含量測(cè)定

灰樹花總糖含量的測(cè)定參考苯酚-硫酸法[7]。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：配制質(zhì)量濃度分別為0，0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)體系；各取500 μL至裝有500 μL 5%苯酚的試管中，充分搖勻后加入2.5 mL濃硫酸，沸水浴15 min后放置20 min冷卻，每管中移取200 μL至96孔板，測(cè)定樣品吸光度（490 nm）。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算得回歸方程y=3.836 8x+0.261 2（R2=0.990 8）。

灰樹花多糖溶液吸光度的測(cè)定：配制質(zhì)量濃度1 mg/mL的灰樹花多糖溶液，重復(fù)上述步驟測(cè)定吸光度。

1.3.1.2 還原糖含量測(cè)定

還原糖含量的測(cè)定參考DNS法[8]。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：參照1.3.1.1小節(jié)配制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)體系；各取100 μL至裝有100 μL DNS試劑的試管中，充分搖勻后水浴5 min；流水冷卻后用蒸餾水定容至1 mL；移取200 μL至96孔板，測(cè)定在540 nm波長(zhǎng)下的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算得回歸方程y=0.655 7x-0.015 8（R2=0.990 8）。

灰樹花多糖溶液吸光度的測(cè)定：配制質(zhì)量濃度2 mg/mL的灰樹花多糖溶液，重復(fù)上述步驟測(cè)定吸光度。

1.3.1.3 蛋白含量的測(cè)定

測(cè)定灰樹花蛋白質(zhì)含量參考BCA法[9]，并稍加修改。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：參照1.3.1.1小節(jié)配制牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)體系；各取0.1 mL至裝有2 mL工作液（VA液∶VB液=50∶1）的試管中，充分搖勻后于37 ℃孵育30 min；移取200 μL至96孔板，測(cè)定在562 nm波長(zhǎng)下的吸光度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算得回歸方程y=0.562 7x-0.014 3（R2=0.991 6）。

灰樹花多糖溶液吸光度的測(cè)定：配制質(zhì)量濃度2 mg/mL的灰樹花多糖溶液，重復(fù)上述步驟測(cè)定吸光度。

1.3.2 抗氧化性測(cè)定

1.3.2.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定。

DPPH自由基清除方法已經(jīng)在比較姬松茸胞外多糖抗氧化能力中得到應(yīng)用[10]。將灰樹花多糖以及VC配制成質(zhì)量濃度分別為0.125，0.250，0.500，1.000和2.000 mg/mL的溶液體系；各取100 μL加入至裝有100 μL濃度為0.2 mmol/L DPPH的1.5 mL離心管中，其中抗壞血酸（VC）溶液為陽(yáng)性對(duì)照組；充分混勻后在避光條件下保存，反應(yīng)30 min，離心后取上清液；測(cè)定樣品吸光度（517 nm），并根據(jù)式（1）計(jì)算。

式中：A樣品為灰樹花溶液體系反應(yīng)后的吸光度；A對(duì)照為用無(wú)水乙醇取代DPPH反應(yīng)后的背景吸光度；A空白為用無(wú)水乙醇取代灰樹花多糖與DPPH反應(yīng)的陰性對(duì)照吸光度。

1.3.2.2 ABTS自由基清除率的測(cè)定。

參照吳娟等[11]的ABTS清除試驗(yàn)。制備ABTS自由基溶液：將5 mL過(guò)硫酸鉀（2.45 mmol/L）與5 mL ABTS（7 mmol/L）混合后在室溫條件下避光保存16 h，測(cè)定前用PBS（濃度50 mmol/L，pH 7.4）稀釋至其在734 nm處吸光度為0.70±0.02；參照1.3.2.1小節(jié)配制灰樹花多糖及VC溶液體系；各取50 μL至酶標(biāo)板，其中抗壞血酸（VC）溶液為陽(yáng)性對(duì)照組；保溫3 min（30℃）后迅速加入150 μL ABTS自由基溶液，搖勻后繼續(xù)保溫，反應(yīng)6 min；測(cè)定樣品吸光度（734 nm），并根據(jù)式（2）計(jì)算。

式中：A樣品為灰樹花溶液體系反應(yīng)后的吸光度；A對(duì)照為50 μL樣品加入150 μL PBS的背景吸光度；A空白為用PBS取代灰樹花多糖的陰性對(duì)照吸光度。

1.3.2.3 羥自由基清除率的測(cè)定。

參考羥自由基清除法[12]。參照1.3.2.1小節(jié)配制灰樹花多糖及VC溶液體系，體積均為1 mL，其中VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照組；依次加入0.5 mL FeSO4、0.35 mL H2O2后混勻并在37 ℃條件下孵育10 min；加入0.15 mL水楊酸（20 mmol/L）混勻并在37 ℃條件下反應(yīng)30 min；測(cè)定樣品吸光度（562 nm），并根據(jù)式（3）計(jì)算。

式中：A樣品為灰樹花溶液體系反應(yīng)后的吸光度；A對(duì)照為用去離子水取代水楊酸后的背景吸光度；A空白為用去離子水取代灰樹花多糖的陰性對(duì)照吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)中涉及吸光度的測(cè)定均采用4組平行試驗(yàn)并求取平均值。采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，采用SPSS 26進(jìn)行顯著性分析，采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行IC50的計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花多糖得率

根據(jù)前期試驗(yàn)確定提取方案，精確稱取4種灰樹花粉末，各20 g，最終計(jì)算得到得率，如表1所示。D1多糖5.43%，D2多糖3.93%，X1多糖5.71%，X2多糖4.79%。提取得率按式（4）計(jì)算。

表1 灰樹花多糖得率及理化性質(zhì) 單位：%

提取得率=所得多糖質(zhì)量（g）/灰樹花粉末質(zhì)量（g）×100% （4）

2.2 灰樹花多糖理化性質(zhì)

根據(jù)灰樹花多糖樣品吸光度及回歸方程，計(jì)算得4種灰樹花多糖各自的還原糖含量、總糖含量和蛋白含量。從表1可以看出，不同種類灰樹花還原糖含量差異較小，說(shuō)明透析的效果基本相同，小分子量的低聚糖或者單糖已被除去，后續(xù)可用過(guò)柱純化或者其他方式進(jìn)一步得到精多糖。特別地，4種多糖的總糖含量差異較大，含量最高的為D1，其總糖含量達(dá)到72.88%，但是D2和X2灰樹花多糖的總糖含量較低，都不足50%，有可能是苯酚硫酸法的局限性，多糖中包含的不同的單糖在苯酚硫酸法反應(yīng)后顯色程度不一，張美等[13]關(guān)于三七多糖含量的測(cè)定試驗(yàn)表明除還原糖種類外，加熱時(shí)間、溫度、苯酚用量等因素同樣會(huì)影響體系吸光度，也有可能是其本身有較多的其他雜質(zhì)不易除去，這在粗多糖的提取研究中較為常見。此外，在D1多糖中未檢測(cè)到蛋白含量，說(shuō)明D1灰樹花本身的多糖含量較高且蛋白質(zhì)含量低，這與灰樹花品種以及生長(zhǎng)地區(qū)氣候條件息息相關(guān)，所以D1灰樹花適合得到較高產(chǎn)率及純度的灰樹花多糖。此外，雖然已用Sevag法反復(fù)多次純化其他多糖，但是仍有蛋白質(zhì)的殘留，這說(shuō)明通過(guò)Sevag法洗脫蛋白仍有改進(jìn)的空間，或是因?yàn)椴煌贩N灰樹花所含蛋白分子量差異較大，3 500 Da的透析袋對(duì)于其他3種灰樹花無(wú)法徹底除去蛋白，這有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。但是，相關(guān)試驗(yàn)表明Sevag法是除了三氯乙酸法以外蛋白清除率較高并且多糖損失較少的方法[14]。

2.3 灰樹花多糖抗氧化指標(biāo)綜合分析

由圖1可知，與其他3種多糖相比，D1多糖的自由基清除能力明顯較弱。4種灰樹花多糖對(duì)DPPH自由基的IC50分別為1.460±0.070（D1），0.500±0.050（D2），0.390±0.010（X1）和0.620±0.060 mg/mL（X2）。結(jié)果表明，4種灰樹花多糖均具有較好的DPPH自由基清除能力，相比之下D1多糖自由基清除能力弱于其他3種灰樹花多糖，4種多糖DPPH自由基清除能力從強(qiáng)到弱排序?yàn)閄1、D2、X2和D1。

圖1 灰樹花多糖對(duì)DPPH自由基清除作用

由圖2可知，質(zhì)量濃度0.5 mg/mL時(shí)X2多糖的自由基清除率與作為陽(yáng)性對(duì)照的VC相接近，其余3種多糖的清除率分別為51.89%（D2），71.62%（X1）和93.08%（D1）。在質(zhì)量濃度從0.5～2 mg/mL的范圍內(nèi)，自由基清除率隨濃度增加而增強(qiáng)的趨勢(shì)減緩。結(jié)果顯示，灰樹花多糖的IC50分別為0.430±0.010（D1），0.170±0.010（D2），0.270±0.007（X1）和0.160±0.004 mg/mL（X2），因此4種多糖ABTS自由基清除能力從強(qiáng)到弱排序?yàn)閄2、D2、X1和D1。

圖2 灰樹花多糖對(duì)ABTS自由基清除作用

由圖3可知，質(zhì)量濃度2 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率由高到低分別為70.43%（D2），68.90%（X1）、63.06%（X2）和43.57%（D1）。這說(shuō)明不同灰樹花多糖也具有一定的羥基自由基清除能力。進(jìn)一步計(jì)算其IC50，結(jié)果分別為2.810±0.569（D1），0.650±0.051（D2），1.070±0.025（X1）和1.420±0.282 mg/mL（X2），因此多糖抗氧化能力從強(qiáng)到弱排序?yàn)镈2、X1、X2和D1。這與DPPH自由基清除能力的結(jié)果相似，X1和D2和抗氧化能力較高，D1則最低。

圖3 灰樹花多糖對(duì)羥基自由基清除作用

由圖4可知，參與試驗(yàn)的4種灰樹花多糖在3種自由基清除指標(biāo)下的IC50值均較小，因此具有較強(qiáng)的抗氧化能力。DPPH自由基清除能力最強(qiáng)的是X1，其IC50為0.390±0.010 mg/mL；X2多糖對(duì)ABTS自由基有最佳的抑制能力，IC50為0.160±0.004 mg/mL；D2多糖對(duì)羥自由基抑制能力的IC50為0.650±0.051 mg/mL，是同組中抑制率最高的。由圖4可以直觀地看出：當(dāng)采用DPPH和OH-為指標(biāo)時(shí)，D2與X1多糖的IC50小于同組的D1與X2多糖；僅當(dāng)采用ABTS為指標(biāo)時(shí)，X2多糖效果會(huì)優(yōu)于X1多糖，但與D2多糖相比無(wú)顯著性差異。因此綜合3種抗氧化指標(biāo)，D2及X1灰樹花多糖的抗氧化能力最為理想。關(guān)于灰樹花多糖結(jié)構(gòu)與其生物活性間關(guān)聯(lián)的研究較少，張宗啟等[15]對(duì)其研究現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)得出，多糖生物活性與其聚合度、分子量、糖苷鍵類型、支鏈數(shù)等因素有關(guān)，以一種叫作FGFP-11的灰樹花雜多糖為例，它主要由α-（1→6）糖苷鍵和α-（1→3）糖苷鍵構(gòu)成，并被認(rèn)為具有較強(qiáng)的抗氧化性；除此之外，灰樹花多糖的分子量、分子結(jié)構(gòu)、生物活性也受品種、處理手段等多種因素的影響。結(jié)合表2與圖4可以看出，D1灰樹花多糖的總糖含量最高，但經(jīng)過(guò)脫蛋白后未檢測(cè)出蛋白含量，而其余3種多糖中均有檢測(cè)出。有研究表明灰樹花多糖提取副產(chǎn)物中蛋白也具有抗氧化性[16]。因此，D1多糖抗氧化活性最低，除了可能與本身分子結(jié)構(gòu)有關(guān)以外，還可能是因?yàn)橥耆摮哂幸欢寡趸阅艿牡鞍住?/p>

圖4 灰樹花多糖不同抗氧化指標(biāo)下的IC50

3 結(jié)論

主要從多糖提取率、抗氧化性這2個(gè)方面對(duì)D1，D2，X1和X2這4種不同產(chǎn)地和品種的灰樹花進(jìn)行比較。經(jīng)過(guò)水提醇沉、Sevag除蛋白、透析等操作獲得灰樹花多糖。其中，福建南平大朵灰樹花（D1）不僅提取率較高，還具有總糖含量高、蛋白洗脫效果好的特點(diǎn)，作為原料對(duì)進(jìn)一步的多糖純化制備有著天然優(yōu)勢(shì)。在抗氧化性方面，浙江慶元大朵（D2）與福建南平小朵（X1）的多糖對(duì)DPPH、ABTS及羥基自由基的清除能力均較為優(yōu)秀，具有被開發(fā)成安全性高的天然抗氧化劑的潛力。因此，福建南平出產(chǎn)的2種灰樹花在多糖含量以及抗氧化活性方面各具優(yōu)勢(shì)。為最大程度地開發(fā)利用灰樹花資源，在進(jìn)一步試驗(yàn)中需要對(duì)福建南平出產(chǎn)的灰樹花進(jìn)行品種鑒定以及系統(tǒng)學(xué)命名。此外，還需要對(duì)其灰樹花多糖進(jìn)行色譜純化以獲取精多糖，并針對(duì)精多糖進(jìn)一步進(jìn)行生物活性評(píng)價(jià)。