曹 森，董立超，張 鵬，薛友林，賈曉昱，李江闊

（1 貴陽(yáng)學(xué)院食品與制藥工程學(xué)院 貴陽(yáng) 550005 2 遼寧大學(xué)輕型產(chǎn)業(yè)學(xué)院 沈陽(yáng) 110036 3 天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所 天津 300384 4 國(guó)家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津） 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 天津 300384）

藍(lán)莓（Vaccinium sp.）屬于小漿果類，其果實(shí)口感十分細(xì)膩、鮮嫩、多汁，然而，在生長(zhǎng)、采收、裝卸和運(yùn)輸過(guò)程中極易造成機(jī)械損傷，使其受到病菌侵染，進(jìn)而出現(xiàn)采后的各種病害，使藍(lán)莓的貯藏和貨架期縮短，嚴(yán)重影響著藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)的良性發(fā)展[1]。了解不同品種藍(lán)莓采后的微生物病害發(fā)生規(guī)律，并制定出具有針對(duì)性的有效防治措施顯得十分重要。藍(lán)莓采后病害主要是由病原真菌引起，采后病害的出現(xiàn)與不同藍(lán)莓品種自身抗性、貯藏時(shí)的溫度、濕度及果實(shí)采摘時(shí)間關(guān)系密切。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在藍(lán)莓病害發(fā)生規(guī)律及防治方面做了許多研究。1973年，Milholland[2]在美國(guó)東南部北卡羅來(lái)納州的藍(lán)莓中首次發(fā)現(xiàn)的鏈格孢菌（Alternaria sp.）是高叢藍(lán)莓采后病害的主要致病菌，并提出使用藥劑處理對(duì)鏈格孢菌的防效能力較差，抑制鏈格孢菌侵染的最佳方法是控制藍(lán)莓采后貯藏溫度；Smith 等[3]發(fā)現(xiàn)不同品種的兔眼藍(lán)莓在采后病害中存在抗性差異；Mari 等[4]提出拮抗生防菌可促進(jìn)采后藍(lán)莓產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，促進(jìn)藍(lán)莓發(fā)生防御反應(yīng)，從而減少藍(lán)莓采后病害的出現(xiàn)。楊蕾等[5]在采后腐爛藍(lán)莓中分離鑒定出青霉菌（Penicillium digitatum）和枝孢菌（Cladosporium tenuiussimum），試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)BS-3 菌株對(duì)兩種菌的抑菌效果達(dá)90%以上，有潛在的生防利用價(jià)值。

目前國(guó)內(nèi)研究藍(lán)莓采后病害主要集中在藍(lán)莓產(chǎn)地方面，對(duì)品種間的差異方面研究較少。在貴州區(qū)域，2015年周笑犁等[6]報(bào)道，采后的藍(lán)莓主要是由擬盤多毛孢（Pestalotiopsis sp.）、青霉菌（Penicillium sp.）和枝孢霉（Acremonium sp.）等致病菌侵染而發(fā)生病害；同年，郭曉月等[7]發(fā)現(xiàn)中國(guó)云南區(qū)域藍(lán)莓貯藏期的致病菌為枝孢霉（Acremonium sp.）、鏈格孢菌（Alternaria sp.）和匍柄霉屬（Stemphylium sp.）真菌。2016年，在遼南地區(qū)，戴啟東等[8]從藍(lán)莓病害果實(shí)中分離灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）、鏈格孢菌（Alternaria sp.）、青霉菌 （Penicillium sp.） 和粉紅單端孢菌（Trichothecium roseum.）4 種致病菌。

長(zhǎng)期以來(lái)，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)果蔬采后病害方面的研究大多數(shù)為微生物的傳統(tǒng)純培養(yǎng)和鑒定。其分離鑒定出的致病菌僅為樣本中較小的一部分。如今，高通量技術(shù)應(yīng)用于檢測(cè)土壤多樣化[9-11]、海洋食品[11-13]、腸道環(huán)境[14-16]、發(fā)酵食品[17-20]等領(lǐng)域的微生物群落。其中，在食品微生物領(lǐng)域通常采用16S rRNA 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)微生物群落的多樣性。本研究以天津市薊州區(qū)北陸、藍(lán)金、萊克西、奧尼爾藍(lán)莓為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)序不同品種藍(lán)莓表面菌群的ITS1 區(qū)，明確各品種藍(lán)莓的優(yōu)勢(shì)菌群，為藍(lán)莓品種選育、病害研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

北陸、萊克西、奧尼爾、藍(lán)金藍(lán)莓于2020年6月采自天津市薊州區(qū)海闊家庭農(nóng)場(chǎng) （117.64 °N，40.09°E），采摘大小均勻、品質(zhì)良好的果實(shí)裝入小籃內(nèi)，采收6 h 內(nèi)空調(diào)車運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。每個(gè)品種隨機(jī)挑選約80 g 藍(lán)莓果實(shí)，立即液氮速凍，于超低溫（-80 ℃）冰箱保存。每個(gè)品種隨機(jī)取出多顆果實(shí)進(jìn)行測(cè)定，混樣提取DNA 分別建庫(kù)。

臺(tái)式離心機(jī) （Pico-21），賽默飛世爾科技公司；PCR 儀（T100TM Thermal Cyele）、凝膠成像系統(tǒng)（ChemiDocTMMP），美國(guó)伯樂(lè)公司；電泳儀電源（DYY-6C）、電泳槽（DYCZ-21），北京市六一儀器廠；熒光計(jì)（Q32866QubitR3.），美國(guó)英杰生命技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試材處理 對(duì)供試的樣本分別進(jìn)行標(biāo)記，北陸、萊克西、奧尼爾、藍(lán)金藍(lán)莓分別標(biāo)注為A、B、C、D。

1.2.1.1 藍(lán)莓果實(shí)基因組DNA 的提取及PCR 擴(kuò)增 果實(shí)基因組DNA 的提取采用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB），采用Barcode 的特異引物、Phusion?High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 和酶進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。

ITS1 區(qū)引物 （ITS5-1F-F 和ITS1-1F-R）：ITS1-1F-F：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'；ITS1-1F-R：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'。

1.2.1.2 PCR 產(chǎn)物的檢測(cè)和建庫(kù) 使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，藍(lán)莓果實(shí)樣本文庫(kù)采用 TruSeq?DNA PCR -Free Sample Preparation Kit 試劑盒進(jìn)行構(gòu)建，并經(jīng)過(guò)Qubit 和Q-PCR 定量，最后使用NovaSeq6000 上機(jī)測(cè)序。

1.2.2 數(shù)據(jù)篩選 從下機(jī)數(shù)據(jù)中使用PCR 擴(kuò)增引物序列和Barcode 序列拆分出不同品種藍(lán)莓?dāng)?shù)據(jù)，去除引物序列和Barcode 后，使用FLASH[21]逐個(gè)對(duì)不同品種藍(lán)莓的reads 進(jìn)行拼接，獲得原始的Tags 數(shù)據(jù)（Raw Tags），并將其過(guò)濾處理[22]得到每個(gè)不同樣本的高質(zhì)量Tags 數(shù)據(jù)（Clean Tags）。參照Caporaso 等[23]的Tags 質(zhì)量控制流程進(jìn)行處理：將Raw Tags 從連續(xù)低質(zhì)量值（閾值為≤19）堿基數(shù)達(dá)到長(zhǎng)度3 的第1 個(gè)低質(zhì)量堿基位點(diǎn)截?cái)?，隨后過(guò)濾掉連續(xù)高質(zhì)量堿基長(zhǎng)度小于75%長(zhǎng)度的Tags。經(jīng)過(guò)上述處理后的Tags 數(shù)據(jù)通過(guò)[24]與其注釋數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，并去除嵌合體序列[25]，剩余有效數(shù)據(jù)（Effective tags）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 OTU 聚類和物種注釋 Effective Tag 的聚類采用Uparse 軟件[26]，結(jié)果以97%的序列聚類成為OTUs（Operational taxonomic units），使用Qiime軟件中的blast 方法[27]與Unit 數(shù)據(jù)庫(kù)[28]進(jìn)行物種注釋。所有代表序列之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系使用MUSCLE 軟件進(jìn)行序列比對(duì)獲得[29]。

1.3.2 樣本復(fù)雜度分析 （Alpha diversity） 使用Qiime 軟件和R 軟件計(jì)算并繪制曲線，以及Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析。

1.3.3 多樣本比較分析（Beta diversity） 使用R軟件進(jìn)行PCA 分析和Beta 多樣性指數(shù)組間差異分析。Metastats 分析使用R 軟件進(jìn)行組間的置換檢驗(yàn)，從而得到P 值，并且使用White 等[30]報(bào)道方法對(duì)P 值進(jìn)行修正，得到q 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 注釋情況

對(duì)4 個(gè)品種的藍(lán)莓PCR 產(chǎn)物進(jìn)行PCR-free文庫(kù)構(gòu)建，并對(duì)文庫(kù)雙末端進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)過(guò)對(duì)Reads 拼接得到結(jié)果如下：平均每個(gè)藍(lán)莓品種樣品測(cè)得91 177 條原始序列，質(zhì)控后的藍(lán)莓樣品平均得到90 518 條有效數(shù)據(jù)，質(zhì)控有效數(shù)據(jù)量為88 559，質(zhì)控有效率為97.08%。將所得的序列聚類得到295 個(gè)OTUs。并將OTUs 序列與UNITE數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋，結(jié)果顯示，共有103（34.92%） 個(gè)OTU 注釋到屬水平。進(jìn)一步計(jì)算α多樣性與β 多樣性，然后進(jìn)行組間差異比較，從而揭示不同品種藍(lán)莓的群落結(jié)構(gòu)的差異特征。

如圖1所示，得到OTUs 后，通過(guò)繪制稀疏曲線來(lái)判斷當(dāng)前每個(gè)藍(lán)莓樣品的測(cè)序深度是否足以反映該群落樣本所包含的微生物多樣性。在測(cè)序樣品中，4 個(gè)品種藍(lán)莓果實(shí)測(cè)序樣品的稀釋曲線，隨著測(cè)序深度的增加而逐漸趨于平坦，表明測(cè)序數(shù)據(jù)己獲得絕大部分樣品信息，己經(jīng)能夠反映藍(lán)莓的微生物群落組成。從稀釋曲線的OTU 數(shù)量來(lái)看，在相同測(cè)序深度下，比較不同藍(lán)莓樣本中OTU數(shù)的多少，從而衡量每個(gè)樣本的多樣性高低，由圖1可以看出，藍(lán)金的表面微生物多樣性高于其它3種藍(lán)莓的表面微生物多樣性。

圖1 不同藍(lán)莓品種稀疏曲線（a）和等級(jí)分布曲線（b）Fig.1 Rarefaction curve and Rank Abundance curve of different blueberry varieties

藍(lán)莓果實(shí)樣本中物種的均勻度和豐富度可采用等級(jí)分布曲線分析。其中，等級(jí)分布曲線的寬度反映藍(lán)莓表面微生物物種的豐富度，物種的豐富度與曲線在X 軸上的跨度相關(guān)。而在曲線Y 軸方向，曲線平滑程度反映藍(lán)莓樣品中物種均勻程度[31]。綜上可知，奧尼爾品種藍(lán)莓果實(shí)的表面微生物物種分布的均勻程度和豐富度，高于其它3 個(gè)品種微生物的表面微生物均勻程度。

2.2 基于OTU 的花瓣圖分析

如圖2所示，在北陸表面，共有134 個(gè)OTUs，北陸特有39 個(gè)OTUs；藍(lán)金表面，共有144個(gè)OTUs，藍(lán)金特有56 個(gè)OTUs；萊克西表面，共有115 個(gè)OTUs，萊克西特有34 個(gè)OTUs；奧尼爾表面，共有222 個(gè)OTUs，奧尼爾特有70 個(gè)OTUs。奧尼爾樣本序列所得細(xì)菌OTU 數(shù)量最多，藍(lán)金其次，萊克西最少，這說(shuō)明奧尼爾品種含有較豐富的菌群種類，北陸、藍(lán)金、萊克西3 個(gè)品種的藍(lán)莓核心菌群組成較相似。奧尼爾與其它3 個(gè)品種藍(lán)莓菌群差異較大。

圖2 不同藍(lán)莓品種OTU 花瓣圖Fig.2 OTU petals of different blueberry varieties

2.3 物種注釋概況

通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)UNITE 比對(duì)，進(jìn)行物種注釋并分析發(fā)現(xiàn)：藍(lán)莓果實(shí)樣本共檢測(cè)出295 個(gè)OTUs，其中，有208（70.51%）個(gè)OTUs 數(shù)目可注釋到數(shù)據(jù)庫(kù)中。表1表明，注釋到界水平、門水平、綱水平、目水平、科水平、屬水平、種水平的比例分別為70.51%，42.03%，39.66%，38.64%，37.29%，34.92%，23.39%。

表1 物種注釋情況Table 1 Species annotation situation

在屬水平上，圖3顯示每個(gè)品種藍(lán)莓相對(duì)豐度前10 的物種名稱及相對(duì)豐度，優(yōu)勢(shì)物種為平均長(zhǎng)度64.01%的枝孢屬（Cladosporium）、23.3%的鏈格孢屬（Alternaria），不同品種藍(lán)莓中的主要優(yōu)勢(shì)菌群基本相同，而相對(duì)豐度差異較大，即北陸和萊克西中枝孢屬的相對(duì)豐度分別為72.53%和92.2%，而藍(lán)金的枝孢屬相對(duì)豐度只有41.46%；奧尼爾中枝孢屬的相對(duì)豐度為49.84%。說(shuō)明在屬水平下，不同品種藍(lán)莓中真菌群落結(jié)構(gòu)組成相同，存在差異的是各物種的組成比例，由圖3可知，枝孢屬是不同品種藍(lán)莓中的優(yōu)勢(shì)菌群。

圖3 不同藍(lán)莓品種在屬水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖Fig.3 Column chart of relative abundance of different blueberry varieties at the genus level

從圖4可以發(fā)現(xiàn)，不同樣品中優(yōu)勢(shì)菌在種水平上有較大差異。北陸和奧尼爾樣品間細(xì)菌群落組成相似：北陸、藍(lán)金、萊克西、奧尼爾4 種樣品中優(yōu)勢(shì)種為枝孢菌 （46.87%，25.21%，62.68%，38.39%）、鏈格孢（24.39%，25.72%，4.55%，38.52%）以及枝孢霉（24.73%，15.6%，28.89%，9.36%）。上述鏈格孢更多地與采后藍(lán)莓貯藏初期發(fā)生暗白色霉變，老后變暗有關(guān)，其在藍(lán)莓表面的相對(duì)豐度大小也反映其耐貯性[32]。鏈格孢在萊克西中的相對(duì)豐度顯著低于其它3 個(gè)樣本 （P<0.05），北陸和藍(lán)金不顯著，奧尼爾顯著高于其它3 個(gè)品種（P<0.05）。枝孢霉、枝孢菌在各品種間均差異顯著（P<0.05）。因此在藍(lán)莓貯藏中，對(duì)于該鏈格孢菌的認(rèn)識(shí)值得深入研究。

圖4 不同藍(lán)莓品種在種水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖Fig.4 Column chart of relative abundance of different blueberry varieties at species level

2.4 多樣品比較分析（Beta diversity）

根據(jù)OTU 的豐度數(shù)據(jù)，通過(guò)繪制屬水平上的數(shù)據(jù)熱圖，可以將不同的OTU 分塊聚類，根據(jù)熱圖中不同顏色的梯度，反映出不同藍(lán)莓樣品表面的微生物群落相似性、差異性及物種聚類關(guān)系。圖5可以直觀地顯示不同品種樣品中微生物的差異。圖5a 為OTU 聚類樹(shù)，左側(cè)為不同品種藍(lán)莓樣品聚類樹(shù)，不同地區(qū)的4 種藍(lán)莓可分為3 個(gè)聚類：北陸和萊克西聚為一類，藍(lán)金聚為一類，奧尼爾聚為一類，說(shuō)明不同樣品間微生物群落存在一定的差異性，北陸和萊克西群落結(jié)構(gòu)相似度較高，而其它樣品兩兩之間微生物群落差異較大。

主成分分析 （Principal component analysis，PCA）結(jié)果（圖5b）表明，樣品北陸、萊克西距離較近，而北陸、藍(lán)金、奧尼爾，藍(lán)金、萊克西、奧尼爾這兩組距離較遠(yuǎn)，可以推斷出北陸和萊克西群落結(jié)構(gòu)相似度較高，而其它樣品兩兩之間微生物群落差異較大。

圖5 不同藍(lán)莓品種的多樣品比較分析Fig.5 Comparative analysis of multiple samples of different blueberry varieties

2.5 樣品復(fù)雜度分析（Alpha diversity）

由表2可以看出所有結(jié)果Coverage 指數(shù)均為1，說(shuō)明藍(lán)莓樣品文庫(kù)種序列基本都被測(cè)出，未被測(cè)到的概率極低，測(cè)序結(jié)果可以反映被測(cè)藍(lán)莓樣品的真實(shí)情況。其中，Shannon 指數(shù)可反映藍(lán)莓果實(shí)群落多樣性和物種的分布情況。Simpson 指數(shù)表征群落內(nèi)物種分布的多樣性和均勻度，其指數(shù)越大代表不同品種的藍(lán)莓果實(shí)微生物群落多樣性越低。Chao1 表征藍(lán)莓果實(shí)物種總數(shù)，ACE 指數(shù)可反映不同品種藍(lán)莓果實(shí)微生物群落中OTU 數(shù)目。由表2可知，根據(jù)Simpson 指數(shù)顯示微生物群落豐度及群落多樣性由高至低為萊克西、北陸、奧尼爾、藍(lán)金。根據(jù)Shannon 指數(shù)，分類總數(shù)由高至低為藍(lán)金、奧尼爾、北陸、萊克西。

表2 不同品種藍(lán)莓α 多樣性Table 2 α-Diversity of different blueberry varieties

在屬水平上，通過(guò)α 組間差異分析可初步判斷不同品種的藍(lán)莓果實(shí)之間的微生物群落的相似性。根據(jù)樣本所屬的類別進(jìn)行分析和討論。如圖6所示，通過(guò)Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)測(cè)得的物種數(shù)在藍(lán)金-萊克西、北陸-萊克西、萊克西-奧尼爾兩組間有顯著差異（P<0.05），其顯著性P 值為0.0029，0.0224，0.0387。測(cè)得的物種數(shù)在藍(lán)金-奧尼爾、北陸-藍(lán)金、北陸-奧尼爾兩組間不具有明顯的差異（P>0.05），P 值為0.1157，0.1958，0.7333。Shannon指數(shù)在藍(lán)金-萊克西、北陸-藍(lán)金、萊克西-奧尼爾等兩組間具有明顯的差異（P<0.05），顯著性P 值為0.0000，0.0001，0.0001。

圖6 不同藍(lán)莓品種樣品的復(fù)雜度分析Fig.6 Analysis of the complexity of different blueberry varieties

3 結(jié)論

對(duì)不同品種藍(lán)莓進(jìn)行多樣品比較分析發(fā)現(xiàn)，北陸和萊克西群落結(jié)構(gòu)相似度較高，且其微生物群落豐度高，群落多樣性豐富。通過(guò)對(duì)比不同樣本的物種相對(duì)豐度柱形圖可以發(fā)現(xiàn)，在屬水平上的優(yōu)勢(shì)物種為枝孢屬 （Cladosporium）、鏈格孢屬（Alternaria）；在種水平上的優(yōu)勢(shì)物種為枝孢菌（Cladosporium_chasmanthicola）、鏈格孢（Alternaria_alternata）、枝孢霉（Cladosporium_cladosporioides）。品種差異對(duì)藍(lán)莓表面微生物多樣性及其群落結(jié)構(gòu)組成具有一定影響，品種差異主要影響枝孢菌、鏈格孢、枝孢霉等真菌的相對(duì)豐度。