齊靜靜，范炳森，張萌，許菲

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

膠原蛋白是哺乳動(dòng)物體內(nèi)含量最多的一類蛋白質(zhì)，占蛋白質(zhì)總量的25%～30%，是動(dòng)物結(jié)締組織和細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。膠原蛋白由3條左旋多脯氨酸α鏈以相錯(cuò)一個(gè)殘基的形式相互纏繞形成右手三股螺旋[1]，典型的三股螺旋結(jié)構(gòu)決定了其具有良好的生物力學(xué)性能和生物相容性[2]，在醫(yī)藥組織工程、化妝品、食品等領(lǐng)域[3]均有廣泛的應(yīng)用，2019年全球膠原蛋白市場(chǎng)規(guī)模達(dá)153.56億美元，并保持穩(wěn)步增長(zhǎng)的趨勢(shì)。目前市面上的膠原蛋白主要通過動(dòng)物提取獲得，具有潛在的免疫原性，有一定的安全隱患；此外，也可通過轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物表達(dá)和化學(xué)合成獲得，但往往價(jià)格昂貴、產(chǎn)量低，難以大批量生產(chǎn)。而微生物發(fā)酵表達(dá)重組膠原蛋白由于具有安全性高、成本低、產(chǎn)量高、序列設(shè)計(jì)靈活等優(yōu)點(diǎn)[4]，近年來(lái)受到了越來(lái)越廣泛的關(guān)注，市場(chǎng)潛力大。

目前重組膠原蛋白常用的表達(dá)系統(tǒng)有大腸桿菌(Escherichiacoli)和畢赤酵母(Pichiapastoris)，大腸桿菌具有發(fā)酵周期短、表達(dá)量高、便于遺傳操作等優(yōu)點(diǎn)，是蛋白質(zhì)異源表達(dá)最廣泛的宿主菌。利用大腸桿菌表達(dá)來(lái)源于化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)的膠原蛋白Scl2[5]，即使缺乏脯氨酸羥化酶修飾，仍能形成穩(wěn)定的三股螺旋結(jié)構(gòu)，且在接近、甚至略高于37 ℃穩(wěn)定性較好，在搖瓶水平膠原蛋白V-CL的最優(yōu)產(chǎn)量為300 mg/L，補(bǔ)料分批發(fā)酵最優(yōu)產(chǎn)量為19 g/L[6-7]；通過共表達(dá)伴侶蛋白、響應(yīng)面優(yōu)化等策略可以促進(jìn)單鏈類人源膠原蛋白在大腸桿菌中的異源表達(dá)[8-9]，其中類人源II型膠原蛋白產(chǎn)量達(dá)到14.2 g/L[10]。然而由于大腸桿菌外膜的屏障作用，外源蛋白多為胞內(nèi)表達(dá)，且易形成包涵體，此外，大量?jī)?nèi)毒素的存在也為后期純化帶來(lái)壓力。酵母作為真核表達(dá)系統(tǒng)，可進(jìn)行翻譯后修飾，并且無(wú)致病性、易進(jìn)行高密度發(fā)酵。利用畢赤酵母分泌表達(dá)單鏈重組人源膠原蛋白的研究比較成熟，人源Ш型膠原蛋白α1鏈的膠原域片段經(jīng)親水性改造及補(bǔ)料分批發(fā)酵條件優(yōu)化，產(chǎn)量提高至19.49 g/L[11]；其膠原域全長(zhǎng)在畢赤酵母GS115的胞外分泌產(chǎn)量最高達(dá)3.36 g/L[12]。然而由于缺少促進(jìn)三股螺旋折疊的C-端前導(dǎo)肽，重組膠原蛋白只能以單鏈的形式分泌到胞外。通過表達(dá)帶有C-端前導(dǎo)肽的膠原蛋白序列和共表達(dá)羥化酶可以促進(jìn)人源膠原蛋白在畢赤酵母中折疊形成三股螺旋[13]，但是會(huì)導(dǎo)致其表達(dá)量下降和在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的積累[14]；即使僅截取9 kDa的膠原域片段并將C-端前導(dǎo)肽替換為分子量低的折疊域仍無(wú)法在畢赤酵母分泌具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白[15]。

谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)是公認(rèn)的符合食品安全標(biāo)準(zhǔn)的宿主，不含內(nèi)毒素，可應(yīng)用于氨基酸、有機(jī)酸、藥用蛋白等的生產(chǎn)，其含有豐富的信號(hào)肽序列和單層膜結(jié)構(gòu)，且胞外很少檢測(cè)到蛋白酶活性，有利于異源蛋白的分泌表達(dá)。目前研究表明其具有2條主要分泌途徑，通過不同信號(hào)肽使蛋白質(zhì)穿過細(xì)胞膜，分別是分泌未折疊蛋白的Sec依賴型和轉(zhuǎn)運(yùn)折疊蛋白的Tat依賴型。對(duì)C.glutamicumATCC 13032的胞外蛋白組進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在搖瓶水平，分泌型蛋白Cg2052的含量最高[16]；對(duì)該菌株在高密度培養(yǎng)條件下的分泌組分析，發(fā)現(xiàn)胞外蛋白Cg1514占比最高[17]，以Cg1514的信號(hào)肽介導(dǎo)分泌淀粉酶的產(chǎn)量達(dá)786.2 mg/L；PorB是谷氨酸棒桿菌中4種孔道蛋白之一，對(duì)陰離子選擇型細(xì)胞壁通道的形成起重要作用，可以有效地作為錨定蛋白用于細(xì)胞表面展示，而且其信號(hào)肽介導(dǎo)的Sec依賴性分泌途徑可以高效分泌外源蛋白，介導(dǎo)M18 scFv的分泌量達(dá)68 mg/L[18]；CspB作為幾種谷氨酸棒桿菌菌株的主要分泌蛋白和表面蛋白，其信號(hào)肽作為Sec類型的強(qiáng)信號(hào)肽用于多種外源蛋白的分泌表達(dá)[19]。對(duì)C.glutamicumR基因組分析發(fā)現(xiàn)，由CgR0949介導(dǎo)的Tat依賴型分泌途徑分泌的α-淀粉酶活性最高[20]；后續(xù)與Ptac啟動(dòng)子結(jié)合CgR0949進(jìn)行(green fluorescent protein,GFP)分泌表達(dá)，產(chǎn)量可達(dá)2.8 g/L；此外，有研究報(bào)導(dǎo)來(lái)源于大腸桿菌的TorA信號(hào)肽可以有效地介導(dǎo)GFP在C.glutamicumATCC 13869中經(jīng)Tat依賴型途徑的分泌表達(dá)[21]，過表達(dá)Tat途徑的TatABC蛋白的同時(shí)用TorA信號(hào)肽介導(dǎo)分泌的pro-TG蛋白的量大于經(jīng)Sec途徑的產(chǎn)量[22]。

為了搭建谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)重組膠原蛋白的平臺(tái)，本研究選用來(lái)自Streptococcuspyogenes膠原蛋白Scl2中穩(wěn)定性較高的B片段(約占CL膠原域的1/3)[6]為研究對(duì)象，在B前端插入輔助膠原折疊形成三股螺旋結(jié)構(gòu)的V-domain和胰蛋白酶切位點(diǎn)LVPRGS，通過在V-B前端引入不同信號(hào)肽，并進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，對(duì)目的蛋白進(jìn)行分離純化和表征。本研究為重組膠原蛋白異源表達(dá)新宿主的選擇提供基礎(chǔ)，也為谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)信號(hào)肽的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

大腸桿菌E.coliJM109用于載體構(gòu)建和擴(kuò)增，谷氨酸棒狀桿菌C.glutamicumATCC 13032用于目的基因表達(dá)；大腸桿菌-谷氨酸棒桿菌穿梭表達(dá)質(zhì)粒pXMJ19、克隆有V-B基因的質(zhì)粒pCold-III-V-B，本實(shí)驗(yàn)室保藏。擴(kuò)增不同信號(hào)肽構(gòu)建重組質(zhì)粒pXMJ19-SPs-V-B所用的引物(表1)蘇州金唯智生物科技有限公司。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

蛋白Marker、Prime STAR?HS(Premix)、Blunting Kination Ligation (BKL) Kit、T4 DNA Ligase，TaKaRa公司；異丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)、氯霉素，上海生工生物工程股份有限公司；腦心浸出液肉湯(brain heart infusion,BHI)，青島海博生物；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10，固體培養(yǎng)基含瓊脂糖15；氯霉素作為大腸桿菌抗性篩選時(shí)，終質(zhì)量濃度為30 μg/mL。

種子培養(yǎng)基：BHI培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基1(g/L)[23]：(NH4)2SO420，玉米漿干粉20，K2HPO41，KH2PO41，MgSO40.25，3-(N-嗎啉基)丙磺酸鈉鹽42，葡萄糖20，pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基2：BHI培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基3(g/L)：葡萄糖150，(NH4)2SO440，KH2PO41，MgSO40.5，玉米漿15，酵母膏1，蛋白胨0.5，MnSO4·H2O 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，焦磷酸硫銨素0.001，生物素0.001，輕質(zhì)碳酸鈣20，pH 7.2。

氯霉素在谷氨酸棒桿菌中作為抗性篩選時(shí)，終質(zhì)量濃度為15 μg/mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表達(dá)載體的構(gòu)建

pXMJ19-V-B的構(gòu)建：將質(zhì)粒pCold-III-V-B和空載pXMJ19均用Hind Ⅲ和EcoR I雙酶切，分別回收目的產(chǎn)物，經(jīng)純化后，用T4 DNA連接酶于16 ℃過夜連接，并轉(zhuǎn)化至E.coliJM109中，然后涂布于含30 μg/mL氯霉素的LB平板，挑取轉(zhuǎn)化子于37 ℃培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，將測(cè)序驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pXMJ19-V-B。

pXMJ19-SPs-V-B的構(gòu)建：以質(zhì)粒pXMJ19-V-B為模板，設(shè)計(jì)引物CspB-F/R、PorB-F/R、Cg1514-F/R、CgR0949-F/R、Cg2052-F/R、TorA-F/R，通過PCR獲得帶有6種不同信號(hào)肽的重組質(zhì)粒。PCR體系為：Prime STAR HS (Premix) 25 μL、上下游引物1 μL、模板1 μL，加水至50 μL。PCR擴(kuò)增條件為：98 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s，55～68 ℃ 10 s，72 ℃ 8 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物回收后做磷酸化處理，16 ℃過夜連接，轉(zhuǎn)化至E.coliJM109，然后涂布于含30 μg/mL氯霉素的LB平板，培養(yǎng)12～14 h挑取單菌落培養(yǎng)送基因測(cè)序。測(cè)序驗(yàn)證正確后，將質(zhì)粒命名為pXMJ19-SPs-V-B。

1.2.2 谷氨酸棒桿菌的轉(zhuǎn)化

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pXMJ19-SPs-V-B電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)C.glutamicumATCC 13032感受態(tài)細(xì)胞，通過抗性篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并命名為C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-SPs-V-B。為了能夠更好地反映信號(hào)肽的分泌表達(dá)情況，同時(shí)構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-V-B作為對(duì)照菌株。

1.2.3 重組菌誘導(dǎo)表達(dá)的初始條件

將保存重組菌的甘油管在BHI平板上劃線，30 ℃，培養(yǎng)24～32 h，然后挑取單菌落至5 mL的BHI中，30 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)；取一定量的種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基[23]，使初始OD600為0.1，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)3 h后添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，培養(yǎng)48 h。

1.2.4 重組菌發(fā)酵條件的優(yōu)化

(1)信號(hào)肽的優(yōu)化：將C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-SPs-V-B和C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-V-B分別誘導(dǎo)表達(dá)，每隔8 h取樣靜置15 min測(cè)OD600，并繪制生長(zhǎng)曲線，誘導(dǎo)結(jié)束后，收集發(fā)酵上清液，濃縮20倍進(jìn)行SDS-PAGE分析，比較目的條帶的粗細(xì)，確定最優(yōu)信號(hào)肽。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化：選擇最優(yōu)信號(hào)肽對(duì)應(yīng)菌株，分別用發(fā)酵培養(yǎng)基1、2、3進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)結(jié)束后取上清液濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE分析，確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)基。

(3)起始誘導(dǎo)OD600的優(yōu)化：將種子液轉(zhuǎn)至最佳發(fā)酵培養(yǎng)基，在OD600分別為2、6、10、14時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)，48 h后取上清液濃縮，通過SDS-PAGE確定最佳誘導(dǎo)時(shí)機(jī)。

(4)誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的優(yōu)化：在最佳起始誘導(dǎo)OD600，加入IPTG分別誘導(dǎo)24、32、40、48、56、64 h，探究誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)pXMJ19-SP-V-B表達(dá)量的影響。

(5)IPTG濃度的優(yōu)化：在最佳起始誘導(dǎo)OD600加入終濃度分別為0.2、0.5、0.8、1.1 mmol/L的IPTG，28 ℃誘導(dǎo)至最佳時(shí)長(zhǎng)，研究IPTG濃度對(duì)pXMJ19-SP-V-B表達(dá)的影響。

(6)溶氧條件的優(yōu)化：在最優(yōu)條件基礎(chǔ)上，將誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)基的裝液量改為50 mL/500 mL(帶擋板搖瓶)、50 mL/500 mL、100 mL/500 mL(帶擋板搖瓶)、100 mL/500 mL，研究不同溶氧條件對(duì)表達(dá)的影響。

1.2.5 膠原蛋白的純化

在最優(yōu)發(fā)酵條件下，收集菌液，4 ℃、12 000 r/min離心25 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾。然后用His TrapTMHP 5 mL親和純化，先用5倍柱體積結(jié)合緩沖液A(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、10 mmol/L咪唑、pH 7.4)平衡，再以5 mL/min的流速上樣。上樣結(jié)束后，用洗脫緩沖液B(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑、pH 7.4)進(jìn)行梯度洗脫獲得目的蛋白，并利用SDS-PAGE分析純化情況。

1.2.6 胰蛋白酶酶切

將純化后的膠原蛋白與胰蛋白酶以物質(zhì)的量比250∶1的比例混合，16 ℃過夜酶切后，用HiTrap Desalting做脫鹽處理，以超純水為流動(dòng)相，流速為5 mL/min，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證后進(jìn)行真空冷凍干燥。

1.2.7 圓二色譜檢測(cè)

將凍干后的樣品用10 mmol/L、pH 7.4的PB緩沖液溶解成1 mg/mL的溶液，4 ℃平衡48 h后進(jìn)行圓二色譜鑒定。全波長(zhǎng)是在4 ℃下以1 nm為間隔測(cè)定190～260 nm的圓二色譜光譜，平均掃描時(shí)間為5 s。熱變曲線是通過監(jiān)測(cè)225 nm處的圓二色譜信號(hào)，以10 ℃/h的升溫速率從10 ℃升高到70 ℃獲得的，每個(gè)溫度下平衡8 s，熔融溫度(Tm)通過擬合熱變曲線的一階導(dǎo)數(shù)求得。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同信號(hào)肽對(duì)重組菌表達(dá)的影響

信號(hào)肽種類不同，介導(dǎo)分泌外源蛋白的能力也有所差別。為了研究不同信號(hào)肽對(duì)重組膠原蛋白表達(dá)的影響，在目的基因前端分別引入信號(hào)肽CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052、TorA，構(gòu)建重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。如圖1-a所示，引入信號(hào)肽的菌株整體生長(zhǎng)趨勢(shì)相近，在誘導(dǎo)期的前24 h，均保持較快的生長(zhǎng)速度，積累較多菌體；誘導(dǎo)24～48 h，菌體生長(zhǎng)速度明顯變緩，OD600維持在25左右；對(duì)照菌株V-B在誘導(dǎo)期的前24 h生長(zhǎng)趨勢(shì)與其他菌株相似，但誘導(dǎo)24～40 h仍保持較高的生長(zhǎng)速度，誘導(dǎo)40～48 h趨于平穩(wěn)，OD600約為28。誘導(dǎo)結(jié)束后，取發(fā)酵上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，如圖1-b、圖1-c所示，與未插入信號(hào)肽的對(duì)照菌株相比，所有引入信號(hào)肽的菌株發(fā)酵上清液中均出現(xiàn)分子質(zhì)量約為23 kDa的條帶，高于目的蛋白的理論分子質(zhì)量17.82 kDa，這可能是由于膠原域含有大量的脯氨酸，導(dǎo)致膠原蛋白在SDS-PAGE中遷移速度較慢，表觀分子質(zhì)量約為理論分子質(zhì)量的1.4倍[24]。其中，Cg1514、CspB、PorB介導(dǎo)分泌蛋白的效果較好，尤其是PorB對(duì)應(yīng)目的蛋白條帶最粗，因此選擇PorB作為介導(dǎo)膠原蛋白V-B分泌的信號(hào)肽。

a-不同重組菌株的生長(zhǎng)曲線；b-引入信號(hào)肽菌株的發(fā)酵上清液的SDS-PAGE圖；c-對(duì)照菌株(未插入信號(hào)肽)發(fā)酵上清液的SDS-PAGE圖(1～6分別對(duì)應(yīng)引入信號(hào)肽CspB、PorB、Cg1514、CgR0949、Cg2052、TorA的菌株；M: premixed protein marker)圖1 信號(hào)肽對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different signal peptides on bacterial growth and protein expression

谷氨酸棒桿菌ATCC 13032在搖瓶水平胞外含量最高的蛋白是Cg2052[16]，而在高密度培養(yǎng)條件下胞外的Cg1514蛋白含量最高，本研究中信號(hào)肽Cg1514介導(dǎo)分泌膠原蛋白的量明顯高于信號(hào)肽Cg2052，這種差異可能是由于搖瓶培養(yǎng)條件的區(qū)別[17]，也可能是由于宿主菌胞外蛋白含量的高低并不能完全決定其信號(hào)肽分泌外源蛋白能力的強(qiáng)弱。YIM等[17]對(duì)比了搖瓶水平信號(hào)肽Cg1514和PorB介導(dǎo)分泌內(nèi)切木聚糖酶的能力，發(fā)現(xiàn)Cg1514介導(dǎo)分泌目的蛋白的產(chǎn)量高；而在本實(shí)驗(yàn)中PorB作為信號(hào)肽分泌V-B的量約為Cg1514的1.8倍，這可能和蛋白自身性質(zhì)有關(guān)，如蛋白結(jié)構(gòu)和形態(tài)等[25]，或者與目的蛋白和信號(hào)肽的適配性有關(guān)[26]。此外，從分泌途徑來(lái)說，作為Sec依賴型信號(hào)肽的Cg1514、CspB、PorB介導(dǎo)的膠原蛋白產(chǎn)量高于Tat依賴型的信號(hào)肽CgR0949和TorA，在最新的研究中利用谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)蛛絲蛋白，其主要分泌途徑為Sec依賴型[27]，因此推測(cè)Sec依賴型信號(hào)肽介導(dǎo)的分泌途徑有利于膠原蛋白、蛛絲蛋白等纖維狀蛋白的分泌表達(dá)。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達(dá)的影響

在微生物發(fā)酵培養(yǎng)的過程中，合適的營(yíng)養(yǎng)供給是微生物快速生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物大量合成的基礎(chǔ)。為了獲得適合C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)基，選取了3種谷氨酸棒桿菌常用培養(yǎng)基1、2、3進(jìn)行重組菌的發(fā)酵。如圖2-a所示，重組菌在3種發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況有明顯差異：在培養(yǎng)基2中，誘導(dǎo)16 h菌濃度達(dá)到最高，直到誘導(dǎo)結(jié)束一直維持在10左右，菌體生長(zhǎng)受限，積累菌量最少；在培養(yǎng)基1中，菌體前期生長(zhǎng)迅速，后期生長(zhǎng)趨勢(shì)變緩，誘導(dǎo)24～48 h，OD600逐漸增加到25左右；發(fā)酵培養(yǎng)基3中菌體前期生長(zhǎng)速度雖低于培養(yǎng)基1，但誘導(dǎo)40 h內(nèi)一直維持較高的增長(zhǎng)速度，誘導(dǎo)48 h時(shí)OD600與培養(yǎng)基1相當(dāng)。

a-不同培養(yǎng)基下菌株的生長(zhǎng)曲線；b-不同培養(yǎng)基下發(fā)酵上清液的SDS-PAGE圖(泳道1～3分別對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基1、2、3)圖2 培養(yǎng)基條件對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of medium conditions on bacterial growth and protein expression

取發(fā)酵上清液做SDS-PAGE鑒定，如圖2-b所示，培養(yǎng)基1中目的蛋白表達(dá)量最高，條帶最粗；培養(yǎng)基3次之；培養(yǎng)基2產(chǎn)量最低，幾乎看不到條帶。分析膠原蛋白在培養(yǎng)基1表達(dá)量高的原因可能包括：

(1)培養(yǎng)基1中特有的3-(N-嗎啉基)丙磺酸鈉鹽可提供pH在6.5～7.9范圍的緩沖環(huán)境，有利于菌體的快速生長(zhǎng)和外源蛋白的表達(dá)；(2)培養(yǎng)基1和培養(yǎng)基3雖然誘導(dǎo)結(jié)束菌濃度相近，但培養(yǎng)基1中的菌體前期生長(zhǎng)速度快，積累了較多菌量，在發(fā)酵后期較培養(yǎng)基3更有利于目的蛋白的表達(dá)和積累。因此，選擇培養(yǎng)基1作為重組膠原蛋白V-B分泌表達(dá)的發(fā)酵培養(yǎng)基。

2.3 起始誘導(dǎo)OD600對(duì)C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達(dá)的影響

起始誘導(dǎo)OD600對(duì)重組菌合成目的蛋白有很大影響，當(dāng)菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力最強(qiáng)，能很快適應(yīng)添加誘導(dǎo)劑后的環(huán)境，迅速進(jìn)入蛋白合成期。為了探究起始誘導(dǎo)OD600對(duì)C.glutamicumATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達(dá)的影響。如圖3-a所示，培養(yǎng)前4 h，菌種處于延滯期，生長(zhǎng)緩慢，OD600約為2；培養(yǎng)4 h后開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，4～14 h為菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600從5提高至18；之后生長(zhǎng)速度明顯變緩。因此，在種子液轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基后，控制OD600分別達(dá)到2、6、10、14時(shí)，添加IPTG至終濃度為0.8 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)，28 ℃培養(yǎng)48 h，每隔8 h測(cè)定OD600并繪制生長(zhǎng)曲線。如圖3-b所示，受起始OD600的影響，菌株在誘導(dǎo)表達(dá)前8 h，OD600仍維持較大差距。誘導(dǎo)16 h，差距明顯縮小，OD600達(dá)到22左右；誘導(dǎo)24 h后，菌體生長(zhǎng)速度變緩，OD600以較低速度增長(zhǎng)，誘導(dǎo)48 h，所有條件的最終OD600差別不大，都達(dá)到28左右。由圖3-c可知，誘導(dǎo)結(jié)束后，起始OD600為2和6的菌株對(duì)應(yīng)目的條帶較粗，蛋白表達(dá)量高?？赡苁怯捎谄鹗糘D600為10和14的菌株誘導(dǎo)劑添加時(shí)間較晚，前期培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被大量消耗，影響后期目的蛋白合成。而OD600為2時(shí)，可觀察到菌體處于延滯期，故選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的OD600=6為最佳起始誘導(dǎo)菌濃度。

a-未加誘導(dǎo)劑菌株的生長(zhǎng)曲線；b-不同起始誘導(dǎo)OD600下菌株的生長(zhǎng)曲線；c-不同起始誘導(dǎo)OD600下發(fā)酵上清液的SDS-PAGE圖(泳道1～4分別對(duì)應(yīng)起始誘導(dǎo)OD600為2、6、10、14；M-premixed protein marker)圖3 起始誘導(dǎo)OD600對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of initial induction of OD600 on bacterial growth and protein expression

2.4 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)C.glutamicum ATCC13032/pXMJ19-PorB-V-B表達(dá)的影響

由圖3-b誘導(dǎo)期菌濃度變化情況發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)48 h，OD600仍有緩慢上升的趨勢(shì)，表明菌體仍在積累，誘導(dǎo)時(shí)間會(huì)影響菌量和目的蛋白的表達(dá)量。為了確定最佳誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)，在OD600=6時(shí)加入IPTG至終濃度為0.8 mmol/L進(jìn)行誘導(dǎo)。由圖4-a可看出，在誘導(dǎo)前16 h，菌體保持較快的生長(zhǎng)速度，誘導(dǎo)16～48 h，菌體生長(zhǎng)速度放緩，誘導(dǎo)48～64 h，OD600趨于穩(wěn)定，維持在28左右。從圖4-b可觀察到，在24～40 h，目的條帶亮度增加，目的蛋白表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；誘導(dǎo)時(shí)間超過40 h后，目的蛋白條帶沒有明顯的變化，蛋白未出現(xiàn)降解的跡象?？紤]到隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，體系中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，會(huì)積累較多代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致菌體衰退和老化，以及獲得更高的時(shí)空產(chǎn)量，故選取40 h為最佳誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)。

a-不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)菌株的生長(zhǎng)曲線；b-不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)下發(fā)酵上清液的SDS-PAGE圖(泳道1～6分別對(duì)應(yīng)發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)24、32、40、48、56、64 h)圖4 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of induction time on bacterial growth and protein expression

2.5 IPTG濃度對(duì)C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達(dá)的影響

IPTG作為半乳糖的結(jié)構(gòu)類似物，能夠誘導(dǎo)乳糖操縱子下游基因的表達(dá)，其添加量對(duì)菌株生長(zhǎng)及蛋白產(chǎn)量可能有一定影響。為了確定誘導(dǎo)劑最適添加濃度，在OD600=6時(shí)加入IPTG。從圖5-a可看出，IPTG濃度對(duì)菌體整體生長(zhǎng)趨勢(shì)無(wú)太大影響。由圖5-b可知，IPTG終濃度為0.5 mmol/L時(shí)，目的蛋白條帶最粗，0.2 mmol/L次之；終濃度為0.8和1.1 mmol/L的目的條帶較淺，可能是由于較高的誘導(dǎo)劑濃度會(huì)造成菌體代謝壓力大而導(dǎo)致蛋白產(chǎn)量下降[28]。因此在本實(shí)驗(yàn)中誘導(dǎo)劑IPTG的最佳工作濃度為0.5 mmol/L。

a-不同IPTG濃度下菌株的生長(zhǎng)曲線；b-不同IPTG濃度下發(fā)酵上清液的SDS-PAGE圖(泳道1～4分別對(duì)應(yīng)IPTG濃度為0.2、0.5、0.8、1.1 mmol/L)圖5 IPTG濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effects of IPTG concentration on bacterial growth and protein expression

2.6 溶氧對(duì)C.glutamicum ATCC 13032/pXMJ19-PorB-V-B表達(dá)的影響

谷氨酸棒桿菌是嚴(yán)格的好氧型細(xì)菌，其生長(zhǎng)代謝和產(chǎn)物合成均需要氧氣，因此氧氣濃度至關(guān)重要。由圖6-a可看出，在誘導(dǎo)相同時(shí)長(zhǎng)下，帶擋板的搖瓶OD600比不帶擋板的高，且相同類型搖瓶，裝液量低的OD600較高，說明溶氧對(duì)菌體的生長(zhǎng)狀況影響較大。誘導(dǎo)0～8 h，帶擋板搖瓶的菌體生長(zhǎng)速度很快，約為相同裝液量不帶擋板搖瓶的2倍，其中裝液量為50 mL和100 mL的帶擋板搖瓶在誘導(dǎo)8 h的OD600分別超過50和43，之后OD600無(wú)太大變化，進(jìn)入穩(wěn)定期；不帶擋板搖瓶條件下的菌體OD600在誘導(dǎo)0～24 h穩(wěn)定增長(zhǎng)，誘導(dǎo)24 h后，OD600保持平穩(wěn)，誘導(dǎo)40 h后，裝液量50 mL和100 mL的搖瓶OD600分別達(dá)到40和28。如圖6-b所示，裝液量50 mL帶擋板的搖瓶目的條帶最粗。表明溶氧對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)有顯著影響，高的溶氧條件有利于菌體生長(zhǎng)和外源蛋白表達(dá)。YANG等[29]在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)腈水合酶，搖瓶培養(yǎng)最高OD600為15.6，酶活性為143.1 U/mL，在10 L發(fā)酵罐中的高密度發(fā)酵，OD600達(dá)到200，總酶活性達(dá)到1 432 U/mL，表明在發(fā)酵罐水平對(duì)溶氧的嚴(yán)格控制可以顯著提高谷氨酸棒桿菌中外源蛋白的表達(dá)，對(duì)進(jìn)一步高密度培養(yǎng)有指導(dǎo)意義。

a-不同溶氧條件下的生長(zhǎng)曲線；b-不同溶氧條件下發(fā)酵上清液的SDS-PAGE圖(1～4分別對(duì)應(yīng)50 mL/500 mL、50 mL/500 mL帶擋板搖瓶、100 mL/500 mL、100 mL/500 mL帶擋板搖瓶)圖6 溶氧對(duì)菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of dissolved oxygen on bacterial growth and protein expression

2.7 重組膠原蛋白V-B的表征

重組膠原蛋白V-B包含V domain和膠原域B，純化后經(jīng)胰蛋白酶消化，V domain被切成多個(gè)小肽段，而膠原域B如果正確折疊形成了具有剛性的三股螺旋結(jié)構(gòu)，則不會(huì)被胰蛋白酶消化。由圖7-a可知，酶切前V-B分子質(zhì)量約為23 kDa，酶切后有明顯的單一條帶，分子質(zhì)量約為12 kDa，與膠原域B分子質(zhì)量的1.4倍相符，可以推測(cè)分泌表達(dá)出的膠原蛋白具有三股螺旋結(jié)構(gòu)。對(duì)膠原域B進(jìn)行除鹽凍干處理，稱重估算產(chǎn)量約為30 mg/L，是優(yōu)化前的3倍。為了進(jìn)一步確定膠原域B的二級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行了圓二色譜鑒定，如圖7-b所示，膠原域B在225 nm處有膠原蛋白的特征正峰，表明其正確折疊形成三股螺旋結(jié)構(gòu)。又利用圓二色譜在10～70 ℃掃描其熱變曲線，如圖7-c所示，進(jìn)行擬合后顯示膠原域B的Tm值為25.82 ℃，與文獻(xiàn)報(bào)道相近[30]。因此，通過信號(hào)肽的優(yōu)化，構(gòu)建的谷氨酸棒桿菌表達(dá)體系可以直接分泌表達(dá)具有三股螺旋結(jié)構(gòu)的膠原蛋白。

PENG等[7]在大腸桿菌中表達(dá)來(lái)源于化膿性鏈球菌的全長(zhǎng)Scl2膠原蛋白V-CL，在搖瓶水平最高產(chǎn)量為300 mg/L，發(fā)酵罐水平最高產(chǎn)量達(dá)19 g/L。本研究中膠原域B的表達(dá)量約為30 mg/L，忽略酶切、除鹽、濃縮的損失以及序列長(zhǎng)度對(duì)蛋白表達(dá)的影響，根據(jù)分子質(zhì)量估算酶切前重組膠原蛋白V-B的保守產(chǎn)量約為67.3 mg/L，而V-B的分子質(zhì)量約為膠原蛋白V-CL的1/2，由此推算V-B在谷氨酸棒桿菌中的產(chǎn)量約為大腸桿菌中的1/2，且本研究中目的基因尚未進(jìn)行針對(duì)宿主的密碼子優(yōu)化，因此推測(cè)谷氨酸棒桿菌在分泌表達(dá)膠原蛋白上仍有較大潛力。

a-SDS-PAGE圖(泳道1為純化后的V-B，泳道2為酶切后樣品)；b-膠原域全波長(zhǎng)圖譜；c-膠原域熱變曲線圖7 重組膠原蛋白V-B純化、酶切后的SDS-PAGE圖及膠原域B的圓二色譜圖Fig.7 SDS-PAGE after purification and digestion of V-B and circular dichroism of B domain

3 結(jié)論

本研究以食品安全級(jí)菌株谷氨酸棒桿菌為底盤細(xì)胞，通過引入不同種類信號(hào)肽介導(dǎo)膠原蛋白的分泌表達(dá)，結(jié)果顯示Sec依賴型信號(hào)肽PorB介導(dǎo)分泌膠原蛋白的產(chǎn)量最高，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化，膠原蛋白的產(chǎn)量提高到優(yōu)化前的3倍，經(jīng)圓二色譜表征，證明其膠原域正確折疊形成三股螺旋結(jié)構(gòu)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)溶氧是搖瓶水平影響膠原蛋白產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，為工業(yè)生產(chǎn)水平的進(jìn)一步放大試驗(yàn)提供了指導(dǎo)。本研究是膠原蛋白在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)的首次嘗試，后續(xù)可通過密碼子優(yōu)化、表達(dá)元件和載體結(jié)構(gòu)等方面的進(jìn)一步優(yōu)化提高膠原蛋白的表達(dá)量，并且，溶氧作為好氧發(fā)酵過程中的重要參數(shù)，通過在發(fā)酵罐水平對(duì)溶氧的嚴(yán)格控制有望大幅度提高膠原蛋白在谷氨酸棒桿菌中的產(chǎn)量。本研究中谷氨酸棒桿菌分泌表達(dá)膠原蛋白體系的建立，為膠原蛋白的重組表達(dá)提供了新的宿主選擇，也為微生物難以分泌具有三股螺旋結(jié)構(gòu)膠原蛋白的困境提供了解決思路和理論依據(jù)。