，趙應(yīng)龍，吳靜楠，李錦，蔡懿琳，楊莎莎，張以芳，柴俊

(1.尋甸縣塘子街道辦事處農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心畜牧科，云南 尋甸 655203； 2.永平縣杉陽鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心畜牧獸醫(yī)組，云南 永平 672607；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650201)

禽霍亂是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)引起的禽類敗血性傳染病[1]。可引起雞、鴨、鵝等禽類的死亡。禽霍亂主要侵害3月齡以上的禽類，性成熟后的禽類最易感，高產(chǎn)母雞感染后死亡率最高[2]，近年來，巴氏桿菌在禽類養(yǎng)殖中有流行的趨勢(shì)[3]。本試驗(yàn)對(duì)昆明地區(qū)送檢的病雞樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過細(xì)菌分離鑒定確定病原菌并進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，為禽多殺性巴氏桿菌的鑒別診斷及抗s菌藥物選擇提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

樣品來源于昆明地區(qū)某養(yǎng)雞場(chǎng)送檢的疑似巴氏桿菌感染的病雞6只。

1.2 主要試劑與儀器

血瓊脂培養(yǎng)基、微量生化鑒定管、瑞氏染液、革蘭氏染液、藥敏紙片購于杭州天和微生物試劑有限公司，DNA提取試劑盒、PCR試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司。根據(jù)GenBank公布的多殺性巴氏桿菌的基因組序列，應(yīng)用Oligo 7軟件設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)kmtI基因的特異性檢測(cè)引物，上游引物序列為F-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物為R-GCTGTAAACGAACTCGCCAC，大小為460 bp，引物由擎科生物公司合成。

1.3 細(xì)菌的分離純化及染色鏡檢

無菌采取病雞的肺、心臟、肝臟等臟器組織在營(yíng)養(yǎng)肉湯中用37℃搖床進(jìn)行過夜培養(yǎng)，用滅菌的接種環(huán)接種于血瓊脂培養(yǎng)基中37℃恒溫培養(yǎng)18～24h,純化培養(yǎng)后，進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色和革蘭氏染色鏡檢。

1.4 生化試驗(yàn)

將純化培養(yǎng)菌液接種在葡萄糖、蔗糖、木糖等微量生化鑒定管。按產(chǎn)品說明書操作并觀察結(jié)果。

1.5 菌株的PCR鑒定

純培養(yǎng)菌液1mL于Eppendorf管中，沸水浴中加熱3min，進(jìn)行PCR，其反應(yīng)體系為25μL體系：包括2×Taq Super Mix 12.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、菌液2μL、ddH2O 8.5μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min循環(huán)30次，72℃再延伸10min。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察電泳條帶。陽性樣品膠回收送擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，利用DNAStar生物學(xué)軟件將測(cè)序序列與GenBank中基因序列分別進(jìn)行核苷酸同源性比較分析。

1.6 藥敏試驗(yàn)

取100μL純培養(yǎng)菌液移至1%的血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂上，并用無菌L棒涂布菌液，貼上藥敏片置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24h。測(cè)量抑菌圈直徑，判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圈直徑>15.1mm為高敏(S)，10.1mm≤直徑≤15.1mm為中敏(L)，<10.1mm為耐藥(R)。

2 結(jié)果與分析

分離細(xì)菌經(jīng)分離純化、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR鑒定及測(cè)序，確診為多殺性巴氏桿菌。

2.1 細(xì)菌分離與表型鑒定結(jié)果

分離純化接種血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h，在血瓊脂上生成灰白色、露珠樣的菌落，菌落周圍無溶血現(xiàn)象，如圖1所示。瑞氏染色經(jīng)鏡檢可見兩端著色較深、周邊有莢膜的小桿菌，如圖2所示。

圖1 血瓊脂培養(yǎng)基的分離純化

圖 2 瑞氏染色鏡檢

2.2 生化試驗(yàn)結(jié)果

細(xì)菌生化培養(yǎng)可利用葡萄糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不能利用肌醇、乳糖，可產(chǎn)生硫化氫，能形成靛基質(zhì)。MR和V-P試驗(yàn)均為陰性，接觸酶和氧化酶試驗(yàn)均為陽性，尿素酶陰性，不液化明膠，與巴氏桿菌特性相符。

2.3 PCR產(chǎn)物電泳鑒定及測(cè)序結(jié)果

培養(yǎng)細(xì)菌利用巴氏桿菌kmtI基因的特異性檢測(cè)引物進(jìn)行基因擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳鑒定，結(jié)果顯示出與預(yù)期的試驗(yàn)結(jié)果相符(460 bp)的特異性目的條帶(圖3) 。利用DNAStar生物學(xué)軟件將擴(kuò)增的kmtI基因序列與GenBank中的巴氏桿菌kmtI基因序列分別進(jìn)行核苷酸同源性比較分析，同源性為100%。

2.4 藥敏試驗(yàn)及結(jié)果

分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、新霉素、卡那霉素、復(fù)方新諾明、呋喃唑酮、氯霉素、氟苯尼考、阿米卡星、麥迪霉素共14種抗菌素高敏。對(duì)氨芐西林、頭孢氨芐、青霉素、克林霉素、米諾環(huán)素、多粘菌素、慶大霉素共7種抗菌素中敏。對(duì)氧氟沙星、萬古霉素、紅霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、林可霉素、多西環(huán)素、苯唑西林共8種抗菌素有耐藥性。

3 討論

禽巴氏桿菌多為條件性致病菌，大多數(shù)是內(nèi)源性感染，當(dāng)動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降時(shí)常引起發(fā)病。因此，對(duì)該病的防控主要以提高動(dòng)物機(jī)體抵抗力和做好飼養(yǎng)管理工作為主。云南氣候類型為亞熱帶季風(fēng)氣候，光照條件較好，降雨日數(shù)多，相對(duì)濕度較大。通風(fēng)不良會(huì)使禽舍內(nèi)陰暗潮濕，易滋生細(xì)菌，使禽患病的風(fēng)險(xiǎn)加大[4,5]。

多殺性巴氏桿菌的耐藥性因地域存在差異性。分離菌對(duì)四環(huán)素類、喹諾酮類藥物等有耐藥性，耐藥基因的產(chǎn)生可能是飼養(yǎng)過程中長(zhǎng)期濫用四環(huán)素類和喹諾酮類藥物所致，為適應(yīng)生存環(huán)境，變異出抵抗該類抗菌藥物的菌群。臨床治療多殺性巴氏桿菌時(shí)，應(yīng)結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選用合適的抗菌藥物如環(huán)丙沙星、頭孢唑啉、頭孢呋辛等以增加治療效果，減少雞場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)減少耐藥菌株的產(chǎn)生[6]。

禽巴氏桿菌危害嚴(yán)重，依據(jù)免疫程序按時(shí)注射疫苗，可大大降低該病的發(fā)生率，有效預(yù)防該病在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)。我國雞巴氏桿菌病疫苗主要是菌苗, 但因多殺性巴氏桿菌血清型多 (16種) 、交叉免疫力低, 導(dǎo)致疫苗免疫效果不理想。但王華等人從分離出的雞多殺性巴氏桿菌基于其毒力因子外膜蛋白 (OMP) 制成亞單位疫苗, 較菌苗免疫效果好[7]，為禽霍亂有效預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)和可行性。另外，多殺性巴氏桿菌屬于條件致病菌，因此，需要搞好養(yǎng)殖場(chǎng)的環(huán)境衛(wèi)生，對(duì)雞舍做好消毒管理，及時(shí)通風(fēng)透氣，同時(shí)飼料添加維生素和飼喂蛋白質(zhì)飼料，增加雞群的免疫力，可有效避免雞場(chǎng)禽霍亂的暴發(fā)。