楊淑娟，苗壯壯，史嘉琪，孫悅欣，郭 帥，白 梅，王記成，張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

益生菌是指足量攝入時(shí)對(duì)宿主健康有益的活的微生物[1]。人和動(dòng)物體內(nèi)有很多益生菌，其中雙歧桿菌作為腸道菌群中最有代表性的一類益生菌[2]。早在1899年，法國(guó)醫(yī)生Henry Tissier 第1 次在健康嬰兒的糞便中分離到雙歧桿菌[3]。許多的動(dòng)物和臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示：雙歧桿菌可以調(diào)節(jié)腸道菌群微生態(tài)的平衡，增強(qiáng)宿主免疫的能力，并促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝及吸收，改善胃腸道功能健康[4]。雙歧桿菌被添加到發(fā)酵乳制品中約有20年的歷史[5]，益生菌傳遞至人體內(nèi)最理想的載體為發(fā)酵乳。

分離于內(nèi)蒙古呼和浩特市健康婦女母乳，具有優(yōu)良益生特性的乳雙歧桿菌Probio-M8（Bifidobacterium lactis Probio-M8，Probio-M8）為本試驗(yàn)用益生菌。Liu 等[6]研究發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌Probio-M8 在進(jìn)入模擬人工胃腸液中11 h 后，存活率高達(dá)97.25%，說(shuō)明其具備良好的胃腸道消化液耐受性，能以活的狀態(tài)進(jìn)入人體腸道，從而發(fā)揮益生效用。翟云等[7]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)免疫抑制模型大鼠灌服乳雙歧桿菌Probio-M8 后，提高了大鼠免疫應(yīng)答調(diào)控能力，說(shuō)明該菌株可促進(jìn)免疫抑制大鼠的免疫調(diào)節(jié)。母乳源益生菌乳雙歧桿菌Probio-M8 是一株具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的優(yōu)良菌株，新菌株的開(kāi)發(fā)有助于我國(guó)益生菌發(fā)酵乳產(chǎn)品種類和功能的多樣化。

在食品風(fēng)味研究中最廣泛使用的技術(shù)為氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 （Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[8]。固相微萃?。⊿olid phase microextraction，SPME）技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)多，如高靈敏度，低檢出限等，同時(shí)與氣相色譜-質(zhì)譜可直接聯(lián)用[9]。該技術(shù)能快速精確地剖析發(fā)酵乳中的痕量物質(zhì)，且能同時(shí)檢測(cè)樣品中多種不同含量的揮發(fā)性成分[10]。Dan 等[11]使用SPME-GC-MS 聯(lián)用技術(shù)，檢測(cè)不同比例嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌發(fā)酵乳中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，共測(cè)出89 種風(fēng)味物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌接菌量之比為1 000∶1 時(shí)，醛、酮類物質(zhì)含量最高。

益生菌產(chǎn)品品質(zhì)及其健康功效是影響大眾喜好的第1 要素，其中風(fēng)味的作用尤其重要。本研究采用SPME-GC-MS 技術(shù)分析添加益生菌乳雙歧桿菌Probio-M8 對(duì)發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，同時(shí)評(píng)價(jià)發(fā)酵乳樣品的發(fā)酵特性及貯藏穩(wěn)定性，進(jìn)而對(duì)乳雙歧桿菌Probio-M8 在發(fā)酵乳中的應(yīng)用進(jìn)行綜合評(píng)估，為其應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持，這有利于益生菌發(fā)酵乳產(chǎn)品多元化開(kāi)發(fā)[12]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉，新西蘭恒天然公司；白砂糖，廣西鳳糖生化股份有限公司；MRS 培養(yǎng)基，英國(guó)Oxoid公司；L-半胱氨酸鹽酸鹽，北京酷來(lái)搏科技有限公司；萬(wàn)古霉素，北京陸橋技術(shù)有限公司；C10-C25、C3-C9 正構(gòu)烷烴混標(biāo)，USA -AccuStandard；1，2-二氯苯（色譜純），Sigma-Aldrich；高純氦（純度＞99.999%）；乳雙歧桿菌Probio-M8（Bifidobacterium lactis Probio-M8，Probio-M8），金華銀河生物科技有限公司；乳雙歧桿菌BB12（Bifidobacterium lactis BB12，BB12）、酸奶發(fā)酵劑YF-904，丹麥科漢森（中國(guó)）有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

FE28 型pH 計(jì)，上海梅特勒有限公司；雷磁連續(xù)pH 計(jì) （pHSJ-3F），上海精密科學(xué)儀器有限公司；Brookfield DV-2T 型黏度計(jì)，美國(guó)Brookfield公司；恒溫水浴鍋、DHP-9272 型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；SRH60-70 型高壓均質(zhì)機(jī)，上海申鹿均質(zhì)機(jī)有限公司；7890B GC-5977A MSD 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent 公司；手動(dòng)固相微萃取進(jìn)樣手柄、50/30 μm 萃取頭，美國(guó)Supelco 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵乳的制備 在50 ℃的蒸餾水中加入全脂乳粉 （11.5%），加熱至60 ℃時(shí)加入蔗糖（6.5%），攪拌15 min 后，在50 ℃水浴鍋中靜置水合30 min，水合后再次加熱到65 ℃，20 MPa 均質(zhì)，之后在95 ℃殺菌5 min，殺菌后立即在冰水浴中降溫，冷卻到42 ℃接種發(fā)酵。恒溫發(fā)酵（42 ℃），pH 值為4.50 時(shí)為發(fā)酵終點(diǎn)，水浴冷卻后破乳無(wú)菌分裝，于4 ℃貯藏28 d。

試驗(yàn)分組及接種情況如表1所示。

表1 試驗(yàn)分組明細(xì)Table 1 Experiment grouping details

1.3.2 pH 值的測(cè)定 在發(fā)酵過(guò)程中對(duì)發(fā)酵乳樣品的pH 值變化跟蹤測(cè)定，每5 min 測(cè)定1 次。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定[13-14]利用SPMEGC-MS 技術(shù)測(cè)定發(fā)酵乳樣品在發(fā)酵完成時(shí)的揮發(fā)性代謝物質(zhì)情況。

樣品前處理：萃取頭在進(jìn)樣口250 ℃老化5 min 后，垂直插入樣品瓶，萃取發(fā)酵乳的風(fēng)味化合物。萃取條件為溫度50 ℃，時(shí)間50 min，磁力攪拌器的轉(zhuǎn)速300 r/min。最后插入到氣相色譜儀進(jìn)樣口中，于250 ℃解吸3 min。

氣相色譜（GC）條件：開(kāi)始溫度35 ℃保持5 min；然后以5 ℃/min 上升至140 ℃并保持2 min；以10 ℃/min 升溫到250 ℃。試驗(yàn)采用載氣為高純氦氣（He），載氣流速1.0 mL/min。進(jìn)樣模式為不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜（MS）條件：電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；電離方式EI；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～500；發(fā)射電流100 μA，檢測(cè)電壓1.4 kV。

定性與定量分析[15]：運(yùn)用隨機(jī)攜帶的Masshunter 工作站NIST11 標(biāo)準(zhǔn)庫(kù)自動(dòng)檢索各組分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算保留指數(shù)（Retention index，RI），將保留指數(shù)（RI）值代入公式（1）。

式中，RT——保留時(shí)間（min）。正構(gòu)烷烴碳原子數(shù)的保留時(shí)間依據(jù)RT（Z+1）>RT（X）>RT（Z）順序。1，2-二氯苯溶液作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)加入發(fā)酵樣品中。各組分的相對(duì)峰面積比利用峰面積歸一化法計(jì)算。風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量濃度代入公式（2）。

式中，As——內(nèi)標(biāo)色譜峰面積；Ai——樣品中待測(cè)的物質(zhì)對(duì)應(yīng)色譜峰面積；Cs——1，2-二氯苯的質(zhì)量濃度（μg/L）；Ci——樣品中各揮發(fā)性風(fēng)味化合物的質(zhì)量濃度（μg/L）。

1.3.4 貯藏穩(wěn)定性評(píng)價(jià)

1.3.4.1 酸度的測(cè)定 pH 值采用FE28 型pH 計(jì)直接測(cè)定；滴定酸度的測(cè)定使用GB 5009.239-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測(cè)定》中的“酚酞指示劑法”，每個(gè)樣品測(cè)定3 組平行。

1.3.4.2 黏度的測(cè)定 將發(fā)酵乳置于室溫（25 ℃）一段時(shí)間后，采用Brookfield DV-2T 黏度儀測(cè)定發(fā)酵乳的黏度，4 號(hào)轉(zhuǎn)子浸沒(méi)于樣品中測(cè)定，扭矩為64%，時(shí)間為30 s，轉(zhuǎn)速為100 r/min，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次[16]。

1.3.4.3 持水性的測(cè)定 將發(fā)酵乳樣品稱取20 g后，倒入裝有濾紙的玻璃漏斗中，室溫放置120 min 后稱量濾液的質(zhì)量。持水性的計(jì)算公式見(jiàn)式（3）[17]：

1.3.4.4 活菌數(shù)的測(cè)定 發(fā)酵乳樣品用滅菌后的生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，選擇不同梯度，利用傾注平板法在ML 瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行計(jì)數(shù)，培養(yǎng)條件為（36±1）℃厭氧培養(yǎng)（72±2）h。

1.4 感官評(píng)定

根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302-2010 《發(fā)酵乳》，評(píng)價(jià)小組由7 名研究食品相關(guān)專業(yè)的學(xué)生組成，從口感、色澤和滋味、組織狀態(tài)3 個(gè)方面評(píng)定發(fā)酵乳的感官質(zhì)量。

感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The sense evaluation standard

1.5 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)樣品每組均至少測(cè)定3 次平行，以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用SPSS 分析各樣本間的差異，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPME-GC-MS 檢測(cè)結(jié)果

不同發(fā)酵乳中揮發(fā)性代謝物質(zhì)測(cè)定結(jié)果如表3所示，將萃取頭帶入的一些少許硅氧烷類雜質(zhì)峰去掉，本試驗(yàn)中發(fā)酵乳樣品在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)共檢測(cè)出66 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，包括酯類、酮類、醛類、酸類、醇類、烷烴類和其它化合物七大類。其中，發(fā)酵乳樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)種類最多的是酮類化合物，這些揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)大部分是乳酸菌發(fā)酵牛乳中原料的代謝產(chǎn)物，還有一部分是來(lái)自于原料。由此可見(jiàn)，雖然發(fā)酵乳中的基礎(chǔ)發(fā)酵劑相同，但添加的益生菌不同，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量和組成也不相同。

發(fā)酵乳中揮發(fā)性代謝物質(zhì)測(cè)定結(jié)果如表3所示。

2.1.1 酸類化合物 酸奶中的重要顯味物質(zhì)是酸類化合物，主要通過(guò)脂肪分解和微生物發(fā)酵產(chǎn)生[18]，對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的形成有著重要影響。由表3可知，3 組發(fā)酵乳在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)共檢測(cè)到10 種酸類化合物，Probio-M8 組、BB-12 組和對(duì)照組分別鑒定到了6 種、7 種、6 種酸類物質(zhì)。該類物質(zhì)的組成略有差異，但Probio-M8 組和BB-12 組的揮發(fā)性酸類化合物的構(gòu)成差異不明顯，其中，在3 組發(fā)酵乳中鑒定到的共有酸類物質(zhì)分別為己酸、乙酸、癸酸和正辛酸等。

表3 不同發(fā)酵乳中揮發(fā)性代謝物質(zhì)測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of volatile metabolites in different fermented milk

（續(xù)表3）

添加Probio-M8 的發(fā)酵乳與對(duì)照組相比，部分酸類化合物的含量增加，如己酸、乙酸、癸酸和正辛酸，說(shuō)明添加益生菌使酸類物質(zhì)含量發(fā)生變化。己酸在Probio-M8 組的相對(duì)含量是2.19，在另外2 組發(fā)酵乳中的相對(duì)含量分別是2.39，1.84，發(fā)酵乳中重要的酸類化合物也包括己酸，它有著香甜的干酪香氣[19]；有清新水果和焦糖香味的是正辛酸[15]，在3 組發(fā)酵乳中的相對(duì)含量分別是1.11，1.84，1.07；在Probio-M8 組、BB12 組和對(duì)照組中乙酸的相對(duì)含量分別為3.09，3.21，2.85，添加益生菌后會(huì)使乙酸的相對(duì)含量增加。若乙酸為高濃度則對(duì)發(fā)酵乳的品質(zhì)及口感有影響，因?yàn)樵撐镔|(zhì)有刺激性的尖酸味[15]；Chammas 等[20]在“Labin”發(fā)酵乳中也檢測(cè)到了己酸、丁酸和乙酸等化合物，這個(gè)結(jié)果與本研究結(jié)果相似。除上述幾種酸類化合物外，還檢測(cè)出乙醇酸、丁酸、月桂酸等，這些物質(zhì)共同為發(fā)酵乳的風(fēng)味組成做出貢獻(xiàn)[21]。

2.1.2 醛類化合物 醛類物質(zhì)是發(fā)酵乳風(fēng)味物質(zhì)中的微量香氣成分，閾值低，對(duì)發(fā)酵乳風(fēng)味的構(gòu)成有重要影響[8]。Probio-M8 組、BB-12 組和對(duì)照組發(fā)酵乳中共檢測(cè)到乙醛、苯甲醛等10 種醛類化合物。由表3可知，Probio-M8 組發(fā)酵乳中檢測(cè)到乙醛的相對(duì)含量是1.81，而B(niǎo)B-12 組發(fā)酵乳中未檢出，說(shuō)明乳雙歧桿菌Probio-M8 的添加會(huì)促進(jìn)乙醛產(chǎn)生。以乙醛為主的醛香型發(fā)酵乳是我國(guó)生產(chǎn)的主要發(fā)酵乳，因?yàn)橐胰?duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味構(gòu)成貢獻(xiàn)極大[21]。Probio-M8 組和BB-12 組的發(fā)酵乳均檢測(cè)到了苯甲醛，相對(duì)含量分別是0.10 和0.31，而對(duì)照組中未檢出。高濃度的苯甲醛具有水果香氣，同時(shí)低濃度的苯甲醛可給予酸奶杏仁的香味[15]。僅在BB-12 組檢測(cè)到了庚醛，可使酸奶具有脂肪香味[22]，除以上醛類化合物外，在Probio-M8 組和BB-12 組鑒定到的醛類物質(zhì)還包括3-甲基丁醛，該物質(zhì)具有麥芽香味[23]。正壬醛閾值較低，賦予發(fā)酵乳柑橘香與脂肪香[13]。僅在對(duì)照組發(fā)酵乳中發(fā)現(xiàn)了化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定的3-羥基丁醛，該醛類易被還原成醇類和酸類物質(zhì)[24]，相對(duì)含量為1.06。

2.1.3 酮類化合物 酮類化合物是不飽和脂肪酸經(jīng)氧化、熱降解等化學(xué)反應(yīng)后生成的物質(zhì)[15]，一般呈奶油味或果香味。由表3可知，3 組發(fā)酵乳中共鑒定到了14 種酮類化合物，是種類最多的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。其中乙偶姻和雙乙酰是具有代表性的酮類物質(zhì)。雙乙?？墒拱l(fā)酵乳具有奶油風(fēng)味，是發(fā)酵乳風(fēng)味形成的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)[25]。除對(duì)照組外，Probio-M8 組和BB12 組發(fā)酵乳中都檢出了雙乙酰，相對(duì)含量分別為2.47，3.68，再次說(shuō)明了益生菌的添加可豐富發(fā)酵乳的風(fēng)味。3 組發(fā)酵乳中都檢出了乙偶姻，可賦予發(fā)酵乳濃郁的奶油香味，由表可知，Probio-M8 組、BB-12 組、對(duì)照組中乙偶姻相對(duì)含量分別為0.73，0.47，0.34，添加乳雙歧桿菌Probio-M8 的乙偶姻含量最高。發(fā)酵乳風(fēng)味中的重要風(fēng)味物質(zhì)還有2-壬酮、2-庚酮，由表可知，3 組發(fā)酵乳中都檢測(cè)到了這兩種酮類，可使發(fā)酵乳風(fēng)味更豐富[26]。

2.1.4 醇類化合物 醇類化合物的生成與亞油酸、亞麻酸降解，以及乳糖和氨基酸代謝相關(guān)[27]。在幾組發(fā)酵乳中共發(fā)現(xiàn)了9 種醇類物質(zhì)。Probio-M8 組、BB-12 組、對(duì)照組的醇類物質(zhì)分別有6，5，3 種，其中在益生菌組共有的醇類物質(zhì)有1-庚醇、1-己醇、（S）-（+）-2-氨基-1-丙醇、1-戊醇。醇類化合物一般都有較高的感覺(jué)閾值，在牛乳發(fā)酵過(guò)程中，醇類化合物的濃度、峰面積都較低[28]，因此一般來(lái)說(shuō)它們對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味貢獻(xiàn)很小，而醇類物質(zhì)最終會(huì)反應(yīng)成酸類物質(zhì)，因此也是必不可少的。

2.1.5 酯類化合物 酯類化合物是由發(fā)酵或脂質(zhì)代謝生成的羧酸類、醇類酯化后的產(chǎn)物[29]。本試驗(yàn)發(fā)酵乳中共鑒定到了5 種酯類物質(zhì)，在益生菌組共有的酯類物質(zhì)為苯甲酸N-琥珀酰亞胺酯和丁位十二內(nèi)酯。其中，Probio-M8 組的發(fā)酵乳中檢測(cè)到的甲酸乙烯酯的相對(duì)含量最高為2.56。發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)酯類化合物的含量低，這可能是由于酯類化合物通過(guò)微生物代謝及脂肪酸水解生成，因此在發(fā)酵終點(diǎn)時(shí)微生物的代謝相對(duì)緩慢，從而導(dǎo)致酯類化合物含量低[30]。

2.1.6 烴類化合物 烴類化合物主要來(lái)源于烷基自由基的脂肪酸自氧化過(guò)程，擁有較高閾值的烴類化合物一般對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味貢獻(xiàn)很小[28]，而一定濃度的烴類化合物可能會(huì)使發(fā)酵乳有更飽滿的口感。發(fā)酵乳樣品中共檢測(cè)到7 種烴類化合物，分別為正壬炔、2，3-環(huán)氧丁烷、十二烷、2-乙?；h(huán)氧乙烷、十六烷、反-2，3-環(huán)氧丁烷、十四烷，其中十四烷為益生菌組所共有。

2.1.7 其它化合物 其它化合物中主要包括含氮化合物，一些多肽物質(zhì)能夠使乳酸菌更好的生長(zhǎng)，從而促進(jìn)風(fēng)味化合物形成，因此發(fā)酵乳的風(fēng)味形成和氨基酸的分解代謝有著密切聯(lián)系[8]。由表3可知共鑒定到的含氮化合物有6 種，3 組共有的含氮物質(zhì)有丁基羥基甲苯、甲氧基苯基丙酮肟，益生菌組共有的含氮物質(zhì)是肼甲酰胺。僅在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)了2-脫氧-D 半乳糖，在BB-12 組發(fā)現(xiàn)了對(duì)二甲苯。

2.2 熱聚類分析

發(fā)酵乳樣品的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的熱聚類分析結(jié)果見(jiàn)圖1，Probio-M8 組、BB-12 組和對(duì)照組的差異明顯，對(duì)照組的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量相對(duì)較低，單獨(dú)聚為一類，而添加益生菌的Probio-M8 組和BB-12 組揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量明顯較高，且共有物質(zhì)多，存在個(gè)別物質(zhì)含量相似，因此聚為一類，而個(gè)別成分如庚醛、月桂酸和乙醛等也存在差別。在含有乳雙歧桿菌Probio-M8 的發(fā)酵乳中，己酸、雙乙酰、乙偶姻、2-戊酮、癸酸等重要的特征風(fēng)味物質(zhì)的相對(duì)含量高于對(duì)照組。由此可見(jiàn)，益生菌的添加與否對(duì)發(fā)酵乳的揮發(fā)性代謝物質(zhì)的種類和含量產(chǎn)生不同影響。結(jié)果說(shuō)明添加了乳雙歧桿菌Probio-M8 的發(fā)酵乳，豐富了其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，這些特征風(fēng)味物質(zhì)有助于發(fā)酵乳產(chǎn)生更醇香的風(fēng)味。

圖1 揮發(fā)性代謝物質(zhì)的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of volatile metabolites

2.3 發(fā)酵特性評(píng)價(jià)

發(fā)酵乳酸度的變化可反映益生菌在牛乳中的生長(zhǎng)狀態(tài)和活力，適合的酸度變化對(duì)成品的接受度有積極影響。發(fā)酵過(guò)程中pH 值的變化如圖2所示，發(fā)酵乳到達(dá)發(fā)酵終點(diǎn)的時(shí)間由快到慢分別是BB12 組（6.65 h）、Probio-M8 組（6.8 h）、對(duì)照組（7.1 h）。從發(fā)酵時(shí)間可知，添加益生菌株的發(fā)酵乳明顯縮短了發(fā)酵時(shí)間，Probio-M8 組與BB12組的發(fā)酵時(shí)間接近，表明乳雙歧桿菌Probio-M8具備良好的發(fā)酵性能。發(fā)酵過(guò)程中各組pH 值均顯著降低（P＜0.05）。0～2 h 為菌株延滯生長(zhǎng)期，pH值的變化小，2 h 到凝乳點(diǎn)，pH 值迅速降低，從6 h 起直至發(fā)酵終點(diǎn)pH 值緩慢降低直到發(fā)酵停止。總體看來(lái)，乳雙歧桿菌Probio-M8 的添加加快了產(chǎn)酸速率，縮短了發(fā)酵時(shí)間[12]，非常適宜在發(fā)酵牛乳中使用。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中pH 值的變化Fig.2 Changes of pH value during fermentation

2.4 貯藏穩(wěn)定性

2.4.1 貯藏期間酸度、黏度、持水性的變化 產(chǎn)酸是酸奶發(fā)酵劑的主要功能，pH 值和滴定酸度影響益生菌在發(fā)酵及貯藏過(guò)程中的生存能力和發(fā)酵乳的品質(zhì)[30]。黏度和持水性與發(fā)酵乳的組織狀態(tài)有關(guān)，黏度高，持水能力強(qiáng)，則發(fā)酵乳的組織狀態(tài)好，可以防止乳清析出。發(fā)酵乳的貯藏特性如表4所示，在貯藏期間，3 組發(fā)酵乳樣品的持水性、pH值、TA 值的組間差異不顯著。貯藏28 d 時(shí)，pH 值在4.26 左右，滴定酸度均大于92°T。Probio-M8組的黏度顯著高于對(duì)照組和BB12 組（P<0.05），在1～14 d 黏度持續(xù)上升，可能是因?yàn)槿殡p歧桿菌Probio-M8 保持較高的活菌數(shù)，代謝產(chǎn)酸，從而導(dǎo)致酪蛋白凝固使發(fā)酵乳樣品的黏度增大。在發(fā)酵乳中添加乳雙歧桿菌Probio-M8，對(duì)發(fā)酵乳的酸度和持水性影響不顯著，而黏度高于其余兩組發(fā)酵乳樣品。該產(chǎn)品表現(xiàn)出較好的貯藏穩(wěn)定性，說(shuō)明益生菌Probio-M8 的添加提高了發(fā)酵乳產(chǎn)品品質(zhì)。

表4 發(fā)酵乳的貯藏特性Table 4 Storage characteristics of fermented milk

2.4.2 貯藏期間活菌數(shù)的變化 歐盟規(guī)定在貨架期內(nèi)益生菌產(chǎn)品中益生菌的活菌數(shù)必須維持在106CFU/mL 以上[31]。將發(fā)酵乳樣品在4 ℃貯藏1，7，14，21，28 d 的活菌數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析發(fā)酵乳樣品在貯藏期間活菌數(shù)的變化，從而衡量其貯藏穩(wěn)定性。貯藏期間發(fā)酵乳的活菌數(shù)變化如圖3所示，貯藏期間活菌數(shù)均呈下降趨勢(shì)（P<0.05）。因?yàn)殡p歧桿菌為嚴(yán)格厭氧菌，所以貯藏過(guò)程中活菌數(shù)在一定范圍內(nèi)下降為正?，F(xiàn)象。貯藏時(shí)期乳雙歧桿菌Probio-M8 的活菌數(shù)顯著高于乳雙歧桿菌BB12，在貯藏1～14 d 時(shí)，活菌數(shù)基本保持不變，14 d 后呈下降趨勢(shì)（P<0.05），乳雙歧桿菌Probio-M8在貯藏28 d 時(shí)活菌數(shù)是 （4.35±0.01）×107CFU/mL，達(dá)到了益生菌產(chǎn)品活菌數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果表明將乳雙歧桿菌Probio-M8 應(yīng)用于發(fā)酵乳中能夠保持益生菌的活力，說(shuō)明該產(chǎn)品具備一定的穩(wěn)定性，可充分保證益生菌益生功效的發(fā)揮。

圖3 貯藏過(guò)程中發(fā)酵乳活菌數(shù)的變化Fig.3 Viable count changes of fermented milk during storage

2.5 感官評(píng)定

發(fā)酵乳感官評(píng)定結(jié)果見(jiàn)表5，感官評(píng)價(jià)小組成員對(duì)Probio-M8 組和BB-12 組的感官評(píng)分較高，且評(píng)分較為接近，這兩組發(fā)酵乳的組織狀態(tài)均勻，酸奶醇香，口感順滑細(xì)膩，受到小組成員好評(píng)。對(duì)照組在評(píng)價(jià)指標(biāo)和總分上明顯低于2 個(gè)益生菌株組，差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明在發(fā)酵過(guò)程中添加益生菌乳雙歧桿菌Probio-M8 能夠豐富發(fā)酵乳的風(fēng)味，使發(fā)酵乳具有更佳的口感。

表5 發(fā)酵乳感官評(píng)定結(jié)果Table 5 Sensory evaluation results of fermented milk

3 結(jié)論

采用SPME-GC-MS 方法檢測(cè)乳雙歧桿菌Probio-M8 對(duì)發(fā)酵乳揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響，并對(duì)發(fā)酵乳的發(fā)酵、貯藏及感官特性進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明：本研究發(fā)酵乳中檢測(cè)到的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)均由酮類、酸類、醛類、酯類、醇類、氮類及烷烴類化合物組成，共計(jì)66 種。添加乳雙歧桿菌Probio-M8發(fā)酵乳中的雙乙酰、乙偶姻、癸酸、己酸和2-戊酮等特征風(fēng)味物質(zhì)相對(duì)含量較高，對(duì)發(fā)酵乳的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大，賦予發(fā)酵乳良好的風(fēng)味；聚類分析結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，Probio-M8 和BB-12 益生菌發(fā)酵乳中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及相對(duì)含量更為相近，因此聚為一類，而乙醛、月桂酸和庚醛等成分存在差別。2 種益生菌發(fā)酵乳感官評(píng)分結(jié)果無(wú)差異，均顯著高于普通發(fā)酵乳（P<0.05），說(shuō)明乳雙歧桿菌Probio-M8 發(fā)酵乳風(fēng)味整體較佳。另外，將乳雙歧桿菌Probio-M8 應(yīng)用到發(fā)酵乳中，縮短了發(fā)酵乳的發(fā)酵時(shí)間，使發(fā)酵乳的黏度顯著增加（P<0.05），而發(fā)酵乳貯藏期的持水性、滴定酸度和pH值無(wú)顯著影響（P>0.05）。4 ℃貯藏28 d 后乳雙歧桿菌Probio-M8 的活菌數(shù)為（4.35±0.01）×107CFU/mL，說(shuō)明具備良好的穩(wěn)定性并最大程度保證了其益生功效的發(fā)揮。綜上所述，乳雙歧桿菌Probio-M8 賦予發(fā)酵乳益生特性的同時(shí)兼具較好的特征風(fēng)味，將其應(yīng)用于益生菌發(fā)酵乳中具備一定的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。