梁慧珍，譚政委，余永亮，楊紅旗，許蘭杰，楊 青，李春明，董 薇，李 磊，魯?shù)さ?，安素?/p>

（1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院芝麻研究中心 鄭州 450002 2 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院西峽分院 河南西峽 474550）

金銀花（Lonicera japonica Thunb.）為忍冬科忍冬屬植物[1]，是我國傳統(tǒng)的大宗藥材，也是我國重點(diǎn)管理的名貴中藥材，同時又是食品物質(zhì)，被國家衛(wèi)健委列入“藥食同源目錄（2018）”[2]。其主要成分有揮發(fā)油類、有機(jī)酸類和黃酮類等，具有廣譜抗菌，疏散風(fēng)熱，清熱解毒，保肝利膽等功效[3-4]。綠原酸（Chlorogenic acid）是金銀花最有效的成分，具有抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等顯著功效[5-6]。河南省和山東省是金銀花主產(chǎn)區(qū)，河南密銀花、封丘金銀花、山東金銀花均為我國道地金銀花產(chǎn)品，在國內(nèi)外享有盛譽(yù)，其藥用和營養(yǎng)健價值越來越受到國家和地方政府、科研機(jī)構(gòu)的重視，對金銀花品質(zhì)的要求也越來越高，然而，不同產(chǎn)地的金銀花品質(zhì)存在差異[7]。近年來，國家大力推進(jìn)鄉(xiāng)村振興和精準(zhǔn)扶貧政策，金銀花產(chǎn)業(yè)逐漸興起，市場價格出現(xiàn)波動，同時，金銀花花期采摘機(jī)械化程度不高，勞動力需求量較大，必然導(dǎo)致金銀花市場風(fēng)險，需要細(xì)分市場需求，為實(shí)現(xiàn)供給側(cè)改革需要，篩選營養(yǎng)品質(zhì)最優(yōu)的金銀花材料，定向培育優(yōu)質(zhì)金銀花新品種，以滿足不同的市場需求。建立金銀花營養(yǎng)品質(zhì)評價體系具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。目前，對植物營養(yǎng)品質(zhì)的評價體系，主要集中在香菇[8]、生姜[9]、番茄[10]、蘋果[11]、桑[12]和桃子[13]、菜籽粕[14]、赤松[15]、新疆干果[16]等，對金銀花營養(yǎng)品質(zhì)評價體系的報道較少。本研究以138 份不同產(chǎn)地的金銀花資源為試驗材料，采用高效液相色譜法（Highperformance liquid chromatography，HPLC） 和紫外分光光度法（Ultraviolet spectrophotometry）測定金銀花7 種營養(yǎng)物質(zhì)——綠原酸 （Chlorogenic acid，C）、蘆?。≧utin，R）、木犀草苷（Luteoloside，LS）、異綠原酸A（Isochlorogenic acid A，IA）、異綠原酸C（Isochlorogenic acid C，IC）、木犀草素（Luteolin，LI） 和總黃酮（Flavonoids，F(xiàn)） 的含量。采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行主成分分析 （Principal component analysis，PCA） 和相關(guān)分析，通過熵權(quán)法（The entropy weight method，EWM）、灰色關(guān)聯(lián)度分析（Grey relation analysis，GRA）和主成分分析建立金銀花營養(yǎng)品質(zhì)綜合評價函數(shù)，通過概率分布建立金銀花營養(yǎng)品質(zhì)綜合評分標(biāo)準(zhǔn)。評價體系將為金銀花的綜合利用、優(yōu)異金銀花種質(zhì)篩選、品質(zhì)改良和新品種選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：138 份金銀花干燥花蕾樣品，來自河南省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技試驗示范基地（113°42′24″E，35°00'36"N）。這些試驗材料原產(chǎn)地分別為：河南新密（HNXM，試驗編號01-06）、河南封丘（HNFQ，試驗編號07-14）、河南原陽（HNYY，試驗編號15-56）、山東平邑（SDPY，試驗編號57-66）、山東日照（SDRZ，試驗編號67-76）、山東濟(jì)寧（SDJN，試驗編號77-86）、河北巨鹿（HBJL，試驗編號87-92）、山西臨汾（SXLF，試驗編號93-100）、甘肅宕昌（GSTC，試驗編號101-138）。

試劑：對照品綠原酸（Chlorogenic acid），日本TCL；蘆?。≧utin）、木犀草苷（Luteoloside）、木犀草素（Luteolin），國藥試劑；異綠原酸A（Isochlorogenic acid A）、異綠原酸C （Isochlorogenic acid C），成都曼思特生物科技有限公司；色譜純甲醇（CH3OH）、乙醇（C2H5OH）、乙腈（C2H3N），生工生物工程上海（股份）有限公司；無水三氯化鋁（AlCl3）、亞硝酸鈉（NaNO2）、氫氧化鈉（NaOH）均為分析純級，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；純凈水（H2O），杭州哇哈哈集團(tuán)。

1.2 儀器及設(shè)備

Agilent/安捷倫1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；KQ3200DE 數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；UV-3200 紫外可見分光光度計，海美譜達(dá)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金銀花活性成分測定 參照譚政委等[7]和李淼等[17]的方法，采用高效液相色譜法（HPLC）測定金銀花的化學(xué)成分。

1.3.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相：乙睛C2H3N（B）-0.3%磷酸水溶液（A）。梯度洗脫：0～11 min，82%～90%A，11～30 min，80%～82%A；30～40 min，80%A；40～50 min，75%～80%A；50～60 min，70%～75%A。檢測波長：348 nm；體積流量：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：30 ℃。

1.3.1.2 混合對照品和供試品溶液的制備 混合對照品溶液：分別精密稱取綠原酸（Chlorogenic acid）、蘆丁（Rutin）、木犀草苷（Luteoloside）、異綠原 酸A （Isochlorogenic acid A）、異綠原酸C（Isochlorogenic acid C）和木犀草素（Luteolin）對照品，放置于10 mL 棕色容量瓶中，加入70%的甲醇溶液溶解、定容，得到質(zhì)量濃度分別為0.646，0.290，0.400，2.980，0.100，0.190 mg/mL 的 混 合 對照品溶液。

供試品溶液：將烘干后的金銀花樣品進(jìn)行粉碎、過篩，稱取0.5 g 樣品粉末置于三角瓶中，加入25 mL 甲醇溶液（體積分?jǐn)?shù)70%）搖動均勻，采用頻率40 kHz，功率150 W 進(jìn)行超聲處理40 min，搖勻后過濾備用。

1.3.1.3 精密度試驗 取同一混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按照1.3.1.2 節(jié)的樣品溶液制備方法將所得溶液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，連續(xù)進(jìn)樣6 次，按照每次進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測定，記錄峰面積。經(jīng)計算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.35%，0.51%，0.29%，0.17%，1.31%，0.39%，試驗精密度良好。

1.3.1.4 重復(fù)性試驗 取同一批金銀花樣品6份，按1.3.1.2 節(jié)的樣品溶液制備方法制備，按照每次進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測定，記錄峰面積。經(jīng)計算RSD 分別為0.62%，0.28%，1.24%，0.47%，1.07%，2.04%，試驗重復(fù)性良好。

1.3.1.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批金銀花樣品6份，按1.3.1.2 節(jié)的樣品溶液制備方法制備，按1.3.1.1 節(jié)的色譜條件檢測，分別于0，4，8，16，24，32 h，每次進(jìn)樣10 μL 進(jìn)行測定，記錄峰面積。經(jīng)計算RSD 分別為0.65%，2.28%，2.23%，0.67%，1.52%，2.81%，試驗穩(wěn)定性良好。

1.4 總黃酮含量的測定

參照樊深等[18]的方法，用紫外分光光度計法（Ultraviolet spectrophotometry）測定和計算金銀花提取物的總黃酮含量。

1.4.1 金銀花提取液的制備 將烘干后的金銀花樣品粉碎、過篩后，稱取樣品粉末0.25 g，加入25 mL 乙醇（體積分?jǐn)?shù)50%），進(jìn)行超聲處理（溫度50℃，頻率40 kHz，功率150 W，時間35 min）后過濾備用。

1.4.2 金銀花總黃酮的測定 以蘆丁 （Rutin）為標(biāo)準(zhǔn)樣，采用紫外分光光度計法（Ultraviolet spectrophotometry） 在510 nm 波長處比色定量測定金銀花總黃酮含量。操作步驟為：稱取蘆?。≧utin）0.0207 g （溫度120 ℃干燥處理），用為70%的甲醇（CH3OH）溶液定容至100 mL，獲得質(zhì)量濃度為0.227 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。分別吸取0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL 標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液放置于6 支試管中，加入30%的乙醇（C2H5OH）溶液至5 mL，然后再加入0.3 mL 5%的亞硝酸鈉（NaNO2）溶液，混合均勻后靜置6 min，然后加入0.3 mL 10%的三氯化鋁（Al2O3）溶液，混合均勻后靜置6 min，然后再加入4 mL 濃度為1 mol/L 的氫氧化鈉（NaOH）溶液，再加入0.4 mL 水，混合均勻后靜置15 min，測定吸光度（波長510 nm），計算總黃酮含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 統(tǒng)計分析 采用SPSS 20.0 軟件Duncan's方法進(jìn)行顯著性分析（P＜0.05 表示差異顯著）；采用Excel 2018 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和相關(guān)分析。

1.5.2 灰色關(guān)聯(lián)模型分析 參照高琦等[19]的灰色關(guān)聯(lián)模型，通過數(shù)據(jù)無量綱化，消除各量綱的指數(shù)差異，計算參考序列與比較序列的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)。采用熵權(quán)法[20]計算加權(quán)關(guān)聯(lián)度。熵權(quán)法、灰色關(guān)聯(lián)分析與主成分分析相結(jié)合，建立金銀花營養(yǎng)品質(zhì)綜合評價函數(shù)。

公式（1）中，ξn（K）——各項指標(biāo)灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)；ξ——分辨系數(shù)，本研究取值0.5。

公式（2）中，Xi——加權(quán)關(guān)聯(lián)度；n——指標(biāo)個數(shù)；ω——加權(quán)系數(shù)；ξi（k）——關(guān)聯(lián)系數(shù)。

公式（3）中，ω——加權(quán)系數(shù)；n——指標(biāo)個數(shù)；Ej——指標(biāo)貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地金銀花營養(yǎng)成分分析

來自不同地區(qū)的138 個參試材料綠原酸（Chlorogenic acid，C）、木犀草苷（Luteoloside，LS）、蘆?。≧utin，R）、異綠原酸A（Isochlorogenic acid A，IA）、異綠原酸C（Isochlorogenic acid C，IC）、木犀草素（Luteolin，LI）和總黃酮（Flavonoids，F(xiàn)）含量7 個營養(yǎng)成分的變異特征如表1所示。不同產(chǎn)地金銀花營養(yǎng)成分總體上差異較大，變異系數(shù)為8.32%～71.23%。除F 相對不大之外（8.32%），其余5 個成分的變異系數(shù)為23.32%～71.23%，相對較大。特別是LI 變異最大，達(dá)到71.23%。其中，6 個成分中，HNXM 產(chǎn)區(qū)C 和F 2 個成分含量最高，分別達(dá)到14.654 mg 和0.681 mg/mL，LS 成分含量最低，為0.456 mg；GSTC 產(chǎn)區(qū)R、LS、LI 3 個成分含量最高，分別達(dá)到0.745，0.886，0.330 mg，C和F2 個成分含量最低，分別為10.112 mg 和0.601 mg/mL；HNYY 產(chǎn)區(qū)IA、TC 2 個成分含量最高，分別達(dá)到25.670 mg 和1.784 mg；SDRZ 產(chǎn)區(qū)R、IC 2 個成分含量最低，分別為0.059 mg 和1.127 mg；SDJN 和HBJL產(chǎn)區(qū)分別在IA 和LI 2個成分含量最低，分別為15.089 mg 和0.084 mg。顯著性分析表明，C 在HNXM、HNFQ、HNYY 產(chǎn)區(qū)含量差異顯著且均與SXLF、GSTC 產(chǎn)區(qū)含量差異顯著；R 在GSTC、SXLF、SDRZ 含量差異顯著且均與HNXM、HNFQ 產(chǎn)區(qū)含量差異顯著；LS 在GSTC、SXLF、HBJL、HNXM 產(chǎn)區(qū)含量差異顯著；IA在HNYY 與SDPY、SDRZ、SDJN 產(chǎn)區(qū)含量差異顯著；IC 在HNYY 與SDPY、SDRZ、SDJN、HBJL 產(chǎn)區(qū)含量差異顯著；LI 在SDLN、GSTC 含量差異顯著且均與HNYY、HNJL、SXLF 產(chǎn)區(qū)含量差異顯著；F在HNXM、SDJN 含量差異顯著且均與HBJL、GSTC 含量差異顯著。說明這7 種成分均受到環(huán)境的影響，而影響程度各有不同。該研究結(jié)果對于評價不同產(chǎn)地金銀花各營養(yǎng)成分含量具有重要的參考價值，有利于根據(jù)市場需要進(jìn)行定向選擇，也可以為育種家選育專用型新品種提供產(chǎn)區(qū)參考。

表1 不同品系金銀花內(nèi)在成分含量結(jié)果Table 1 Results of internal component content in different lines of honeysuckle

2.2 不同產(chǎn)地金銀花營養(yǎng)成分相關(guān)性分析

相關(guān)性分析中通過相關(guān)系數(shù)比較各性狀間的顯著性和密切程度。植物代謝過程中，往往存在一定的相關(guān)性，推動了植物性狀的直觀分析和化學(xué)成分合成代謝分析的進(jìn)程[21]。金銀花各營養(yǎng)成分間的相關(guān)系數(shù)詳見表2。結(jié)果表明，LS 與C 和R含量、IA 與IC 含量、F 與IA 和IC 含量表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)；LI 與IA 和IC 表現(xiàn)出極顯著負(fù)相關(guān)，F(xiàn) 與LI 表現(xiàn)出極顯著負(fù)相關(guān)。說明金銀花不同營養(yǎng)成分間存在一定的相關(guān)性。

表2 金銀花營養(yǎng)成分相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of nutritional components in honeysuckle

2.3 金銀花營養(yǎng)品質(zhì)綜合評價體系的建立

2.3.1 金銀花營養(yǎng)成分因子分析 本研究檢測了金銀花7 個營養(yǎng)成分的含量，變量數(shù)量較多，相互間關(guān)系比較復(fù)雜。通過主成分分析，把多個指標(biāo)降維成少數(shù)幾個綜合指標(biāo)[22]。運(yùn)用SPSS 20.0 軟件對參試金銀花樣品7 個營養(yǎng)成分測定結(jié)果進(jìn)行主成分分析。依據(jù)信息量損失≤15%、累計貢獻(xiàn)率＞85%的原則，計算出主成分因子載荷和貢獻(xiàn)率，詳見表3。方差貢獻(xiàn)率結(jié)果表明，前3 個主成分分別為44.339%，23.930%，18.382%，累計貢獻(xiàn)率為86.651%。這3 個主成分基本上可以還原色譜信息，分別定義為PC1、PC2、PC3。表3表明，IA、IC和LI 含量荷載較大，與PC1 相關(guān)程度較高；C 和LS 含量荷載絕對值較大，與PC2 相關(guān)程度較高；R和F 含量荷載絕對值較大，與PC3 相關(guān)程度較高。因此，將3 個主成分命名為：PC1 包括IA、IC 和LI；PC2 包括C 和LS；PC3 包括R 和F。將7 個營養(yǎng)成分指標(biāo)降維成3 個主成分因子。根據(jù)每個主成分因子的權(quán)重值和特征值，得到3 個因子的判別函數(shù)如下：

表3 各主要性狀主成分的因子載荷和貢獻(xiàn)率Table 3 Factor load and contribution rate of principal components of main characters

函數(shù)表達(dá)式中，y1、y2、y3分別表示主成分1、主成分2、主成分3，x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7分別表示變量C、R、LS、IA、IC、LI、F 含量。

2.3.2 熵權(quán)法賦予權(quán)重 對不同產(chǎn)地金銀花營養(yǎng)品質(zhì)綜合評價時，由于7 個營養(yǎng)成分含量差距較大，各項指標(biāo)對評價結(jié)果的重要程度并不完全一致。為使評價結(jié)果更加客觀實(shí)際，可以通過權(quán)重系數(shù)來反映。權(quán)重系數(shù)越大，表明重要程度越高，對評價結(jié)果的影響越顯著[23]。本研究采用客觀賦權(quán)法中的熵權(quán)法對各評價指標(biāo)賦予權(quán)重，結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)法對不同產(chǎn)地金銀花營養(yǎng)品質(zhì)綜合評價。采用公式（3）計算各指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)，得到C、R、LS、IA、IC、LI、F 含量的信息熵分別是0.826，0.860，0.534，0.839，0.791，0.542 和0.751，賦予的權(quán)重系數(shù)分別為0.071，0.044，0.301，0.061，0.099，0.294和0.130。詳見表4。

表4 評價指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)Table 4 Weight coefficients of evaluation indicators

2.3.3 灰色關(guān)聯(lián)度分析 依據(jù)灰色關(guān)聯(lián)度理論，建立灰色系統(tǒng)時，把所有試驗品種都作為系統(tǒng)中的一個因素，使用關(guān)聯(lián)度分析各因素的關(guān)聯(lián)程度。關(guān)聯(lián)度數(shù)值越大，性狀越優(yōu)。依據(jù)各指標(biāo)關(guān)聯(lián)度大小，賦予各指標(biāo)不同的權(quán)重，計算各指標(biāo)的加權(quán)關(guān)聯(lián)度。

以3 個主成分為自變量，以關(guān)聯(lián)度為因變量進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程y=0.324-0.019x1+0.024x2-0.011x3。將回歸方程去標(biāo)準(zhǔn)化，得到多元線性回歸模型，即金銀花營養(yǎng)品質(zhì)評價模型：

式中，x1、x2、x3、x4、x5、x6、x7分別表示變量C、R、LS、IA、IC、LI、F 含量。

利用該模型，對138 個參試金銀花樣本進(jìn)行計算，根據(jù)綜合得分結(jié)果進(jìn)行分級，共分為6 個級別，詳見表5。

表5 金銀花營養(yǎng)品質(zhì)綜合評分標(biāo)準(zhǔn)Table 5 Comprehensive evaluation standard of nutritional quality of honeysuckle

3 結(jié)論

作物的品質(zhì)性狀大多是受多基因控制的數(shù)量性狀，受環(huán)境影響較大[24]。因此，對種質(zhì)資源進(jìn)行多指標(biāo)綜合評判，對于種質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)最佳材料篩選和品種改良具有重要的指導(dǎo)意義[25]。本研究中，選取了來自全國各大主產(chǎn)區(qū)的138 種金銀花材料，變異類型豐富，營養(yǎng)價值高，主要營養(yǎng)成分齊全，然而變量元素多，分析計算比較復(fù)雜，為此，采用PCA 方法降維，選取具有代表性的、數(shù)量盡可能少的主成分來描述多種指標(biāo)之間的聯(lián)系。通過PCA 將7 個營養(yǎng)組分指標(biāo)簡化為3 個主成分因子，PC1 包括異綠原酸A、異綠原酸C 和木犀草素；PC2 包括綠原酸和木犀草苷；PC3 包括蘆丁和總黃酮。3 個主成分貢獻(xiàn)率分別為44.339%，23.930%和18.382%，累計貢獻(xiàn)率為86.651%。采用熵權(quán)法、灰色關(guān)聯(lián)度分析法和主成分分析，建立金銀花營養(yǎng)品質(zhì)綜合評價函數(shù)，y=0.049x1-0.018x2+0.106x3+0.088x4+0.067x5+0.335x6+0.055x7+0.282。通過概率分布建立金銀花營養(yǎng)品質(zhì)綜合評分6 級標(biāo)準(zhǔn)。利用評價體系對金銀花資源營養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行綜合分析，可以得到更加客觀的營養(yǎng)評價結(jié)果，為篩選營養(yǎng)品質(zhì)最優(yōu)的金銀花材料提供依據(jù)。該研究結(jié)果實(shí)際利用價值較大。