王家東，劉丹彤，王馨宇，馮智偉，謝三款，鄭宇，何靜

1(信陽農(nóng)林學(xué)院 制藥工程學(xué)院，河南 信陽，464000)2(天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實驗室，天津，300457)3(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 4(中糧油脂研發(fā)中心，天津，300452)

食醋是世界范圍內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的酸性調(diào)味品，中國的傳統(tǒng)食醋主要以谷物為原料，由多種微生物混合發(fā)酵而成[1-2]。發(fā)酵過程多種微生物共同作用代謝產(chǎn)生豐富的醇、酸、酯、醛、酮、酚和吡嗪等揮發(fā)性香氣成分[3-4]，以及不揮發(fā)酸、氨基酸等不揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共同賦予食醋特殊的風(fēng)味和口感[5-6]。不同的微生物在各個發(fā)酵階段的作用不盡相同，由曲霉、根霉等霉菌以及部分芽孢桿菌產(chǎn)生的淀粉酶完成了淀粉質(zhì)原料的糖化和液化，再由酵母菌進(jìn)行酒精發(fā)酵，最后由醋酸菌、乳酸菌等微生物完成醋酸發(fā)酵，在整個發(fā)酵體系中有上千種微生物存在[7-9]。

吡嗪類化合物不僅是食品中具有熏香的風(fēng)味物質(zhì)，還具有多種功能活性，其有利于健康和疾病治療的作用機(jī)制已經(jīng)得到較深入的研究，主要包括三甲基吡嗪和四甲基吡嗪等[10]。四甲基吡嗪廣泛存在于各種發(fā)酵類食品中，如食醋[11]、可可[12]、白酒[13]、奶酪[14]等，也是食醋中最重要的風(fēng)味物質(zhì)之一，山西老陳醋國家推薦標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》中將其定為重要的特征指標(biāo)之一。目前已知的四甲基吡嗪的合成途徑的主要前體化合物是乙偶姻，發(fā)酵過程微生物代謝產(chǎn)生乙偶姻，接著乙偶姻與環(huán)境中的NH4+或NH3通過非酶促反應(yīng)生成中間產(chǎn)物氨基丁酮，再與乙偶姻縮合生成四甲基吡嗪[15-16]。乙偶姻不僅是四甲基吡嗪的重要前體，其本身也是一種具有奶香的重要風(fēng)味物質(zhì)，其濃度對食醋的風(fēng)味也有重要影響[17-18]。LU等[19]采用宏基因組學(xué)的方法對食醋菌群在乙偶姻/雙乙酰代謝途徑中的分布進(jìn)行了分析，揭示了鎮(zhèn)江香醋中產(chǎn)乙偶姻的功能微生物組成及其代謝網(wǎng)絡(luò)。在醋酸發(fā)酵階段，乙偶姻的生物合成需要alsS和alsD基因分別編碼α-乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthetase，ALS)和α-乙酰乳酸脫羧酶(acetolactate decarboxylase，ALDC)[20-21]。多種細(xì)菌通過該途徑合成乙偶姻，如植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、枯草芽孢桿菌等[22]。銨是四甲基吡嗪合成的另一重要前體，同時，銨還是微生物的重要氮源以及微生物利用其他氮源進(jìn)入合成代謝途徑的關(guān)鍵中間體[19,23]。XIAO等[24]對食醋中的乙偶姻和銨進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)銨和乙偶姻均與四甲基吡嗪相關(guān)性顯著，四甲基吡嗪的含量對兩者具有高度依賴性。XIE等[25]通過宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，構(gòu)建了食醋固態(tài)發(fā)酵中銨的代謝網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果表明，在山西老陳醋發(fā)酵過程微生物通過增強(qiáng)氨基酸代謝從而增加細(xì)胞內(nèi)銨的生成，以響應(yīng)外界環(huán)境酸度的增加。除此之外，四甲基吡嗪還可以通過美拉德反應(yīng)和Strecker降解化學(xué)法合成，即α-氨基酸與還原糖形成Amadori重排產(chǎn)物，隨后發(fā)生重排形成α-二羰基化合物等還原酮，經(jīng)Strecker降解為α-氨基化合物，最后縮合成形成吡嗪類化合物[26-27]。然而，在對傳統(tǒng)食醋四甲基吡嗪形成規(guī)律研究中，大多只關(guān)注了乙偶姻形成途徑，而忽略了氨基酸等化合物對四甲基吡嗪形成的影響，以及四甲基吡嗪自身的降解等[19,23]，對食醋發(fā)酵過程四甲基吡嗪的形成規(guī)律認(rèn)識仍不全面。本研究分別從四甲基吡嗪的生成和降解2個方面對傳統(tǒng)食醋四甲基吡嗪形成規(guī)律進(jìn)行分析，進(jìn)一步分析比較了熏醅溫度對四甲基吡嗪以及其他風(fēng)味物質(zhì)積累的影響，加深了對傳統(tǒng)食醋四甲基吡嗪形成機(jī)制的認(rèn)識，有利于山西老陳醋產(chǎn)品品質(zhì)的提升和質(zhì)量控制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 樣品采集

山西老陳醋釀造全過程酒醪、醋醅等樣品均取自山西省太原市某山西老陳醋生產(chǎn)企業(yè)。

1.1.2 實驗試劑

NaCl、KH2PO4、K2HPO4、牛肉提取物、酵母提取物、乙酸、鹽酸，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；無水葡萄糖，天津市元力化工有限公司；蛋白胨，天津市天大化學(xué)試劑廠；酵母膏、吐溫-80，天津市化學(xué)試劑三廠；以上試劑均為分析純。四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品，色譜純，上海源葉生物科技有限公司。

1.1.3 實驗儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀、Agilent 6890N-5973型氣-質(zhì)聯(lián)用儀，美國Agilent儀器有限公司；S-433D氨基酸自動分析儀，德國SYKAM公司；CP1502電子分析天平，上海奧豪斯儀器有限公司；ZWF-110X系列溫控往復(fù)水浴恒溫振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 山西老陳醋發(fā)酵過程四甲基吡嗪及主要前體化合物變化規(guī)律分析

取適量酒醪于50 mL離心管中，8 000 r/min離心5 min，棄去沉淀，溶液保留備用。稱取醋醅或熏醅5 g于50 mL離心管中，加入45 mL去離子水，室溫振蕩3 h后，8 000 r/min離心5 min棄去殘渣，浸提液保留備用。分別分析樣品中四甲基吡嗪在整個發(fā)酵過程中的變化規(guī)律。

固態(tài)醋酸發(fā)酵階段是山西老陳醋四甲基吡嗪形成的主要階段，因此重點(diǎn)分析了食醋固態(tài)發(fā)酵過程乙偶姻、雙乙酰、氨基酸等主要前體化合物的變化規(guī)律。利用SIMCA 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析。

1.2.2 溫度和酸度對四甲基吡嗪穩(wěn)定性的影響

將300 g成熟醋醅裝入500 mL三角瓶中，檢測30、40、70、80、95、100 ℃條件下四甲基吡嗪及其主要前體化合物乙偶姻的濃度變化，分析溫度對四甲基吡嗪生成的影響。

配制200 mg/L的四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品水溶液，分析其在30、40、70、80、95、100 ℃條件下的濃度變化。在95 ℃加熱8 h后向三羥甲基丙烷(trimethylolpropane，TMP)水溶液中添加鹽酸、乙酸和等體積的去離子水，觀察相同加熱條件下不同酸環(huán)境對溶液中TMP含量的影響。

1.2.3 熏醅溫度對山西老陳醋風(fēng)味輪廓的影響

將300 g成熟醋醅裝入500 mL三角瓶中，利用鋁箔紙密封，設(shè)定恒溫箱溫度分別為85、95、105 ℃，熏醅時間為3 d，每天翻動醋醅進(jìn)行混勻，測定各實驗組熏醅前后醋醅主要理化指標(biāo)、四甲基吡嗪以及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及其濃度變化，確定最佳熏醅溫度。

由揮發(fā)性物質(zhì)根據(jù)文獻(xiàn)檢索的信息，將同一香氣屬性的揮發(fā)性物質(zhì)的相對香氣活性值相加，即為山西老陳醋該香氣屬性的得分，將各個香氣屬性的得分繪制成雷達(dá)圖，即為山西老陳醋的香氣輪[28]。

1.2.4 分析方法

四甲基吡嗪、乙偶姻和雙乙酰的定量分析采用HPLC法。樣品經(jīng)0.45 μm過濾后直接進(jìn)樣；色譜柱Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)；流動相為5 mmol/L H2SO4溶液；流動相流速0.6 mL/min；柱溫65 ℃；檢測器為示差檢測器。

揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析采用頂空固相微萃取-氣相色-質(zhì)譜聯(lián)用(head space-solid phase microextraction-GC-MS，HS-SPME-GC-MS)方法測定。取2 g樣品置于20 mL氣相玻璃瓶，加6 mL去離子水，2 g NaCl加入磁力攪拌器轉(zhuǎn)子，密封，插入固相微萃取頭，60 ℃水浴吸附40 min，磁力攪拌速度為100 r/min。將萃取頭放置在進(jìn)樣口(250 ℃)解吸5 min，運(yùn)行儀器。GC-MS檢測升溫程序：35 ℃維持1 min；1 ℃/min升溫至70 ℃，維持2 min；5 ℃/min升溫至230 ℃，維持2 min；15 ℃/min升溫至280 ℃，維持1 min。隔墊吹掃流量3 mL/min，模式為不分流，He載氣流速1 mL/min，色譜柱Agilent HP-5(30 m×250 μm×0.25 μm，Agilent，USA)。Agilent 6890 N系列氣相色譜儀和5973質(zhì)譜儀。MS掃描范圍為30～600。檢測器溫度220 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，捕獲方式為全掃描(從40～500m/z)。將得到的每個樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與NIST library對照相匹配，對匹配度>80(最大為100)的鑒定結(jié)果予以確認(rèn)，結(jié)合保留時間、質(zhì)譜圖譜、保留指數(shù)和相關(guān)文獻(xiàn)對其揮發(fā)性成分定性，利用圖譜庫工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，按峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，求得各樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)成分的相對含量。

浸提液中還原糖含量測定采用菲林法，總酯含量采用皂化返滴定法測定，銨的定量測定采用水楊酸法；氨基酸的定性定量采用氨基酸自動分析儀檢測[25, 28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 山西老陳醋發(fā)酵過程四甲基吡嗪及其前體化合物變化規(guī)律分析

山西老陳醋以高粱為主要原料進(jìn)行發(fā)酵生成，主要包括酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和熏醅3個階段，過程中四甲基吡嗪變化趨勢如圖1所示。

圖1 山西老陳醋釀造全過程四甲基吡嗪變化趨勢Fig.1 Changes in tetramethylpyrazine during the whole brewing process of Shanxi aged vinegar

酒精發(fā)酵階段檢測到少量四甲基吡嗪，含量在10-2g/kg高粱以下，隨后在醋酸發(fā)酵階段含量少量增加，在醋酸發(fā)酵末期達(dá)到(0.159±0.008) g/kg高粱。熏醅階段是四甲基吡嗪積累的主要階段，呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。熏醅第3天四甲基吡嗪的含量達(dá)到最大值，為(2.692±0.110) g/kg高粱，與熏醅之前相比提高了15.93倍。此外，在熏醅階段，還產(chǎn)生了少量三甲基吡嗪和二甲基吡嗪等吡嗪類化合物，其分別占吡嗪類化合物總相對含量的10%和2%。該研究結(jié)果與前期報道的山西老陳醋[29]、鎮(zhèn)江香醋[30]等的研究結(jié)果一致。在鎮(zhèn)江香醋醋酸發(fā)酵階段吡嗪類化合物總量隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸增加，其中四甲基吡嗪含量最多占雜環(huán)類總量的82%[31]。雖然食醋樣品中吡嗪類化合物的濃度較低，但由于其較低的閾值，其對食醋風(fēng)味的貢獻(xiàn)仍然較大[11]。

醋酸發(fā)酵階段四甲基吡嗪開始生成，與微生物代謝密切相關(guān)，因此重點(diǎn)分析了醋酸發(fā)酵階段四甲基吡嗪主要前體化合物的生成情況(圖2)。

a-乙偶姻、雙乙酰、銨態(tài)氮；b、c-氨基酸；d-主成分分析圖2 山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中四甲基吡嗪主要前體化合物的變化Fig.2 Changes of main precursors of tetramethylpyrazine during acetic acid fermentation in Shanxi aged vinegar

如圖2-a所示，乙偶姻含量在醋酸發(fā)酵過程中呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢，在發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值(52.10±3.20) g/kg高粱，占整個發(fā)酵過程的94.17%。雙乙酰含量則呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，在醋酸發(fā)酵結(jié)束其含量為(4.74±0.06) g/kg高粱。因此，乙偶姻是主要的非含氮前體(91.66%)，在微生物代謝過程中主要由丙酮酸經(jīng)α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化而來。含氮前體中包含銨和氨基酸，銨在醋酸發(fā)酵過程中呈現(xiàn)逐漸增加的變化趨勢，在發(fā)酵結(jié)束時含量達(dá)到最大值(0.81±0.02) g/kg高粱(以銨態(tài)氮計)。山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中氨基酸含量變化如圖2-b、圖2-c所示，大部分氨基酸的含量在醋酸發(fā)酵過程中呈現(xiàn)上升的趨勢，如谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、精氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸和酪氨酸；含量呈現(xiàn)下降變化趨勢的氨基酸有蘇氨酸、酪氨酸和脯氨酸；苯丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、組氨酸和絲氨酸變化趨勢不明顯。其中，谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量較高。

對醋酸發(fā)酵過程中四甲基吡嗪與其主要前體化合物的主成分分析，如圖2-d所示，第1主成分得分為69.9%，第2主成分得分為16%，兩個主成分累計得分為85.9%，具有代表性。從圖2-d可以看出，四甲基吡嗪與非含氮前體乙偶姻相聚較近，與含氮前體精氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸相聚較近，說明山西老陳醋釀造過程前體物質(zhì)乙偶姻以及精氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸3種氨基酸與四甲基吡嗪生成具有較高相關(guān)性，該研究結(jié)果與前期分析保持一致[25]。

2.2 溫度對四甲基吡嗪生成的影響

溫度是影響山西老陳醋釀造過程的關(guān)鍵因素，其在醋酸發(fā)酵階段的變化范圍在30～45 ℃，而熏醅階段采用較高的溫度(80～110 ℃)，因此進(jìn)一步分析了溫度對基于乙偶姻途徑的四甲基吡嗪合成的影響。如圖3-a所示，各溫度條件下乙偶姻含量均呈現(xiàn)下降趨勢，在溫度較低時(30、40 ℃)時，其含量下降較慢，同時，四甲基吡嗪的生成速率也較小(圖3-b)。在0～1 h，隨著溫度的增加，四甲基吡嗪的生成速率也逐漸加快，但隨后呈現(xiàn)下降趨勢，且溫度越高四甲基吡嗪含量下降的速率越大，80～95 ℃下有利于四甲基吡嗪的積累。當(dāng)溫度為100 ℃時，四甲基吡嗪的消耗速率達(dá)到0.33 g/(L·h)，這可能與四甲基吡嗪的揮發(fā)或者降解有關(guān)，因此進(jìn)一步分析了溫度對四甲基吡嗪穩(wěn)定性的影響。

a-乙偶姻；b-四甲基吡嗪圖3 溫度對四甲基吡嗪生成的影響Fig.3 Effect of temperature on the tetramethylpyrazine formation

2.3 溫度和酸對四甲基吡嗪穩(wěn)定性的影響

山西老陳醋醋酸發(fā)酵和熏醅過程均以固態(tài)醋醅方式進(jìn)行，溫度、酸度是山西老陳醋釀造過程中變化比較大的環(huán)境參數(shù)，因此，分析了溫度和酸對四甲基吡嗪穩(wěn)定性的影響，結(jié)果如圖4-a所示。

a-溫度；b-酸圖4 四甲基吡嗪穩(wěn)定性分析Fig.4 Stability analysis of tetramethylpyrazine

在較低溫度(30、40 ℃)條件下四甲基吡嗪含量基本不變，穩(wěn)定在200 mg/L的水平。隨著溫度的增加，溶液中四甲基吡嗪的含量逐漸減少，且四甲基吡嗪含量降低的速率隨溫度的增加而增加。當(dāng)溫度提高至約95 ℃時，四甲基吡嗪降解速率約為10 mg/(L·h)。溫度達(dá)到100 ℃時四甲基吡嗪的損失速率相對于其他溫度加快，這可能與四甲基吡嗪水溶液在這一溫度沸騰導(dǎo)致的蒸氣攜帶損失有關(guān)。

在相同加熱條件下(95 ℃)，乙酸、鹽酸對溶液中四甲基吡嗪含量的影響如圖4-b所示，加入鹽酸的溶液中四甲基吡嗪的含量變化趨勢與去離子水相近，反應(yīng)結(jié)束時四甲基吡嗪含量維持在150 mg/L左右；而加入乙酸的溶液中四甲基吡嗪下降速率增加，在反應(yīng)結(jié)束時其含量僅為91.35 mg/L，說明乙酸的存在增加了四甲基吡嗪的不穩(wěn)定性。

2.4 熏醅溫度對山西老陳醋風(fēng)味的影響

分別試驗了在85、95、105 ℃溫度下熏醅3 d醋醅主要理化指標(biāo)(總酸、總酯、氨基態(tài)氮、還原糖)和風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量的差異。由圖5-a可知，95 ℃條件下四甲基吡嗪的含量最高，分別比85 ℃和105 ℃高30%和17%，說明95 ℃熏醅有利于四甲基吡嗪的積累，該結(jié)果與圖3和圖4保持一致。與85 ℃和105 ℃相比，95 ℃條件下總酸、還原糖和氨基態(tài)氮指標(biāo)無明顯差異(P<0.01)，但總酯含量分別提高9%和10%(圖5-b)。除醇類和酸類外，95 ℃下酯類、酮類、醛類和雜環(huán)類風(fēng)味物質(zhì)相對含量均有增加(圖5-c)，其中總酯達(dá)到了5.28 g/100 g(圖5-a)，可能是由于該溫度條件有利于酯化反應(yīng)的進(jìn)行。在不同熏醅溫度下共檢測到了74種風(fēng)味物質(zhì)，其中酸類11種、醇類8種、酯類24種、醛類6種、酮類7種、酚類2種、雜環(huán)類16種。采用相對香氣活性值法對3個熏醅溫度下食醋樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行評價，得到圖5-d所示香氣輪，其中，四甲基吡嗪具有烘烤香氣，而酯類化合物大多具有花果香氣[28]。當(dāng)熏醅溫度為95 ℃時，除酸味外，奶香、烘烤香、堅果香、花果香和甜香的感官貢獻(xiàn)率均高于其他溫度條件，說明在此溫度下食醋的酸味刺激感較小，口感更加柔和，食醋整體風(fēng)味感官更好。

3 結(jié)論

本研究通過分析四甲基吡嗪及其主要前體化合物在山西老陳醋釀造過程的變化規(guī)律，進(jìn)一步明確了山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段是四甲基吡嗪前體化合物代謝積累的主要階段，熏醅過程高溫條件是影響四甲基吡嗪生成與降解的主要階段。熏醅過程中四甲基吡嗪處于生成和降解的動態(tài)平衡，高溫和乙酸是導(dǎo)致四甲基吡嗪降解的主要原因，95 ℃有利于四甲基吡嗪以及其他風(fēng)味物質(zhì)的積累。研究結(jié)果進(jìn)一步加深了對傳統(tǒng)發(fā)酵食品中四甲基吡嗪這一重要風(fēng)味與功能物質(zhì)生成規(guī)律的認(rèn)識，為山西老陳醋生產(chǎn)過程四甲基吡嗪這一重要特征指標(biāo)化合物的控制奠定了理論基礎(chǔ)。