魯 丹 張 燚 胡 安 李 璨 喬培培 薛曉成 陳曉平

上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，上海 200135

喉鱗癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤之一[1]，喉鱗癌患者早期癥狀常不明顯，發(fā)現(xiàn)時多數(shù)處于中晚期，術(shù)后生活質(zhì)量不佳[2]。頭頸部鱗癌的發(fā)生受到多種因素的影響，有研究表明EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）感染與頭頸部鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)[3]。

EBV是普遍存在的人類γ-皰疹科病毒，在腫瘤細(xì)胞中能有效地激活細(xì)胞周期，使被感染的細(xì)胞能夠持續(xù)增殖，EBV可以表達(dá)具有轉(zhuǎn)化特性的各種潛伏期相關(guān)蛋白[4]，這些蛋白的過表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，阻斷病毒裂解復(fù)制，確保胞外病毒基因組準(zhǔn)確地向子代細(xì)胞分化。同時可以通過多種不同的信號通路上調(diào)腫瘤細(xì)胞系中端粒酶的活性[5]。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011—2018年寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬總院（n=113）和上海市眼耳鼻喉科醫(yī)院的耳鼻咽喉科（n=12）收治的125份喉鱗癌組織及癌旁組織標(biāo)本。標(biāo)本患者中男122例，女3例，年齡37～82歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織對年齡段的劃分[6]，分為青年組、中年組、年輕老年組、老年組。根據(jù)病程長短劃分為三組，＜1年組，1～2年組，＞2年組。根據(jù)美國癌癥協(xié)會（American joint committee on cancer，AJCC）2017年第8版的喉鱗癌臨床分期標(biāo)準(zhǔn)將喉鱗癌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期[7]。根據(jù)病理分化程度劃分為低分化組、中分化組、高分化組。根據(jù)腫瘤的發(fā)生部位，可以劃分為聲門上區(qū)、聲門區(qū)、聲門下區(qū)、跨聲門區(qū)。本研究經(jīng)上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院倫理委員會通過。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)手術(shù)及病理證實(shí)為喉鱗癌；有完整的臨床資料（包括術(shù)前影像學(xué)檢查、術(shù)后隨訪）；每例喉鱗癌標(biāo)本均能正常進(jìn)行EBV檢測及免疫組化染色、Western blotting技術(shù)檢測。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前有化療或放療史；復(fù)發(fā)的患者；合并鄰近組織的腫瘤；合并其他臟器的腫瘤；收集的喉鱗癌標(biāo)本無完整癌旁組織對照組。

1.3 方法

將125份喉鱗癌及癌旁組織石蠟樣本進(jìn)行EBV基因檢測，同時進(jìn)行TCAB1蛋白免疫組化檢查。結(jié)果判斷：根據(jù)細(xì)胞陽性著色程度，著色成功的視為陽性，未成功著色的視為陰性。根據(jù)細(xì)胞陽性著色數(shù)量及占比可分為陰性（-）、弱陽性（+-）、陽性（+）、中等陽性（++）及強(qiáng)陽性（+++）。陽性率=（弱陽性+陽性+中等陽性+強(qiáng)陽性）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，生存函數(shù)Kaplan-Meier法進(jìn)行生存率的分析，使用Log-rank檢驗(yàn)比較生存風(fēng)險，終點(diǎn)事件為患者病死，生存時間以月為單位進(jìn)行統(tǒng)計。采用生存分析及COX回歸模型統(tǒng)計學(xué)方法，對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行生存狀況分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EBV在喉鱗癌組織中的表達(dá)情況

本研究發(fā)現(xiàn)分化程度、臨床分期、腫瘤部位與EBV感染比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），可認(rèn)為患者的分化程度、臨床分期、腫瘤部位與EBV感染無相關(guān)性。見表1。

表1 喉鱗癌組織中EBV感染與患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

2.2 TCAB1蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)情況

2.2.1 TCAB1蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)情況 125例喉鱗癌組織標(biāo)本中TCAB1蛋白表達(dá)陽性98例，陽性率為78.4%。TCAB1基因是位于細(xì)胞核內(nèi)染色體末端的端粒酶上（圖1A～D），TCAB1蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)（圖1E～F），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05），提示TCAB1蛋白較正常組織在喉鱗癌組織中更高表達(dá)。見表2。

表2 TCAB1蛋白在喉鱗癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)

圖1 喉鱗癌組織中TCAB1的不同分級表達(dá)

2.2.2 喉鱗癌組織中TCAB1蛋白表達(dá)與患者臨床病理特征的相關(guān)性情況 TCAB1蛋白陽性組腫瘤部位與TCAB1蛋白陰性組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05），認(rèn)為喉鱗癌組織中TCAB1蛋白表達(dá)與患者的腫瘤部位、臨床分期、病理分化程度無相關(guān)性。見表3。

表3 TCAB1蛋白表達(dá)與喉鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.2.3 喉鱗癌組織中TCAB1蛋白的表達(dá)與EBV感染的相關(guān)性情況 喉鱗癌組織中TCAB1蛋白過表達(dá)與EBV感染有相關(guān)性，見表4，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

表4 喉鱗癌組織中TCAB1蛋白表達(dá)與EBV感染的關(guān)系

2.3 喉鱗癌術(shù)后患者生存分析

2019年3 月通過電話隨訪寧夏醫(yī)科大學(xué)總院收集的113份喉鱗癌患者術(shù)后生存狀態(tài)，失訪38例，有效數(shù)據(jù)75例，男73例，女2例。復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移2例，病死7例。

2.3.1 喉鱗癌患者的一般臨床特征與預(yù)后關(guān)系的分析 本研究中喉鱗癌患者總生存率為86.7%，1年總生存率為98.7%，3年總生存率為96.0%，5年總生存率為90.7%，8年總生存率為86.6%。累積生存函數(shù)圖顯示隨著隨訪時間逐步遞增，喉鱗癌術(shù)后患者的生存率逐步下降，累積風(fēng)險函數(shù)圖顯示隨著隨訪時間逐步遞增，喉鱗癌術(shù)后患者的病死風(fēng)險逐步攀升（圖2）?？梢哉J(rèn)為腫瘤部位是喉鱗癌患者術(shù)后的預(yù)后獨(dú)立危險因素（P＜ 0.05）。見表5。

表5 腫瘤部位的COX比例風(fēng)險分析

圖2 累計生存函數(shù)

2.3.2 TCAB1表達(dá)與生存狀況分析 75例隨訪數(shù)據(jù)中，TCAB1陽性喉鱗癌患者有60例，其中病死9例，陰性喉鱗癌患者15例，其中病死2例。TCAB1陽性喉鱗癌患者中1年生存率為98.3%，3年生存率為91.5%，5年生存率為89.2%，8年生存率為53.0%。TCAB1陰性喉鱗癌患者中1年生存率為100%，3年生存率為92.9%，5年生存率為82.5%。經(jīng)統(tǒng)計分析可以認(rèn)為TCAB1蛋白的表達(dá)情況與喉鱗癌術(shù)后患者的預(yù)后差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。見圖3。

圖3 TCAB1蛋白表達(dá)情況與喉鱗癌術(shù)后患者預(yù)后的生存曲線

3 討論

惡性腫瘤較正常組織最大的不同之處在于其侵襲力強(qiáng)、容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移和增殖能力無限，容易使人發(fā)生惡病質(zhì)。端粒是位于染色體末端控制細(xì)胞增殖的基因位點(diǎn)，在分化良好的組織中其活性受到抑制，而在惡性腫瘤中被重新激活。TCAB1蛋白作為端粒酶全酶的一種，在端粒酶活性的維持和激活中起著關(guān)鍵作用[8]。本研究采用免疫組化和Western blotting檢測從蛋白質(zhì)水平分析了TCAB1基因的表達(dá)異常是否參與了喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展，并探討了TCAB1蛋白的表達(dá)與EBV感染是否相關(guān)。結(jié)果表明喉鱗癌組織中TCAB1蛋白的表達(dá)與EBV感染有關(guān)。本研究還利用生存分析統(tǒng)計學(xué)方法分析了喉鱗癌術(shù)后患者預(yù)后的獨(dú)立危險因素，發(fā)現(xiàn)EBV感染與TCAB1蛋白的表達(dá)與喉鱗癌患者預(yù)后無明顯相關(guān)性。

本研究發(fā)現(xiàn)喉鱗癌患者絕大多數(shù)為男性（122/125，97.6%），女性中較少見。年齡多在中年人到年輕老年人階段（45～74歲，86.4%），腫瘤發(fā)生部位多位于聲門區(qū)（92/125，73.6%），病程多在一年之內(nèi)（91/125，72.8%），然而臨床分期之間和病理分化程度之間并無顯著差別。這與我國多次統(tǒng)計的結(jié)果一致[9]。男性患者更易罹患喉鱗癌，具體原因仍不明確。有研究認(rèn)為喉鱗癌的發(fā)生與持續(xù)飲酒、高齡以及男性喉部作為男性發(fā)育的第二性征、積累的雄性激素較女性明顯增多等因素有關(guān)[10]。喉鱗癌多位于聲門區(qū)，早期即可表現(xiàn)聲音嘶啞、刺激性咳嗽，患者多以此為首發(fā)癥狀就診，故一年內(nèi)發(fā)病者較多見。位于聲門上區(qū)及聲門下區(qū)喉鱗癌患者由于早期癥狀多不明顯，就診發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，術(shù)后生活質(zhì)量較差[11]。

關(guān)于EBV感染與喉鱗癌的相關(guān)性研究，國內(nèi)外尚無統(tǒng)一意見。本研究結(jié)果與前期研究有一定的異同，研究較一致的是EBV感染與喉鱗癌患者的喉鱗癌組織的分化程度、臨床分期、腫瘤部位無顯著相關(guān)性[12]。Muderris等[13-14]的研究中EBV感染陽性率較本研究明顯減少，分析其原因可能與Muderris 等研究中樣本量少有關(guān)，而Vazquez-Guillen等[14]研究采用的檢測方法是水解PCR探針，與本研究方法有出入，且可能與研究人群的民族和地域不同有關(guān)。

TCAB1又稱WDR79，WRAP53，是真核細(xì)胞染色體末端的重復(fù)WD結(jié)構(gòu)，維持卡哈爾體形成、端粒的延長及DNA損傷修復(fù)，在將端粒運(yùn)輸?shù)娇ü栿w的過程中具有重要作用[15]。但與頭頸腫瘤的相關(guān)性及具體機(jī)制研究較少，Sun等[16]發(fā)現(xiàn)TCAB1在頭頸惡性腫瘤的臨床標(biāo)本和癌細(xì)胞系中顯著過表達(dá)，隨著TCAB1的下調(diào)，體外細(xì)胞的增殖潛能和侵襲能力也出現(xiàn)了明顯降低，異種移植實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，TCAB1基因的沉默會抑制裸鼠腫瘤的形成。Mahmoudi等[17]發(fā)現(xiàn)TCAB1的過表達(dá)與頭頸腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)，TCAB1蛋白的下調(diào)可以通過線粒體途徑引起大量細(xì)胞凋亡，Bax/Bak的活化、線粒體膜電位的喪失和細(xì)胞色素C的釋放，與正常細(xì)胞相比腫瘤細(xì)胞對TCAB1的耗竭更為敏感。在喉鱗癌放射治療方面，Qiu等[18]發(fā)現(xiàn)可利用RNA干擾技術(shù)降低TCAB1的表達(dá)影響端粒長度來提高喉鱗癌細(xì)胞系的放射敏感性。本研究采用免疫組化法分析了125份喉鱗癌患者的腫瘤標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)TCAB1蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織。喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展及其預(yù)后與喉鱗癌發(fā)生的部位、臨床分期、病理分化程度都有一定的關(guān)系。Tang等[19]回顧性分析了659例喉鱗癌患者的術(shù)后生存情況，指出臨床T分期、喉鱗癌組織分化程度是喉鱗癌復(fù)發(fā)和進(jìn)展的獨(dú)立危險因素。而本研究發(fā)現(xiàn)TCAB1蛋白的表達(dá)與喉鱗癌患者的組織分化程度、臨床分期、腫瘤部位無明顯相關(guān)性。因此，TCAB1基因影響喉鱗癌發(fā)生的具體作用機(jī)制仍需要繼續(xù)探討，進(jìn)一步研究TCAB1在喉鱗癌發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后等過程中的作用機(jī)制。

本研究采用生存分析方法對隨訪到的75例患者數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)喉鱗癌術(shù)后患者的預(yù)后與其臨床分期、病理分化程度無明顯相關(guān)性，同時EBV感染、TCAB1蛋白表達(dá)情況與喉鱗癌預(yù)后也無明顯關(guān)系。這與其他研究者結(jié)果有差異?？赡艿脑蛑饕校孩俦狙芯繉ο鬄?011—2018年喉鱗癌術(shù)后患者，失訪患者嚴(yán)重影響了研究結(jié)果；②本研究對象為寧夏地區(qū)喉鱗癌患者，可能存在地域差異。