紀(jì)穎，艾連中，邢明霞，謝凡，賴?guó)P羲

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海，200093)

乳鐵蛋白(lactoferrin, LF)是一鐵結(jié)合的糖化球蛋白，人體重要的免疫蛋白之一，具有多樣化的體內(nèi)抑菌、免疫調(diào)節(jié)和各種生理功能，其免疫機(jī)理主要針對(duì)病原微生物的感染、炎癥(如關(guān)節(jié)炎、過(guò)敏)以及神經(jīng)退化性疾病等所作的應(yīng)答，樞軸式調(diào)節(jié)先天和后天適應(yīng)性免疫系統(tǒng)、雙向調(diào)節(jié)促發(fā)炎和抗發(fā)炎以達(dá)到免疫穩(wěn)態(tài)[1-3]。常見(jiàn)的LF依來(lái)源可分為人乳鐵蛋白(human lactoferrin, hLF)、牛乳鐵蛋白(bovine lactoferrin, bLF)、豬乳鐵蛋白(porcine lactoferrin, pLF)、羊乳鐵蛋白(sheep lactoferrin, sLF)以及重組人乳鐵蛋白(recombinant human lactoferrin, rhLF)等。bLF作為熱門的功能性食品成分，主要添加于嬰幼兒配方奶粉及固體飲料中，用于強(qiáng)化機(jī)體免疫能力。目前富含bLF的產(chǎn)品大都為進(jìn)口，且非食品領(lǐng)域的應(yīng)用尚少，尚有很大的發(fā)展?jié)摿Α＝陙?lái)有關(guān)bLF活性保留率與應(yīng)用的相關(guān)技術(shù)研究和專利漸趨豐富，包括制備工藝技術(shù)與基于特定活性機(jī)理的產(chǎn)品研發(fā)等，值得總結(jié)歸納。

1 牛乳鐵蛋白的來(lái)源及分子特性

牛乳鐵蛋白(bLF)存在于牛的乳汁以及外分泌物中(包括唾液、黏膜等)，乳汁的LF含量較高[1]。牛乳中bLF含量為0.03～1.36 g/L，其中脫脂牛乳的bLF含量約0.5 g/L[4-6]，bLF的含量會(huì)隨哺乳期的延長(zhǎng)而降低。乳鐵蛋白的分子質(zhì)量大約為75～80 kDa，約有690～700個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成了bLF的初級(jí)結(jié)構(gòu)[3,7]，等電點(diǎn)在9.3～9.5[4]。根據(jù)RCSB PDB(Research Collaboratory for Structural Bioinformat-ics Protein Date Bank, RCSB PDB)公共數(shù)據(jù)庫(kù)LF的二維結(jié)構(gòu)訊息，經(jīng)PyMOL軟件處理所得bLF的三維結(jié)構(gòu)(圖1，PDB代碼=1BLF)，可知bLF主要由α-螺旋和β-折疊構(gòu)成的三維結(jié)構(gòu)，包括2個(gè)葉(C葉和N葉)，形狀類似于兩片銀杏葉，每個(gè)葉中心都能結(jié)合一個(gè)鐵離子。不同來(lái)源的牛乳鐵蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本相似，但三級(jí)結(jié)構(gòu)略微不同，bLF結(jié)構(gòu)的差異使其具有不同的鐵飽和度，鐵飽和度會(huì)影響bLF的穩(wěn)定性，如：鐵飽和型LF(holo-lactoferrin, holo-LF)的熱穩(wěn)定性高于缺鐵型LF(apo-lactoferrin, apo-LF)，故bLF的活性和穩(wěn)定性隨牛奶的來(lái)源而異，主要與鐵飽和度有關(guān)[8]。在相同的巴式殺菌條件(65～75 ℃加熱60 s)下，中國(guó)牛奶bLF活性損失率(35%～43%)高于新西蘭牛奶bLF(10%～33%)，因中國(guó)牛奶中bLF的鐵飽和度(11.6%)為新西蘭牛奶bLF(21.9%)的一半[9]。綜上，生產(chǎn)加工過(guò)程中選擇bLF鐵飽和度高的原料有助于加工穩(wěn)定性。

2 生產(chǎn)制造工藝

2.1 生產(chǎn)工藝流程與技術(shù)創(chuàng)新

bLF的生產(chǎn)工藝流程，以未殺菌的原料牛乳經(jīng)離心脫脂所得的脫脂乳為例，經(jīng)三大工程階段以生產(chǎn)bLF：調(diào)整、陽(yáng)離子色譜分離純化和配方粉末，如圖2所示。

圖2 自牛乳分離牛乳鐵蛋白的生產(chǎn)工藝流程與創(chuàng)新技術(shù)Fig.2 Production process flow and innovative techniques for isolating bLF from bovine milk

第一階段調(diào)整工程的目的是去除酪蛋白和大顆粒雜質(zhì)，單元操作包括：HCl溶液調(diào)pH 4.6沉淀并離心去除酪蛋白、上清液pH中和至6.5并冷卻至8 ℃、預(yù)過(guò)濾或微過(guò)濾除去雜質(zhì)。其中，去除酪蛋白的操作條件可以0.1～1 mol/L HCl溶液酸化至pH 4.6(酪蛋白的等電點(diǎn))使酪蛋白凝集后，以4 000～5 000×g、15～20 min離心去除酪蛋白沉淀物[6]。上清液進(jìn)行層析前的預(yù)過(guò)濾，可使用1.2～1.4 μm的濾膜微過(guò)濾或先用5 μm的濾膜初濾再用1 μm的濾膜微過(guò)濾[10]，所得濾液含有乳清蛋白、bLF、乳過(guò)氧化物酶(lactoperoxidase, LPOase)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)及免疫球蛋白G (immunoglobulin G, IgG)等。

第二階段層析工程的目的在于分離純化上述各種功能性蛋白質(zhì)，單元操作包括：強(qiáng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附性色譜分離操作，將含各種功能性蛋白質(zhì)的濾液加載色譜管柱中，依序以水洗出色譜柱中的緩沖液雜質(zhì)和乳清蛋白等未吸附的物質(zhì)、以低濃度鹽溶液(16 g/L NaCl溶液)洗脫出低正電荷的蛋白質(zhì)(LPOase、BSA和IgG)、及以高濃度鹽溶液(100 g/L NaCl溶液)洗脫出高正電荷的bLF。工業(yè)上都采用磺酸化的強(qiáng)陽(yáng)離子瓊脂糖大孔樹(shù)脂凝膠(SP Sepharose Big Bead，粒徑100～300 μm)進(jìn)行分離純化操作，具有高效分離的優(yōu)點(diǎn)，適用于大規(guī)模生產(chǎn)[10]。

第三階段配方粉末工程的目的在于純化bLF、巴氏殺菌和干燥粉末化，可同時(shí)進(jìn)行食品配方操作以生產(chǎn)復(fù)配粉末食品，單元操作包括：bLF溶液進(jìn)行超濾濃縮、透析脫鹽、巴氏殺菌、最后干燥成bLF干燥粉末。其中，超濾濃縮可以使用30 kDa或50 kDa的超濾膜；巴氏殺菌的條件為73.5 ℃ 18 s或75 ℃ 15 s；干燥可采用冷凍干燥或噴霧干燥。所得bLF干燥粉末純度為80%～96%，蛋白質(zhì)含量>94%[10]，bLF無(wú)明顯變性、具有高生物活性。

近年來(lái)bLF的分離純化工藝有許多面向創(chuàng)新的進(jìn)展，都是基于上述強(qiáng)陽(yáng)離子色譜分離操作加以改良，組合超過(guò)濾技術(shù)或多管柱化以提高產(chǎn)能或效率、bLF純度或回收率。特將有關(guān)的具有規(guī)模生產(chǎn)潛力的新型分離技術(shù)進(jìn)行比較，見(jiàn)表1，說(shuō)明多種應(yīng)用高新技術(shù)或新型材料以優(yōu)化bLF分離純化效果的色譜條件、效果和特點(diǎn)。已商業(yè)化用于中試規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)有4種(后3種均為膜吸附色譜法)：(1)以Streamline SP瓊脂糖凝膠為吸附介質(zhì)的模擬移動(dòng)床技術(shù)，將傳統(tǒng)的間歇色譜轉(zhuǎn)變?yōu)檫B續(xù)色譜技術(shù)(20柱)，1.25 mol/L NaCl溶液快速分離bLF，使蛋白質(zhì)純化過(guò)程中緩沖液消耗減少了4.3倍，bLF回收率高達(dá)105%，純度大于90%[11]。(2)橫流微濾(0.2 μm)和磺酸化的強(qiáng)陽(yáng)離子交換層析相結(jié)合，三步洗脫(0.1、0.175、1.0 mol/L NaCl)選擇性分離bLF，經(jīng)過(guò)醋酸纖維素膜(分子質(zhì)量切molecular-weight cut-off, MWCO=30 kDa)濃縮和冷凍干燥，bLF純度約95%，該方法分離速度快，適用于工業(yè)生產(chǎn)[12]。(3)陽(yáng)離子混合基質(zhì)膜的膜吸附技術(shù)，將SP-瓊脂糖凝膠FF(fast flow)混合在乙烯-乙烯醇聚合物基膜(孔隙率72%)，進(jìn)行陽(yáng)離子交換層析兼超濾功能的分離純化工程，bLF回收率可提高到88%，且具有操作簡(jiǎn)單、容易規(guī)?；焦I(yè)生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)[13]。(4)徑向流膜吸附色譜法，采用陰離子交換色譜和陽(yáng)離子交換色譜相結(jié)合的方式，可分離各種功能性蛋白質(zhì)，所得產(chǎn)物的bLF純度89%，但bLF回收率僅有38.6%，尚須進(jìn)一步改良工藝以提高bLF回收率[14]。

表1 各種分離純化工藝條件對(duì)牛乳鐵蛋白純度及回收率的影響Table 1 Effects of various separation and purification process conditions on the purity and recovery rate of bovine lactoferrin

另外，F(xiàn)e3O4磁性納米粒子靶向性磁吸法和超濾-膨脹床色譜法為仍在實(shí)驗(yàn)室研究階段的創(chuàng)新技術(shù)。磁性納米顆粒由于具有比表面積大、易于收集和分散性好等優(yōu)點(diǎn)而適用于蛋白質(zhì)分離，而刀豆蛋白A被認(rèn)為是從乳清中提純bLF的理想配體。以鐵和亞鐵為原料通過(guò)共沉淀法制備Fe3O4磁性納米粒子，并將刀豆蛋白A作為磁性納米吸附劑吸附在磁性納米粒子上，用于針對(duì)bLF的分離純化。Fe3O4磁性納米粒子靶向性磁吸法所得bLF產(chǎn)物純度高達(dá)93%，回收率高達(dá)99.99%[15]，是最新穎且高效的分離純化技術(shù)，具有精準(zhǔn)回收、高特異性、幾乎零損失率、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，已建立標(biāo)準(zhǔn)操作流程，但目前受限于Fe3O4磁性納米粒子的量產(chǎn)問(wèn)題而尚未能規(guī)模化應(yīng)用于bLF的工業(yè)生產(chǎn)上。而超濾-膨脹床色譜法是結(jié)合2種分離操作的簡(jiǎn)化流程，在分離過(guò)程中減小樣品體積是降低單位生產(chǎn)成本的關(guān)鍵，超濾使bLF的進(jìn)樣體積減少到原來(lái)的1/10，增加進(jìn)樣bLF濃度，減少bLF分離純化的時(shí)間成本，而膨脹床色譜法解決了超濾濃縮導(dǎo)致的液體黏度高的問(wèn)題，所得bLF產(chǎn)物純度可高達(dá)92.7%且回收率達(dá)87%，但缺點(diǎn)是原料消耗率高且未回收bLF以外的功能性蛋白質(zhì)[16]。

2.2 影響因子

來(lái)源、加工過(guò)程中加熱、酸堿處理(pH值)、發(fā)酵、酶的存在都會(huì)影響乳鐵蛋白的活性和穩(wěn)定性，因此bLF在應(yīng)用過(guò)程中必須考慮相關(guān)因素的影響。

2.2.1 來(lái)源的影響

bLF的活性和穩(wěn)定性隨牛奶來(lái)源而異，在65～75℃加熱60 s下，新西蘭牛奶中bLF的活性損失率(10%～33%)低于中國(guó)牛奶(35%～43%)。2種牛奶中bLF的熱穩(wěn)定性的差異可能與bLF鐵飽和度水平有關(guān)，因中國(guó)牛奶中的鐵飽和度(11.6%)約為新西蘭牛奶(21.9%)的一半[9]。從熱失活的D值(90%bLF失活所需時(shí)間)可以看出，holo-LF的熱穩(wěn)定性大約為apo-LF的3倍[17]。故提高bLF鐵飽和度有助于提高其熱穩(wěn)定性，生產(chǎn)加工過(guò)程中對(duì)原料應(yīng)選擇鐵飽和度高的bLF。

2.2.2 熱處理的影響

bLF的結(jié)構(gòu)和活性受加熱溫度和時(shí)間影響。加熱會(huì)促使bLF結(jié)構(gòu)展開(kāi)并由二硫鍵介導(dǎo)形成分子間蛋白質(zhì)聚集體，造成變性與多種活性的損失，如抑菌活性降低[18]、表面疏水性增加[19]、鐵結(jié)合能力降低[20]等。WAZED等[17]發(fā)現(xiàn)bLF強(qiáng)化的即食嬰兒配方奶粉在高溫短時(shí)(high temperature short time, HTST)巴氏殺菌溫度71.2℃下，處理57 s時(shí)bLF的保留率為91.9%，損失速率k為8.7×10-4s-1，D值為44.1 min，Z值(降一個(gè)D值對(duì)數(shù)值所需增加的溫度)為17.37 ℃；其D值介于apo-LF(D=21.7 min)和holo-LF(D=75 min)中間。此外，含bLF的配方產(chǎn)品最終通過(guò)冷凍干燥或噴霧干燥將其轉(zhuǎn)化為粉末，噴霧干燥(進(jìn)口溫度為180 ℃，出口溫度為95 ℃)與冷凍干燥(-30 ℃干燥24 h、0 ℃干燥12 h、20 ℃干燥6 h)條件下bLF的結(jié)構(gòu)和活性不受影響[8]。由上可得干燥時(shí)間(t)-溫度(T)關(guān)系線為：t=-0.363×T+111.99,R2=0.994，其中t單位為h，T單位為K，R2為決定系數(shù)。因此，熱巴氏殺菌條件比干燥條件更值得關(guān)注，bLF在生產(chǎn)制備過(guò)程中盡量選擇較低的熱巴氏處理溫度并縮短熱處理時(shí)間，才能保留較多的活性。

2.2.3 pH值的影響

bLF的抗菌活性隨pH而異，bLF在80～130 ℃加熱5～60 min，pH 2.0和3.0下bLF的抑菌效果優(yōu)于pH 1.0和4.0[21]。通過(guò)測(cè)定bLF與鐵的結(jié)合度，發(fā)現(xiàn)bLF的變性溫度在pH 7.0下為70 ℃，但pH降至3.0時(shí)為39 ℃，此現(xiàn)象與pH值7.0時(shí)bLF與鐵的結(jié)合度最大有關(guān)，故bLF在pH 7.0的穩(wěn)定性最高[22]。雖然中酸性條件下均有利于保護(hù)bLF的活性，但生產(chǎn)中仍須選擇最適pH值，以滿足不同產(chǎn)品的需求。

2.2.4 生產(chǎn)工藝因素的影響

除了以上常見(jiàn)的影響因子，還應(yīng)考慮添加bLF的產(chǎn)品其生產(chǎn)工藝是否對(duì)bLF的結(jié)構(gòu)和活性產(chǎn)生影響，如發(fā)酵工藝。研究表明牛乳添加holo-LF或天然乳鐵蛋白后再進(jìn)行酸奶發(fā)酵，bLF穩(wěn)定性沒(méi)有顯著性變化[8]，添加bLF對(duì)酸奶的物理性質(zhì)影響較小，因此酸奶可以作為bLF的載體，開(kāi)發(fā)bLF相關(guān)的功能產(chǎn)品。

此外，當(dāng)添加bLF的產(chǎn)品其生產(chǎn)過(guò)程中需要添加酶時(shí)，也須考慮酶對(duì)bLF結(jié)構(gòu)和活性的影響，現(xiàn)有研究表明bLF被胃蛋白酶水解成乳鐵蛋白素或乳鐵蛋白抗菌肽時(shí)，其抗菌、抗病毒的能力會(huì)增強(qiáng)[2]，但在實(shí)際生產(chǎn)中，還需要考慮bLF水解產(chǎn)物是否會(huì)被生產(chǎn)中的其他物質(zhì)或工藝條件影響。

2.3 高新技術(shù)與保護(hù)劑的應(yīng)用現(xiàn)況

除了上述加工因素和鐵飽和度的調(diào)控外，提高bLF穩(wěn)定性或降低熱破壞以保留bLF活性也可利用高新技術(shù)或復(fù)配食品添加物來(lái)改善，策略包括：高壓處理、歐姆加熱和脈沖電場(chǎng)處理、保護(hù)劑(鹽、多糖膠體)的使用。

2.3.1 高壓處理的應(yīng)用

在替代傳統(tǒng)的熱殺菌技術(shù)的高新非熱殺菌技術(shù)中，高壓加工技術(shù)可替代熱巴氏殺菌處理，保留bLF更多活性，深具應(yīng)用潛力。在高壓加工時(shí)，所采用的壓力是影響bLF活性的關(guān)鍵因素。bLF的保留率會(huì)因?yàn)閴毫Φ脑黾佣档?，例如室溫下bLF的保留率以300～500 MPa處理5～20 min時(shí)為70%～83%，而600 MPa處理1 min時(shí)則降為66%[17]。此外，高壓處理30 min下，bLF的水溶解度隨著壓力的增加(0.1～700 MPa)呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在最適壓力400 MPa下，bLF達(dá)到最大溶解度、乳化性和發(fā)泡能力[23]。綜上，適當(dāng)?shù)母邏禾幚?300～500 MPa)可提高bLF的保留率并改善其功能特性，在選擇壓力時(shí)要避免壓力過(guò)高或加壓時(shí)間過(guò)長(zhǎng)造成bLF活性的損失。

2.3.2 歐姆加熱和脈沖電場(chǎng)的應(yīng)用

歐姆加熱處理是另一種新穎的工藝，可替代熱巴式殺菌應(yīng)用于bLF加工上。DE FIGUEIREDO等[24]將歐姆加熱技術(shù)應(yīng)用到bLF，發(fā)現(xiàn)針對(duì)bLF溶液，傳統(tǒng)加熱處理(90℃, 30 min)所得bLF粒徑約為76.0 nm，而同等溫度時(shí)間的歐姆加熱所得粒徑為68.7 nm，顯示歐姆加熱處理導(dǎo)致的bLF聚集程度低于傳統(tǒng)加熱者。針對(duì)bLF溶液，脈沖電場(chǎng)處理(60 ℃、電壓35 kV/cm、脈沖時(shí)間19.2 μs)的殺菌效果與熱巴氏殺菌處理(63 ℃、30 min)的效果一樣[25]。因此，為了防止熱巴式殺菌對(duì)bLF活性的破壞，可考慮同等殺菌效果的歐姆加熱或脈沖電場(chǎng)處理。

2.3.3 保護(hù)劑(鹽、多糖膠體)的應(yīng)用

除了工藝上的改進(jìn)，在加工過(guò)程中加入一定量的保護(hù)劑，也可保護(hù)bLF，減少損失。LIU等[26]在研究bLF的過(guò)程中加入了鹽離子，發(fā)現(xiàn)bLF-多酚復(fù)合物的聚集程度隨鹽離子濃度(0～0.2 mol/L)的增加先降低后增加，適量添加NaCl溶液(0.1 mol/L)可有效減少bLF-多酚復(fù)合物因加熱(90 ℃, 20 min)導(dǎo)致的聚集程度。特定多糖膠也可作為bLF的保護(hù)劑，減低bLF在熱加工過(guò)程中的變性程度，例如褐藻酸鈉可通過(guò)靜電吸附作用與bLF形成可溶性bLF-褐藻酸鈉復(fù)合物，抑制了bLF的加熱變性和聚集；且褐藻酸鈉的濃度越高，bLF的熱穩(wěn)定性越好，質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.04%褐藻酸鈉使bLF二級(jí)結(jié)構(gòu)維持在80%以上[27]。然而，尚未見(jiàn)糖醇類(常用于蛋白質(zhì)抗凍保護(hù)劑)應(yīng)用于保護(hù)bLF的相關(guān)研究。綜上，鹽、多糖膠體的靜電包埋作用對(duì)bLF有保護(hù)效果，多糖膠體和糖醇類相當(dāng)多樣化，值得未來(lái)深入研究，以歸納出最適的多糖膠體或糖醇類保護(hù)劑及其優(yōu)化的制備條件，有助于強(qiáng)化bLF的工業(yè)應(yīng)用。綜上，將目前已知維持乳鐵蛋白的高穩(wěn)定性與提高功能性的相關(guān)工藝流程整合于圖3。

圖3 提高乳鐵蛋白穩(wěn)定性與功能性的工藝整合流程Fig.3 Integration flow chart of processes for increasing stability and functionality of lactoferrin

3 乳鐵蛋白相關(guān)產(chǎn)品的研發(fā)與應(yīng)用

圖4是近十年來(lái)有關(guān)bLF在食品應(yīng)用中針對(duì)不同人群的知識(shí)產(chǎn)權(quán)分布，國(guó)外對(duì)bLF的研究論文和專利數(shù)量皆遠(yuǎn)高于國(guó)內(nèi)；整體上，以bLF應(yīng)用于嬰幼兒配方奶粉的研究主題的論文和專利數(shù)量最多(共約450篇)，高于病患用疾病輔助品的研究和專利(共約260篇)，遠(yuǎn)高于兒童和成年人用營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑的研究與專利(共60～100篇)。老人用食品的研究和專利數(shù)量仍相當(dāng)少。綜上，bLF相關(guān)的研究論文與專利數(shù)量仍相當(dāng)有限；研究論文和專利數(shù)量順序依次為：嬰兒>病患>兒童和成年>老人，顯示針對(duì)老人、兒童和成人相關(guān)的bLF產(chǎn)品的研究有很大的研發(fā)空間，值得投入發(fā)展。由于2015年以前有關(guān)含乳鐵蛋白食品的研發(fā)大都著重在配方奶粉和乳酸菌飲料的制備、生理功能與穩(wěn)定性，已充分證實(shí)其具有提高免疫力、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡及抗菌功能。因此，本綜述特針對(duì)近5年(2017～2021年)新專利性研究的進(jìn)展、有關(guān)新發(fā)現(xiàn)的多樣生理功能，摘要說(shuō)明如下。

圖4 不同人群的乳鐵蛋白研究分布Fig.4 Distribution of studies on lactoferrin-related food products for different populations

3.1 乳鐵蛋白在食品中的使用量

2000年，bLF被美國(guó)食品和藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration, FDA)批準(zhǔn)為公認(rèn)的安全物質(zhì)，可用于不同的食品類別。歐洲委員會(huì)于2012年批準(zhǔn)在特定食物中添加bLF以強(qiáng)化健康功能。同年，中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)(下稱“衛(wèi)健委”)發(fā)布的GB 14880—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》將乳鐵蛋白列入食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑行列。表2比較了中國(guó)衛(wèi)健委、美國(guó)FDA和歐盟委員會(huì)批準(zhǔn)的食品中bLF的最大使用量[8]。中國(guó)目前規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)只涉及bLF應(yīng)用到嬰幼兒食品、風(fēng)味發(fā)酵乳、調(diào)制乳以及含乳飲料，bLF最大使用量皆為100 mg/100 g。美國(guó)FDA允許bLF用于嬰兒配方奶粉、奶粉、風(fēng)味發(fā)酵乳、牛奶甜點(diǎn)及口香糖中，bLF使用量在100～400 mg/100 g。歐盟允許使用的食品范圍更廣，除了上述食品外，還包括不含酒精的飲料、糖、蛋糕和糕點(diǎn)以及奶酪基產(chǎn)品等，bLF用量范圍在80～3 000 mg/100 g。各地區(qū)對(duì)bLF在特定食品中的最大用量的規(guī)范，與其膳食居民的飲食習(xí)慣有關(guān)，臨床上每人每日攝取0.1～4.5 g bLF是安全無(wú)毒的(FDA)，上述為產(chǎn)品研發(fā)者提供重要的bLF用量依據(jù)。

3.2 乳制品與機(jī)能飲料

乳鐵蛋白最典型的應(yīng)用方式是作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑添加到嬰幼兒配方奶粉、酸奶等乳制品中，以強(qiáng)化提升免疫力和調(diào)整腸道菌群穩(wěn)態(tài)的功效，同時(shí)有助于嬰幼兒神經(jīng)發(fā)育與預(yù)防感染。臨床研究發(fā)現(xiàn)，嬰兒食用含0.6 g/L bLF的配方奶粉約365 d后神經(jīng)發(fā)育狀況完善，545 d后腹瀉和呼吸相關(guān)不良事件顯著減少[28]。奶粉配方中添加bLF (76 mg/100 g)可有效降低貧血嬰兒腹瀉和呼吸道感染的發(fā)病率[29]。這些研究表明強(qiáng)化bLF的嬰兒配方奶粉可為嬰幼兒提供功能性蛋白質(zhì)和更快的能量，降低疾病發(fā)生率。此外，bLF在功能性飲料配方中的研究進(jìn)展，如王春維等[30]將bLF(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05%～0.6%)與高甲氧基果膠、維生素E、中鏈甘油三酸酯和魚(yú)油等功能性物質(zhì)制備成粒徑小(400 nm)、溶液分布均一的速能飲品，能儲(chǔ)存100 d以上不會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象。此為功能性蛋白質(zhì)飲料的研發(fā)提供創(chuàng)新思維。由于國(guó)內(nèi)bLF相關(guān)的機(jī)能性飲料較少，可能受限于bLF的生產(chǎn)成本和穩(wěn)定性，亟待解決相關(guān)問(wèn)題，以促進(jìn)更多的相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)，尤其是疾病患者所需的特醫(yī)類飲料。

表2 官方核準(zhǔn)的牛乳鐵蛋白應(yīng)用于食品中預(yù)期用途和最大使用量 單位：mg/100 g

3.3 輔助疾病預(yù)防的特醫(yī)食品

3.3.1 在提升免疫相關(guān)疾病中的應(yīng)用潛力

劉寧等[31]發(fā)明了一種針對(duì)提升6～12個(gè)月齡嬰兒免疫力的營(yíng)養(yǎng)配方米粉，配方中含有bLF、磷脂、枸杞粉等多種提升免疫力的成分，米粉沖調(diào)性好且不易結(jié)塊，有益于嬰幼兒的消化吸收，在滿足嬰幼兒基本營(yíng)養(yǎng)需求的同時(shí)，解決了嬰兒免疫力低下的問(wèn)題。bLF在增強(qiáng)免疫力方面有一定的市場(chǎng)，可作為食品營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑添加到除奶粉以外的食品配方中增強(qiáng)產(chǎn)品免疫功效。

3.3.2 在促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)中的應(yīng)用潛力

bLF及其水解產(chǎn)物有助于促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)，主要通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化來(lái)實(shí)現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)口服bLF(100 mg/kg)可以代替維生素D，有效地促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和分化，效果是維生素D的2～3倍[32]。ZHANG等[33]也發(fā)現(xiàn)bLF(鐵飽和度17.9%)可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，質(zhì)量濃度為100 μg/mL的效果最好。bLF是潛在的生物活性食品補(bǔ)充劑，預(yù)防相關(guān)疾病。

3.3.3 在預(yù)防治療阿茲海默病中的應(yīng)用潛力

LF具有緩解與衰老相關(guān)的認(rèn)知衰退方面的潛力，口服bLF可預(yù)防阿爾茨海默病(alzheimer disease, AD)。MOHAMED等[34]闡明了LF通過(guò)影響AD病理中炎癥和氧化應(yīng)激的關(guān)鍵因子，減輕AD病理反應(yīng)和認(rèn)知能力下降。AGWA等[35]利用腦內(nèi)皮細(xì)胞存在LF受體，制備了由bLF與共軛亞油酸(CLA)組成、粒徑約53 nm的納米膠束，將CLA靶向輸送到腦組織中，對(duì)CLA的包封率達(dá)到76.0%，載藥量為8.7%，有效清除AD進(jìn)展過(guò)程中產(chǎn)生的自由基。因此，含bLF口服液可發(fā)展為特醫(yī)類食品飲料，具有預(yù)防AD的潛力。

3.4 口腔保健食品和清潔用品

bLF在口腔保健方面具有應(yīng)用潛力，近5年來(lái)國(guó)內(nèi)外的最新專利如表3所示，共有5項(xiàng)發(fā)明專利，其一為添加了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%～5% bLF的半邊蓮抗口腔幽門螺桿菌口腔噴劑，操作簡(jiǎn)單且口腔幽門螺桿菌去除率達(dá)到90%[36]。其二為含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1% bLF的口腔菌叢改善劑應(yīng)用于洗口劑時(shí)，可有效抑制口腔病原菌和口臭菌的生長(zhǎng)，改善口腔菌相[37]。另外，一種含有bLF(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%～1% )能夠緩解口干癥、牙齦炎和去除口臭的牙膏，有效率達(dá)30%，還能減少牙齦炎相關(guān)細(xì)菌，減少率在25%以上[38]。此外，一種口腔潰瘍膜劑，放入口中后能緊密黏附在口腔內(nèi)表面，膜劑在口腔內(nèi)的溶解時(shí)間是商品口腔膜劑的3～5倍，治療口腔潰瘍效果較好[39]。國(guó)外最新一項(xiàng)關(guān)于bLF的專利發(fā)現(xiàn)，bLF (質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% )與SiO2的復(fù)合物能夠維持抗氧化和抗菌效果，時(shí)效長(zhǎng)達(dá)20 d[40]。目前市場(chǎng)上已有添加bLF的口腔清潔產(chǎn)品，如DR.Wolff’s Biorepair牙膏和漱口水、Bluem口氣清新劑等，有緩解口干癥、預(yù)防牙周炎等功效。bLF在口腔保健方面有廣闊的應(yīng)用市場(chǎng)，然而尚缺國(guó)內(nèi)自主品牌的產(chǎn)品，值得國(guó)人投入研發(fā)基于大健康政策與適合國(guó)人體質(zhì)與特定健康目的的產(chǎn)品。

表3 bLF在口腔健康管理中的應(yīng)用專利Table 3 Application patent of bovine lactoferrin in oral health management

4 總結(jié)

綜上，LF是機(jī)體內(nèi)非常重要的多功能活性物質(zhì)，兼具免疫活性與廣譜抑菌性?？捎糜诖龠M(jìn)并平衡免疫系統(tǒng)、調(diào)整腸道功能的機(jī)能食品或飲料，也具有應(yīng)用于特醫(yī)食品以輔助治療病源微生物源疾病的潛力，同時(shí)可作為抗菌藥物的佐劑，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛且深具商業(yè)價(jià)值。綜合研發(fā)與應(yīng)用的最新現(xiàn)況，bLF在多項(xiàng)領(lǐng)域最新授權(quán)的應(yīng)用研究專利，已有的研究成果和專利如圖5所示，表明LF(以bLF為主)在多項(xiàng)領(lǐng)域發(fā)揮著不同功效，如增強(qiáng)免疫、抗炎抗過(guò)敏、抑制微生物生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)菌群穩(wěn)態(tài)、預(yù)防并治療口腔問(wèn)題、輔助疾病治療等，因此bLF可應(yīng)用在乳制品、功能飲料、膳食輔助食品、口腔保健清潔品、藥物佐劑等多項(xiàng)領(lǐng)域，滿足人類對(duì)健康生活的追求。

圖5 乳鐵蛋白的功效及產(chǎn)品應(yīng)用圖譜Fig.5 Pictorial illustration for the functionality and product application of lactoferrin

5 展望

本文總結(jié)了加工過(guò)程中影響乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)和活性的因素(原料選擇、加熱、調(diào)節(jié)pH、發(fā)酵、高壓處理、電場(chǎng)處理和添加保護(hù)劑)以及最新授權(quán)的應(yīng)用研究專利。但目前國(guó)內(nèi)相關(guān)商品仍有限，可能是與bLF生產(chǎn)成本昂貴且在加工、貯存或售架過(guò)程中不穩(wěn)定有關(guān)。因此未來(lái)仍須針對(duì)高效量產(chǎn)活性bLF的技術(shù)持續(xù)創(chuàng)新，并針對(duì)各類bLF產(chǎn)品的配方與加工特性，深入研究有效的保護(hù)技術(shù)(例如納米或微膠囊包埋)、保護(hù)劑配方或佐劑，使bLF產(chǎn)品維持商業(yè)上所需的穩(wěn)定性、功能活性、長(zhǎng)效性以及控制釋放特性。此外，bLF配方在消化過(guò)程中的代謝組學(xué)特征也值得深入研究，闡明其體內(nèi)代謝物分布圖譜和功能機(jī)理，有助于含bLF特醫(yī)食品配方的研發(fā)。期望擴(kuò)展bLF應(yīng)用范疇，提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的商業(yè)價(jià)值，促進(jìn)社會(huì)大健康發(fā)展。