薛經(jīng)緯 陶智會 李 勇 朱 毅

(1 上海市嘉定區(qū)中醫(yī)醫(yī)院內(nèi)一科，上海,201800； 2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院全科，上海,200137； 3 上海市中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科，上海,200071)

慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Diseases，COPD)是以不完全可逆的氣流受限為主要特征，進(jìn)行性加重、可治療、可預(yù)防的呼吸系統(tǒng)常見疾病。由于COPD早期診斷較少，直至確診時，患者病情嚴(yán)重，給患者生命質(zhì)量、肺功能和心理狀態(tài)均造成極大的危害。現(xiàn)階段臨床常采用的常規(guī)治療措施以及藥物，通常僅可以使癥狀得到改善，使急性加重的程度與次數(shù)得到緩解，卻無法從根本上遏制肺功能的惡化，同時也出現(xiàn)了一些濫用激素以及抗生素的現(xiàn)象，引發(fā)了患者產(chǎn)生耐藥性、免疫力下降、菌群構(gòu)成失調(diào)以及嚴(yán)重的腸道不良反應(yīng)等方面的問題。隨著研究的不斷深入，中醫(yī)在COPD治療方面已取得了明顯的進(jìn)展，相關(guān)研究表明，常規(guī)治療與中醫(yī)辨證深度融合可以使COPD患者的癥狀得到改善、急性加重次數(shù)下降、生命質(zhì)量與運(yùn)動耐力得到一定的提高。

目前，COPD的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。多數(shù)研究者認(rèn)為氣道和肺部的慢性炎癥是導(dǎo)致COPD發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制，此外蛋白酶與抗蛋白酶系統(tǒng)、氧化與抗氧化作用以及自主神經(jīng)系統(tǒng)等方面發(fā)生功能紊亂均在COPD進(jìn)展中起重要作用[1]。最新研究發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3,NLRP3)炎性小體是機(jī)體固有免疫的組分，它活化后參與了機(jī)體抵御外源性病原體的入侵[2-3]。目前研究已表明許多肺部的慢性炎癥性疾病中都存在NLRP3炎性小體的激活，這些研究結(jié)果為繼續(xù)探索COPD的發(fā)病機(jī)制及開發(fā)新藥物及新的診療手段提供了一定的思路。

方邦江教授通過長期的臨床實(shí)踐認(rèn)為痰濁壅肺證是COPD的主要證型之一，治療上應(yīng)以理肺、化痰、祛瘀立法，辨證論治，盡可能祛除外邪，改善癥狀，防止病情加重，使患者快速進(jìn)入穩(wěn)定期。故而創(chuàng)立了寬胸理肺湯，其由瓜蔞薤白半夏湯、二陳湯、三拗湯三方組成，臨場療效確切。而三子養(yǎng)親湯是醫(yī)治氣滯痰壅的經(jīng)典名方，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎等作用。本課題組前期臨床究結(jié)果表明，寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯治療COPD患者，能有效抑制全身炎癥反應(yīng),降低白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞比例，降低血清炎癥介質(zhì)水平，改善肺功能，從而改善COPD急性加重期痰濁壅肺證患者的臨床癥狀體征[4-5]。為進(jìn)一步證實(shí)寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯的有效性及初步探討其藥理機(jī)制，本課題組擬采用煙熏誘導(dǎo)的大鼠COPD模型觀察寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯對COPD大鼠肺組織的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 雄性清潔級Wistar大鼠共42只，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購自上海實(shí)驗(yàn)動物中心,生產(chǎn)許可SCXK(滬)2018-0004。清潔級動物房飼養(yǎng)，恒溫(25±2)℃、恒濕，人工光照12 h，黑暗12 h，自由進(jìn)食飲水。本研究經(jīng)上海市中醫(yī)醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)倫理及福利委員會討論、審查后同意進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)(動物倫理審查號：SZY-2018-010-21)。

1.1.2 藥物 實(shí)驗(yàn)藥物及制備：處方組成：麻黃9 g、杏仁12 g、全瓜蔞30 g、薤白12 g、半夏10 g、橘紅6 g、茯苓15 g、甘草6 g、桃仁10 g、地龍9 g、蘇子10 g、萊菔子10 g、白芥子10 g。以上飲片由上海萬仕誠藥業(yè)有限公司提供。用自動煎藥機(jī)煎煮成200 mL湯藥，濃縮4倍，按實(shí)驗(yàn)所需濃度稀釋。

1.1.3 試劑與儀器 主要試劑：NLRP3(Santa Cruz公司，美國，貨號：sc-34410)、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis-associated Speck-like Protein,ASP)抗體(Santa Cruz公司，美國，貨號：sc-514414)、胱天蛋白酶1抗體(Abcam公司，美國，貨號：ab179515)、辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠、兔IgG(Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：7076/7074)、β-actin抗體(Cell Signaling Technology公司，美國，貨號：3700)，白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)、IL-18酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(上海西唐生物科技有限公司，貨號：F15810，F(xiàn)15950)，腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate，ATP)、JC-1檢測試劑盒(碧云天生物科技有限公司，貨號：S0026，C2006)，MitoSOX Red探針(Thermo公司，美國，貨號：M36008)；脂多糖(Sigma公司，美國，貨號：L8274)。臺式高速冷凍離心機(jī)(Heal force公司，型號：Neofuge 15R)，熒光酶標(biāo)儀(Thermo scientific公司，美國，型號：Var10skan Flash)，洗板機(jī)(Labsystems dragon公司，芬蘭，型號：Wellwash 4mk2)，電動勻漿機(jī)(上海凈信公司，型號：JX-FSTPRP-48)，微型垂直電泳、電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-rad公司，美國，型號：Mini-PROTEAN)，全自動顯影系統(tǒng)(Bio-rad公司，美國，型號：ChemiDocTMXRS+)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 實(shí)驗(yàn)動物按體質(zhì)量進(jìn)行隨機(jī)分組，共6組，每組7只，分組如下：寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯低、中、高劑量組，模型組，陽性對照藥乙酰半胱氨酸組(NAC組)和對照組。COPD模型制作[6]：采用煙熏加氣管滴注脂多糖法制備COPD大鼠模型。對照組大鼠每天正常呼吸新鮮空氣，模型組大鼠在染毒箱內(nèi)被動吸煙每天12支/次，染毒時間為30 min，其余時間呼吸新鮮空氣。并且在第1天及第14天時，將模型組大鼠進(jìn)行麻醉后在氣管內(nèi)滴注200 μL脂多糖水溶液(1 mg/mL)，滴注過程需緩慢，對照組使用相同體積的0.9%生理鹽水進(jìn)行氣管滴注，滴注日不進(jìn)行染毒操作。連續(xù)煙熏28 d后，驗(yàn)證模型制備成功。

1.2.2 給藥方法 中藥高、中、低劑量組分別按照5、2.5、1.25 g生藥/kg的藥物劑量，為臨床用藥的2、1、0.5倍，乙酰半胱氨酸組的給藥劑量為0.8 g/kg，為臨床用藥的1倍，藥物均用0.5%羧甲基纖維素鈉配制。

模型組和對照組分別灌服0.5%羧甲基纖維素鈉。每組藥物按照10 mL/kg的體積，1次/d，持續(xù)給藥28 d。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 各組大鼠在末次給藥后24 h，分別用10 mg/mL濃度的戊巴比妥納進(jìn)行麻醉，隨后解剖開胸經(jīng)心臟采集血液，并在常溫下，以3 500×g的速度進(jìn)行離心操作，離心10 min后將血清抽取存放至EP管中，隨后保存在-20 ℃冰箱以備后續(xù)檢測，并且將一部分大鼠肺組織放置于4%多聚甲醛進(jìn)行組織固定，以備制作病理切片，另取用錫紙將一部分肺組織包裹后放-80 ℃冰箱保存以備后續(xù)蛋白檢測，另一部分則快速進(jìn)行線粒體抽取及相關(guān)檢測工作。蛋白質(zhì)印跡法檢測按參考文獻(xiàn)[7]操作，將適量大鼠加入放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation Assay，RIPA)裂解緩沖液，隨后組織勻漿、超聲裂解、低溫高速離心、抽取上清等操作步驟提取組織蛋白。并經(jīng)過二喹啉甲酸(Bicinchoninic Acid，BCA)法蛋白定量后按調(diào)定的蛋白比例加入5×上樣緩沖液，煮沸變性待測。將蛋白樣本經(jīng)凝膠電泳分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。隨后經(jīng)封閉、洗滌、一抗孵育(2%牛血清白蛋白稀釋至1∶500～1∶1 000)、洗滌、二抗孵育(5%脫脂奶粉稀釋至1∶1 000～1∶2 000)、洗滌、顯影等步驟，最后使用ChemiDocTMXRS+凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行蛋白半定量分析，用目的蛋白/內(nèi)參蛋白的光密度值比率來表示目的蛋白的相對表達(dá)量。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

線粒體膜電位、ATP、活性氧的測定[8]：1)按試劑盒步驟提取肺組織的線粒體；2)肺組織線粒體膜電位檢測：將提取的線粒體質(zhì)量懸后按說明書要求的比例加入稀釋后的JC-1工作液。用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，檢測JC-1單體、JC-1聚合物分別按照490 nm/530 nm(綠光)及525 nm/590 nm(紅光)波長設(shè)置激發(fā)光和發(fā)射光；紅/綠的結(jié)果代表線粒體膜電位值；3)肺組織線粒體ATP的檢測：將提取的線粒體用ATP裂解液分解后離心提取上清液待檢，ATP檢測工作液與樣本按100/5 μL比例進(jìn)行加樣，混合2 s以上上機(jī)檢測，ATP的濃度要參照標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。最后用BCA法定量蛋白，將ATP濃度單位換算成μmol/mg。4)將分離的線粒體懸于40 μL的線粒體貯存液中。在黑色96孔板中毎孔加300 μL MitoSOX探針工作液及10 μL重懸的線粒體，隨后37 ℃避光孵育30 min，用含鈣鎂的漢斯緩沖鹽溶液洗滌3次后加入適量緩沖液，用熒光酶標(biāo)儀檢測，將激發(fā)光與發(fā)射光分別設(shè)置510 nm及580 nm波長。用BCA法定量蛋白，將活性氧含量換算成熒光強(qiáng)度rfu/mg。

2 結(jié)果

2.1 肺組織線粒體損傷情況變化 與對照組比較，模型組大鼠肺組織線粒體ATP合成量顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，線粒體膜電位水平有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，活性氧生成顯著增加。寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯呈劑量依賴性升高COPD大鼠肺組織線粒體ATP合成量，降低活性氧生成(P<0.01)，但對線粒體膜電位無顯著作用。陽性對照藥物NAC也可顯著升高COPD大鼠肺組織線粒體ATP合成量，降低活性氧生成(P<0.01)。見表1。

表1 寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯對COPD大鼠線粒體功能的影響

2.2 肺組織NLRP3炎性小體表達(dá)變化 COPD大鼠NLRP3、凋亡相關(guān)斑樣蛋白、胱天蛋白酶1-p10蛋白表達(dá)顯著上升，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯各劑量及NAC干預(yù)后，COPD大鼠的NLRP3炎性小體各蛋白表達(dá)呈顯著下降趨勢(P<0.05)。見圖1。

圖1 寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯對COPD大鼠NLRP3炎性小體的影響

2.3 肺組織炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-18變化 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)COPD大鼠IL-1β、IL-18含量顯著高于對照組(P<0.05)。寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯各劑量及NAC干預(yù)后，均可使COPD大鼠IL-1β、IL-18含量顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯對COPD大鼠肺組織IL-1β、IL-18含量的影響

3 討論

COPD屬于一種可防可治、常見的疾病，該病的主要表現(xiàn)是氣流受限與呼吸道癥狀，其導(dǎo)致原因是氣道和(或)肺泡異常，常由于長期暴露于有害顆粒或氣體所引發(fā)。本病以咳嗽、咳痰、呼吸困難為主要臨床表現(xiàn)，同時具有病情遷延不愈、癥狀常年存在或者疾病反復(fù)發(fā)作性，具有病程長、易復(fù)發(fā)等特征[9]。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計,全球約有6 500萬患者罹患中重度COPD；中國COPD總體發(fā)病率為8.6%，40歲以上人群發(fā)病率高達(dá)13.7%，以此估算我國COPD患者可達(dá)到9 990萬，已成為與高血壓、糖尿病“等量齊觀”的慢性疾病[10]。2017年世界范圍內(nèi)有391.4萬人死于慢性呼吸道類疾病，而有319.7萬人死于COPD[11-12]。雖然目前治療COPD的手段可以在一定程度上使患者的臨床癥狀得到緩解，提高患者的生命質(zhì)量，不過卻無法有效抑制病情的發(fā)展，所以，對COPD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探索，研究出更有效的治療措施具有一定的臨床意義。

COPD具有極為復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制，目前尚未完全闡明?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對COPD的發(fā)病機(jī)制作了廣泛而深入的研究，提出了多種不同的假說，比如細(xì)胞凋亡、蛋白酶失衡、炎癥機(jī)制以及抗氧化失衡機(jī)制等，此外也有一些學(xué)者提出了無效受損修復(fù)、微生物組變化與自身免疫反應(yīng)等機(jī)制[13]。上述假說的提出豐富了人類對COPD的認(rèn)知，為相關(guān)研究的開展與深入提供了理論依據(jù)。COPD的特征是不完全可逆氣流受限，一般會伴有有害氣體或是顆粒的炎癥反應(yīng)[14]，就本質(zhì)來講，COPD屬于一種氣道的炎癥。NLRP3炎性小體是由NLRP3、凋亡相關(guān)斑樣蛋白和胱天蛋白酶-1所組成的一個多聚體蛋白復(fù)合物?；罨腘LRP3炎性小體可使無活性的原胱天蛋白酶-1切割成具有活性的胱天蛋白酶-1片段，而后者可將原白細(xì)胞介素-1β和原白細(xì)胞介素-18裂解為成熟白細(xì)胞介素-1β和白細(xì)胞介素-18并分泌到細(xì)胞外發(fā)揮活性效應(yīng)，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)。目前已有研究證實(shí)，線粒體活性氧是NLRP3炎性小體活化的關(guān)鍵上游效應(yīng)因子[15-16]。而NLRP3炎性小體在COPD的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用。引起COPD的眾多病因(包括吸煙、感染、化學(xué)物質(zhì)、職業(yè)粉塵、空氣污染等)都可引起肺組織的氧化應(yīng)激增加，使NLRP3炎性小體過量激活，導(dǎo)致肺部慢性炎癥持續(xù)存在，引發(fā)肺氣腫和小氣道重塑及纖維化，從而導(dǎo)致氣體陷閉和氣流受限，繼而出現(xiàn)呼吸困難等癥狀。而動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，抑制NLRP3炎性小體的上游激活物，或阻斷其下游效應(yīng)分子能夠有效地減緩COPD的發(fā)生發(fā)展[17-20]。綜上所述，通過開發(fā)抑制NLRP3炎性小體及其下游效應(yīng)分子的藥物，可能是緩解COPD進(jìn)程，提高患者生命質(zhì)量和生存率的一種新的藥物研究策略。

COPD在中醫(yī)學(xué)中并無專屬病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)、相關(guān)癥狀體征及病情進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，大部分醫(yī)家將其辨病為“咳嗽”“喘證”“肺脹”等病。COPD臨床表現(xiàn)多是由肺部疾病日久遷延不愈所致，故“肺脹”病名與其契合度最高。目前大多醫(yī)家認(rèn)為肺脹病因病機(jī)在于先有肺虛，之后邪實(shí)閉肺而喘,為本虛標(biāo)實(shí)之病，也提示本病的形成和發(fā)展，不但與正虛相關(guān),而且和外邪的反復(fù)侵襲有關(guān)，由于外邪入里而產(chǎn)生內(nèi)外合邪，形成正虛邪戀,最終導(dǎo)致病情加重。此外在COPD發(fā)展的不同階段，病機(jī)特點(diǎn)有所側(cè)重，早期以肺虛為主，病情進(jìn)一步發(fā)展,久病累及他臟，使患者脾與腎也受到影響，COPD不斷反復(fù)的關(guān)鍵內(nèi)因?yàn)榉纹⒛I虛。COPD病位在肺，但其發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)歸與肺、脾、腎三臟密切相關(guān)。普遍認(rèn)為本虛標(biāo)實(shí)是COPD的基本病機(jī)，本虛多涉及肺脾腎等臟腑，標(biāo)實(shí)多與痰、瘀、六淫外邪等有關(guān)。寬胸理肺湯是方邦江教授以瓜蔞薤白半夏湯合二陳湯、三拗湯化裁而成，寬胸理肺湯可以有效地治療痰濁壅肺型COPD，寬胸理肺湯由瓜蔞薤白半夏湯、二陳湯、三拗湯三方化裁而成，瓜蔞薤白半夏湯可以通陽散結(jié)，行氣解郁，化痰寬胸，此處用其滌痰行水之功，對于痰濕水飲壅滯于肺臟，肺氣失于宣降所導(dǎo)致的咳嗽咳痰，氣促的癥狀有較好的療效，二陳湯燥濕化痰，三拗湯止咳平喘，三方合用，共同起到化痰平喘，行氣解瘀的功效。三子養(yǎng)親湯是醫(yī)治氣滯痰壅的經(jīng)典名方，具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗炎等作用。本課題組前期臨床究結(jié)果表明，寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯治療COPD患者，能有效抑制全身炎癥反應(yīng),降低白細(xì)胞計數(shù)和中性粒細(xì)胞比例，降低血清炎癥介質(zhì)水平，改善肺功能，從而改善COPD急性加重期痰濁壅肺證患者的臨床癥狀體征，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯能夠顯著改善COPD大鼠肺組織線粒體功能，具體體現(xiàn)在提高肺組織線粒體ATP合成量，減少線粒體損傷引起的活性氧釋放等，并且能夠抑制線粒體活性氧下游NLRP3炎性小體的活化。

綜上所述，寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯可能通過抑制線粒體活性氧-NLRP3信號通路抑制COPD的發(fā)生發(fā)展。本研究不僅對COPD的西醫(yī)學(xué)機(jī)制作出創(chuàng)新性研究，并且為中藥驗(yàn)方寬胸理肺湯合三子養(yǎng)親湯的臨床療效提供了現(xiàn)代分子生物學(xué)的基礎(chǔ)，為其臨床推廣提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。