王玉潔 ，王健 ，周靜威

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致慢性腎病及終末期腎臟?。╡nd stage renal disease，ESRD）的主要病因，30%～40%的糖尿病患者會(huì)發(fā)展為DKD［1-2］。研究表明，細(xì)胞衰老和凋亡是DKD發(fā)病和進(jìn)展的重要機(jī)制［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)DKD患者腎小管上皮細(xì)胞衰老相關(guān)蛋白p16的表達(dá)變化與其腎組織損傷程度及腎功能均存在顯著關(guān)系［5］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，DKD大鼠腎組織中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3 mRNA水平顯著增加［6］。多項(xiàng)研究證實(shí)，中醫(yī)藥可以通過(guò)抑制腎臟細(xì)胞衰老和凋亡，改善DKD腎損傷［7-13］。因此，運(yùn)用中醫(yī)藥抑制腎臟細(xì)胞衰老和凋亡，可能成為延緩DKD進(jìn)展的新策略。

清熱消癥方是北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院腎病專家王耀獻(xiàn)教授多年來(lái)治療DKD的經(jīng)驗(yàn)方，他認(rèn)為“熱邪”是DKD發(fā)病的主要病因，“伏熱致癥”是DKD的核心病機(jī)，尤其在DKD中期，熱伏腎絡(luò)，結(jié)為癥瘕，故立清熱消癥法［14］，以清解內(nèi)積熱邪，消散腎絡(luò)癥瘕。前期臨床研究發(fā)現(xiàn)清熱消癥法在降低DKD中期患者的中醫(yī)證候評(píng)分和尿蛋白排泄量方面具有較好的臨床效果［15］。課題組體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明清熱消癥方可以調(diào)控腸源性脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）介導(dǎo)的下游炎癥通路，降低炎性因子toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）和核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的表達(dá)以及腸源性LPS水平，調(diào)節(jié)DKD小鼠的腸道菌群，降低DKD小鼠蛋白尿，抑制DKD腎損傷，發(fā)揮腎保護(hù)作用［16］。中藥的化學(xué)成分多樣，靶點(diǎn)繁多，因此本研究旨在通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確清熱消癥法是否可以通過(guò)抑制腎臟細(xì)胞衰老和凋亡，改善DKD腎損傷，延緩DKD進(jìn)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2019年7—11月選用SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，8周齡，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)自維通利華（北京）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔SCXK（京）2012-0001〕。將大鼠飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院屏障環(huán)境動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室〔SCXK（京）2015-0001〕，室溫22～25 ℃，濕度45%～60%，光照條件為明／暗交替循環(huán)12 h，大鼠自由飲水和飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。本實(shí)驗(yàn)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（編號(hào)：19-41）。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（貨號(hào)：s0130），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；檸檬酸緩沖液（貨號(hào)：C1013）、Masson染液（貨號(hào)：G1346）和糖原（PAS）染色液試劑盒（貨號(hào)：G1281）購(gòu)自索萊寶公司；蘇木素-伊紅（H-E）染液（貨號(hào)：D006-1-2）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；尿微量白蛋白試劑盒（貨號(hào)：ab235642）、p16抗體（貨號(hào)：ab51243）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；Caspase-3抗體（貨號(hào)：19677-1-AP）購(gòu)自Proteintech公司；一步法原位末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：C1088）、蛋白酶K（貨號(hào)：ST532）購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；山羊血清（ZLI-9056）、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、反應(yīng)增強(qiáng)液、增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗兔/鼠IgG聚合物（PV-9001/PV-9002）、熒光封片劑（含DAPI）（ZLI-9557）、中性快干膠封片劑（ZLI-9516）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。AU480全自動(dòng)生化儀（日本奧林巴斯）全自動(dòng)組織處理系統(tǒng)（美國(guó)美天旎公司），RM2135病理切片機(jī)，烤片機(jī)（德國(guó)Leica公司），BX60型顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 中藥制備 清熱消癥方藥物組成：黃芪30 g、黃蜀葵花30 g、熟大黃3 g、黃芩10 g、水蛭5 g、土鱉蟲10 g，購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥庫(kù)，中藥煎煮后水浴濃縮為1 g/ml，4 ℃冷藏備用，水煎煮和濃縮程序按照《中國(guó)藥典》2010版規(guī)定執(zhí)行。采用體表面積系數(shù)換算大鼠灌胃給藥劑量，以成年人70 kg，大鼠200 g，換算系數(shù)6.3計(jì)算［17］，中藥濃度為7.92 g·kg-1·d-1。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 DKD大鼠模型建立 30只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（NC組，n=10）和模型組（n=20）。在NC組大鼠右腎體表解剖位置，做長(zhǎng)約1 cm的橫行切口并縫合。模型組大鼠予右側(cè)腎切除，1周后觀察傷口愈合后，腹腔注射STZ造模。55 mg STZ溶解于檸檬酸緩沖液中，配置成1%的STZ溶液。根據(jù)參考文獻(xiàn)［18-19］的方法，將模型組20只大鼠禁食不禁水12 h后，單次腹腔注射STZ（55 mg/kg）構(gòu)建DKD模型。NC組大鼠注射等體積檸檬酸緩沖液。3 d后測(cè)定模型組大鼠尾靜脈血糖，留取DKD模型大鼠24 h尿液，若隨機(jī)血糖＞16.7 mmol/L，24 h尿蛋白定量＞30 mg/L，則表明DKD模型建立成功。

1.4.2 分組及給藥 將模型組大鼠隨機(jī)分為DKD亞組和清熱消癥方亞組（QRXZF亞組），每組10只。NC組和DKD亞組大鼠灌服等量（1 ml/100 g）0.9%氯化鈉溶液，1次/d。QRXZF亞組大鼠以7.92 g/kg的劑量進(jìn)行中藥灌胃，1次/d。干預(yù)期為16周。

兩組產(chǎn)婦在進(jìn)行剖宮產(chǎn)的時(shí)候，均采用腰硬聯(lián)合麻醉的方式，選擇美容切口，將產(chǎn)婦的皮膚全層進(jìn)行橫向切開，長(zhǎng)度控制在10 cm～12 cm之間，在切口鄭重的位置將脂肪層切開，深度為2 cm，在觸及筋膜層之后，對(duì)兩側(cè)進(jìn)行撕拉分離，將產(chǎn)婦的筋膜充分的暴露出來(lái)，然后將筋膜進(jìn)行橫向切開，分離產(chǎn)婦恥骨連接處的肌腱，避開產(chǎn)婦的脂肪，將膀胱推開，對(duì)產(chǎn)婦的子宮下段切開，實(shí)現(xiàn)胎兒的分娩，隨后對(duì)產(chǎn)婦的子宮進(jìn)行徹底的清理，進(jìn)行逐層縫合[3]。在兩組產(chǎn)婦經(jīng)過(guò)手術(shù)之后，對(duì)其各項(xiàng)資料進(jìn)行回顧性分析，進(jìn)行詳細(xì)的記錄。

1.4.3 血、尿、腎組織標(biāo)本留取和指標(biāo)檢測(cè) 干預(yù)期間每周測(cè)量各組大鼠體質(zhì)量。干預(yù)16周末次給藥后，測(cè)量大鼠體質(zhì)量，收集大鼠24 h尿液記錄尿量，離心轉(zhuǎn)速為3 000 r/min，離心半徑13.5 cm，4 ℃離心10 min后，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）測(cè)定大鼠尿微量白蛋白，根據(jù)尿量計(jì)算大鼠24 h尿微量白蛋白。打開大鼠腹腔，腹主動(dòng)脈取血，離心條件同前，離心10 min后，取上層血清，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)量各組大鼠血肌酐（Scr）、血清尿素氮（BUN）和血清白蛋白（ALB）；摘取腎臟并稱量腎臟重量，各組大鼠只留取左腎作為標(biāo)本，腎重指數(shù)=腎臟重量/體質(zhì)量×1 000。腎組織石蠟包埋，切成厚度2 μm的切片備用。

1.4.4 HE染色 HE染色具體步驟如下：（1）腎組織石蠟切片于60 ℃烤片機(jī)烤片1 h，新鮮二甲苯Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ脫蠟3次，10 min/次。（2）100%、95%、80%、75%梯度乙醇水化各3 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，5 min/次。（3）蘇木素染細(xì)胞核5 min，自來(lái)水沖洗2 min，1%鹽酸乙醇分化3 s，自來(lái)水沖洗15 min，返藍(lán)。（4）伊紅染色8 min，95%、95%、100%、100%梯度乙醇脫水各3 min。（5）二甲苯Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ各透明1次，10 min/次。中性樹膠封固，通風(fēng)櫥晾干后，在光鏡下對(duì)腎臟組織切片進(jìn)行觀察和分析。

1.4.5 PAS染色 PAS染色具體步驟如下：（1）腎組織常規(guī)烤片、脫蠟、水化同上，雙蒸水浸洗2次，5 min/次。（2）滴加氧化劑室溫反應(yīng)8 min。自來(lái)水沖洗1次，蒸餾水浸洗2次。（3）滴加Schiff染液，避光浸染20 min。自來(lái)水沖洗10 min。蘇木素染核2 min。酸性分化液分化2 s。自來(lái)水沖洗10 min返藍(lán)。脫水、透明同前，樹膠封固。PAS染色后，每張切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)200倍視野并采集圖像進(jìn)行腎小球硬化水平評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無(wú)硬化癥；1分，≤10%的腎小球硬化；2分，＞10%，≤25%的腎小球硬化；3分，＞25%～50%的腎小球硬化；4分，＞50%的腎小球硬化。

1.4.6 Masson染色 Masson染色具體步驟如下：（1）腎組織常規(guī)烤片、脫蠟、水化同上，媒染液室溫過(guò)夜媒染。（2）次日流水沖洗10 min，滴加天青石藍(lán)染色液染色2～3 min，水洗2次，15 s/次。（3）Mayer蘇木素染核3 min，雙蒸水洗2次，10～15 s/次。酸性乙醇分化液分化3 s至組織完全變紅，水洗終止分化，雙蒸水沖洗10 min。（4）麗春紅染色10 min，雙蒸水洗2次，15 s/次。（5）磷鉬酸溶液處理約10 min。傾去上液，滴加苯胺藍(lán)染色液染色5 min。（6）弱酸溶液洗去苯胺藍(lán)后，繼續(xù)滴加弱酸處理2 min。（7）脫水、透明、封固同前。每張切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)200倍視野并采集圖像，使用Image-Pro Plus 6.0軟件檢測(cè)腎臟組織藍(lán)色膠原纖維面積百分比。

1.4.7 免疫組化法（IHC）檢測(cè)腎組織中p16和Caspase-3表達(dá) IHC具體步驟如下：（1）腎組織常規(guī)烤片、脫蠟和水化。（2）95 ℃的檸檬酸鹽抗原修復(fù)液修復(fù)20 min。（3）滴加100 μl內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻滯劑，室溫孵育10 min；PBS洗5 min，重復(fù)3次。（4）100 μl山羊血清，濕盒中37 ℃封閉30 min。（5）滴加p16（1∶50）和Caspase-3抗體（1∶100），濕盒中4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。（6）次日恢復(fù)室溫20 min，滴加100 μl反應(yīng)增強(qiáng)液劑，37 ℃孵育30 min。PBS洗3次，5 min/次。（7）滴加羊抗兔或者羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育30 min后PBS洗滌，方法同上。（8）DAB染色約1 min，用雙蒸水終止反應(yīng)后，蘇木素染核8 min。脫水、透明、封固同前。每張切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)200倍視野并采集圖像。p16和Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)通過(guò)Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)累積光密度值（IOD）和陽(yáng)性面積（Area），取二者比值為表達(dá)水平。

1.4.8 TUNEL法檢測(cè)腎小管細(xì)胞凋亡率 （1）腎組織常規(guī)烤片、脫蠟和水化。（2）滴加20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K〔碧云天ST532/ST533蛋白酶K（20 mg/ml），用P0106免疫染色洗滌液或10 mmol/L Tris-HCl pH 7.4～7.8稀釋1 000倍即為20 μg/ml不含DNase的蛋白酶K〕，20～37 ℃作用15 min。（3）PBS洗滌3次。在樣品上加50 μl TUNEL檢測(cè)液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗滌3次。（4）含DAPI的抗熒光淬滅封固液封片后熒光顯微鏡下觀察。每張切片隨機(jī)挑選至少3個(gè)400倍視野并采集圖像。通過(guò)Image J對(duì)綠色凋亡細(xì)胞和藍(lán)色細(xì)胞核進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取二者比值的百分?jǐn)?shù)為凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和腎重指數(shù)結(jié)果 各組大鼠體質(zhì)量和腎重指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其中DKD亞組、QRXZF亞組體質(zhì)量均低于NC組，腎重指數(shù)均高于NC組（P＜0.01）；QRXZF亞組體質(zhì)量高于DKD亞組、腎重指數(shù)低于DKD亞組（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腎重指數(shù)水平比較（±s）Table 1 Comparison of body weight and kidney weight index in rats in control group，DKD and QRXZF subgroups

表1 各組大鼠體質(zhì)量、腎重指數(shù)水平比較（±s）Table 1 Comparison of body weight and kidney weight index in rats in control group，DKD and QRXZF subgroups

注：NC組=假手術(shù)組，DKD亞組=糖尿病腎病亞組，QRXZF亞組=清熱消癥方亞組；a表示與NC組相比P＜0.01，b表示與DKD亞組相比P＜0.01；因血清樣本時(shí)有溶血，以及剔除異常值后，為保證各組樣本量一致，各組選取樣本時(shí)n=6

組別 只數(shù) 體質(zhì)量（g） 腎重指數(shù)（%）NC組 6 488.83±36.71 2.80±0.10 DKD 亞組 6 230.33±38.61a 11.11±0.93a QRXZF 亞組 6 318.67±40.89ab 9.13±1.04ab F值 68.92 127.93 P值 ＜0.01 ＜0.01

2.2 各組大鼠24 h尿微量白蛋白、Scr、BUN和ALB結(jié)果 各組大鼠24 h尿微量白蛋白、Scr、BUN和ALB比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中DKD亞組24 h尿微量白蛋白、Scr、BUN水平均高于NC組，ALB水平低于NC組（P＜0.01）；QRXZF亞組24 h尿微量白蛋白、BUN水平均高于NC組，ALB水平低于NC組（P＜0.01）；QRXZF亞組24 h尿微量白蛋白、Scr、BUN水平均低于DKD亞組，ALB水平高于DKD亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見表2。

表2 各組大鼠Scr 、BUN、ALB和24 h尿微量白蛋白水平比較（±s）Table 2 Comparison of the levels of Scr，BUN，ALB and 24 h Upro in rats in control group，DKD and QRXZF subgroups

表2 各組大鼠Scr 、BUN、ALB和24 h尿微量白蛋白水平比較（±s）Table 2 Comparison of the levels of Scr，BUN，ALB and 24 h Upro in rats in control group，DKD and QRXZF subgroups

注：Scr=血肌酐，BUN=尿素氮，ALB=白蛋白；a表示與NC組相比P＜0.01，b表示與DKD亞組相比P＜0.01；因血清樣本時(shí)有溶血，以及剔除異常值后，為保證各組樣本量一致，各組選取樣本時(shí)n=6

ALB（g/L）NC 組 6 20.35±5.00 27.50±4.22 5.41 ± 0.28 27.9±1.95 DKD亞組 6 68.15±12.70a 44.45±6.46a 24.47±3.06a 22.55±0.69a QRXZF亞組 6 41.19±7.0ab 31.90±4.09b 14.40±2.60ab 25.68±1.16ab F值 26.55 10.22 54.98 23.09 P值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01組別 只數(shù)24 h尿微量白蛋白（mg/L）Scr（μmol/L）BUN（mmol/L）

2.3 各組大鼠腎臟組織病理染色結(jié)果

2.3.1 HE染色結(jié)果 HE染色可見：DKD亞組腎小球肥大，系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增生，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性；QRXZF亞組大鼠腎臟病理變化程度明顯輕于DKD亞組；NC組大鼠腎小球、腎小管及系膜基質(zhì)未見明顯病理變化，詳見圖1。

2.3.2 PAS染色結(jié)果 PAS染色可見：NC組大鼠腎小球均勻光滑，腎小管基膜及系膜基質(zhì)無(wú)明顯病理性改變，腎小球血管袢薄，未見腎小球肥大及腎小管管型。DKD亞組大鼠腎組織損傷明顯，腎小球基底膜明顯增厚，系膜細(xì)胞及基質(zhì)增多，部分腎小管出現(xiàn)空泡樣病變，管腔擴(kuò)張，可見腎間質(zhì)水腫。QRXZF亞組大鼠腎小球基底膜較NC組輕度增厚，腎小管管腔輕度擴(kuò)張，系膜細(xì)胞增多不明顯，詳見圖1。對(duì)PAS染色進(jìn)行量化評(píng)分發(fā)現(xiàn)，NC組PAS腎小球硬化評(píng)分為（0.68±0.47）分，DKD亞組為（3.36±0.49）分，QRXZF亞組為（1.50±0.51）分，各組PAS腎小球硬化評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=170.42，P＜0.01）；其中DKD亞組和QRXZF亞組PAS腎小球硬化評(píng)分高于NC組，QRXZF亞組PAS腎小球硬化評(píng)分低于DKD亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3.3 Masson染色結(jié)果 Masson染色可見：DKD亞組腎小管嚴(yán)重萎縮，腎小球、小管及間質(zhì)出現(xiàn)大量藍(lán)色膠原纖維；QRXZF亞組大鼠腎小球及間質(zhì)存在少量藍(lán)色膠原沉積物，腎小管輕度萎縮；NC組大鼠腎小球基底膜、系膜基質(zhì)均正常，未見間質(zhì)纖維化，詳見圖1。對(duì)各組大鼠腎組織Masson染色陽(yáng)性區(qū)域面積進(jìn)行定量分析，NC組藍(lán)色膠原纖維面積百分比為（11.96±0.42）%，DKD亞 組 為（25.51±1.42）%，QRXZF亞 組 為（16.10±0.55）%，各組藍(lán)色膠原纖維面積百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1102.28，P＜0.01）；其中DKD亞組和QRXZF亞組藍(lán)色膠原纖維面積百分比均高于NC組，QRXZF亞組藍(lán)色膠原纖維面積百分比低于DKD亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)變化（×200）Figure 1 Renal morphological changes of rats in control group，DKD and QRXZF subgroups

2.4 各組大鼠p16和Caspase-3 IHC染色結(jié)果

2.4.1 各組大鼠IHC腎組織p16檢測(cè) NC組大鼠腎組織p16表達(dá)水平為（0.12±0.01），DKD亞組大鼠腎組織p16表達(dá)水平為（0.42±0.02），QRXZF亞組大鼠腎組織p16表達(dá)水平為（0.20±0.01）。三組大鼠腎組織p16表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2 138.86，P＜0.01）；其中DKD亞組、QRXZF亞組腎組織p16表達(dá)水平高于NC組，QRXZF亞組腎組織p16表達(dá)水平低于DKD亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

2.4.2 各組大鼠IHC腎組織Caspase-3檢測(cè) NC組大鼠腎組織Caspase-3表達(dá)水平為（0.10±0.02），DKD亞組大鼠腎組織Caspase-3表達(dá)水平為（0.62±0.08），QRXZF亞組大鼠腎組織Caspase-3表達(dá)水平為（0.18±0.02）。三組大鼠腎組織Caspase-3表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=913.54，P＜0.01）。其中DKD亞組、QRXZF亞組腎組織Caspase-3表達(dá)水平高于NC組，QRXZF亞組腎組織Caspase-3表達(dá)水平低于DKD亞組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織p16和Caspase-3表達(dá)（×200）Figure 2 Expression levels of p16 and Caspase-3 in renal tissue of rats in control group，DKD and QRXZF subgroups

2.5 各組大鼠腎小管細(xì)胞凋亡情況比較 NC組大鼠腎小管細(xì)胞凋亡率為（1.50±0.19）%，DKD亞組大鼠腎小管細(xì)胞凋亡率為（12.49±0.83）%，QRXZF亞組大鼠腎小管細(xì)胞凋亡率為（5.11±0.75）%。三組大鼠腎小管細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1 533.96，P＜0.01）。其中DKD亞組、QRXZF亞組大鼠腎小管細(xì)胞凋亡率高于NC組，QRXZF亞組腎小管細(xì)胞凋亡率低于DKD亞組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖3。

圖3 各組大鼠腎組織腎小管細(xì)胞凋亡情況（×400）Figure 3 Apoptosis of renal tubular cells in renal tissue of rats in control group，DKD and QRXZF subgroups

3 討論

研究證實(shí)腎臟細(xì)胞衰老和凋亡是DKD發(fā)生、發(fā)展的重要原因［20］。高糖可導(dǎo)致腎小球系膜細(xì)胞過(guò)早衰老［21］，衰老與腎纖維化密切相關(guān)。2型糖尿病患者的腎臟近端小管可見大量衰老細(xì)胞，其腎小球中p16INK4A表達(dá)與蛋白尿水平呈正相關(guān)［22］。研究證實(shí)，抑制p16可減輕衰老相關(guān)的分泌表型SASP（senescence-associated secretory phenotype）的表達(dá)［23］，抑制p16等衰老相關(guān)因子的表達(dá)，改善DKD腎損傷［24-25］。本研究對(duì)各組大鼠腎組織進(jìn)行衰老相關(guān)蛋白p16的IHC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與NC組相比，DKD亞組和QRXZF亞組p16陽(yáng)性染色明顯更深，且QRXZF亞組明顯低于DKD亞組。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)清熱消癥方可以有效減少DKD大鼠腎組織中p16的表達(dá)。

Caspase-3是關(guān)鍵的凋亡因子，處于Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的末端，并被細(xì)胞凋亡的內(nèi)在和外在死亡途徑激活，活化的Caspase-3可降解細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［26］。細(xì)胞凋亡會(huì)導(dǎo)致腎細(xì)胞外基質(zhì)沉積、腎小管上皮細(xì)胞肥大以及腎小球膜擴(kuò)張，直至腎小管間質(zhì)纖維化和腎小球硬化［27-28］。本研究采用凋亡試劑盒對(duì)大鼠腎小管進(jìn)行凋亡細(xì)胞檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DKD亞組大鼠凋亡細(xì)胞率明顯高于NC組和QRXZF亞組。IHC結(jié)果顯示，Caspase-3在DKD大鼠腎組織中的陽(yáng)性面積明顯大于NC組和QRXZF亞組，說(shuō)明清熱消癥方可以減少腎臟細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)清熱消癥方可以降低DKD大鼠24 h尿微量白蛋白水平。在腎功能指標(biāo)方面，與NC組相比，DKD亞組大鼠Scr和BUN顯著升高，而QRXZF亞組明顯低于DKD亞組，說(shuō)明清熱消癥方可以促進(jìn)腎臟代謝，保護(hù)DKD大鼠的腎功能。本研究還發(fā)現(xiàn)DKD亞組大鼠出現(xiàn)消瘦和腎臟肥大，其體質(zhì)量低于NC組和QRXZF亞組，而腎重指數(shù)則明顯高于其他兩組。因此，筆者認(rèn)為清熱消癥方可以改善DKD大鼠消瘦狀況，減少腎小球肥大。HE染色發(fā)現(xiàn)，DKD亞組大鼠腎臟基底膜增厚，系膜細(xì)胞和基質(zhì)增厚，腎小管擴(kuò)張等。Masson染色提示，DKD亞組大鼠腎小管和間質(zhì)藍(lán)色膠原沉積較其他兩組更明顯，QRXZF亞組藍(lán)色膠原面積較少，說(shuō)明清熱消癥方可以減少高糖環(huán)境引起的膠原沉積，改善腎臟纖維化。PAS染色發(fā)現(xiàn)，QRXZF亞組腎小球系膜增厚較DKD亞組程度輕。因此，筆者認(rèn)為清熱消癥方可以改善腎臟纖維化，保護(hù)腎臟病理?yè)p傷。

清熱消癥方由黃芪、黃蜀葵花、黃芩、熟大黃、水蛭、土元六味藥組成，全方共奏清熱散結(jié)、益氣活血消癥之效。方中黃芪大補(bǔ)元?dú)?，氣旺則推動(dòng)血行，使瘀血去，絡(luò)脈通。方中黃芩瀉火解毒、清熱燥濕，善清陽(yáng)明胃經(jīng)之熱，阻斷陽(yáng)明經(jīng)熱之源頭。黃蜀葵花味辛，性涼，辛味走竄性強(qiáng)，能散、能行、能開郁結(jié)，可宣達(dá)三焦之氣機(jī)，功善清熱解毒。大黃善瀉下攻積、清熱解毒、活血化瘀，蕩滌胃腸熱邪，瀉濁通腑，破積滯，行瘀血，消癥瘕。水蛭功專破血通經(jīng)，逐瘀消癥，善化腎絡(luò)之瘀血，《神農(nóng)本草經(jīng)》云：“主逐惡血，瘀血，月閉，破血瘕積聚，無(wú)子，利水道。”土鱉蟲能軟堅(jiān)散結(jié)，消癥瘕積聚?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》曰：“主心腹寒熱洗洗，血積癥瘕，破堅(jiān)，下血閉。”研究證實(shí)清熱消癥方中多種化學(xué)成分具有抗衰老作用和凋亡作用，如黃芪的活性成分黃芪多糖可以通過(guò)調(diào)控機(jī)體免疫，清除自由基及抗脂質(zhì)過(guò)氧化發(fā)揮抗衰老作用［29］，黃蜀葵花的有效活性成分槲皮素可以減少DKD患者脂肪和皮膚組織中的p16INK4A和p21CIP1等衰老細(xì)胞因子的表達(dá)［30］，槲皮素還可以降低高糖刺激的小鼠腎小球系膜細(xì)胞中Casapse-3的表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，拮抗葡萄糖波動(dòng)引起的腎損傷［31］。

綜上所述，本研究推測(cè)清熱消癥方可能通過(guò)下調(diào)DKD大鼠腎組織中p16和Caspase-3的表達(dá)，抑制腎臟細(xì)胞衰老和凋亡，改善腎臟病理?yè)p傷，延緩DKD進(jìn)展。

作者貢獻(xiàn)：王玉潔進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，文獻(xiàn)資料和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的收集與整理，撰寫論文；王健協(xié)助實(shí)驗(yàn)操作；周靜威負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)。

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