張 琴，唐鳳仙，宋 文，周發(fā)科，寧 明，單春會*

（1 石河子大學(xué)食品學(xué)院 新疆石河子 832000 2 石河子大學(xué) 新疆特色果蔬貯藏加工教育部工程研究中心 新疆石河子 832000）

伽師瓜屬葫蘆科（Cutrbitaceae） 黃瓜屬（Cucumis L.），因產(chǎn)地在新疆伽師縣而得名，居全疆甜瓜之首，被稱為“天下第一瓜”。軟化是躍變型果實(shí)成熟期間發(fā)生的主要變化之一，甜瓜作為一種典型的呼吸躍變型果實(shí)，在采后貯藏過程中，易迅速軟化，從而增加了對機(jī)械損傷和病原菌感染的敏感性，縮短了采后貯藏壽命，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。開展伽師瓜果實(shí)軟化過程的研究，對延長其采后壽命和促進(jìn)甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

果實(shí)的軟化與細(xì)胞壁成分（如果膠物質(zhì)、半纖維素和纖維素）的分解密切相關(guān)[2-3]。細(xì)胞壁的降解過程涉及多種酶，包括果膠酯酶（PE）、多聚半乳糖醛酸酶（PG）、β-半乳糖苷酶（β-Gal）、β-葡萄糖苷酶（β-Glu）、內(nèi)切葡聚糖酶（EGase）、β-木糖苷酶（β-Xyl）[4-5]。PE 主要催化高甲基酯化果膠的去酯化反應(yīng)，使細(xì)胞壁易于被PG 進(jìn)一步水解[6]；PG 催化聚半乳糖醛酸主鏈的半乳糖醛酸鍵的水解[7]，兩者協(xié)同作用使果實(shí)軟化。β-Glu 能夠水解結(jié)合于碳水化合物或糖苷分子非還原性末端的β-D-葡萄糖鍵，基于底物糖苷配基的活性，β-Glu 在植物中的生理功能包括細(xì)胞壁分解代謝[8]、防御病原體[9]和木質(zhì)化[10]。β-GAL 可作用于鼠李半乳聚糖殘基，水解β-1，4-半乳糖鍵，催化果實(shí)軟化[11]。已有報(bào)道PG、PE、EGase、β-Glu 和β-Gal 在不同貯藏時(shí)期，以不同的方式參與甜瓜果實(shí)的軟化進(jìn)程[12]。在常溫貯藏條件下，1-MCP 通過抑制細(xì)胞壁酶（PE、PG、EGase 和β-GAL）活性，來延緩哈密瓜的軟化[1]。

溫度控制是維持果實(shí)采后品質(zhì)、延長保存期的有效策略，低溫能夠降低果實(shí)代謝率，同時(shí)抑制大量參與果實(shí)后熟過程酶的活性及相關(guān)基因的表達(dá)，從而有效延緩采后果實(shí)的軟化[13-14]。研究不同貯藏溫度下伽師瓜果實(shí)軟化相關(guān)酶活性變化，以及相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，對于了解采后貯藏過程中伽師瓜硬度的變化，以及挖掘軟化關(guān)鍵基因具有非常重要的意義。

本試驗(yàn)以伽師瓜為研究對象，對不同溫度（0.5，3，21 ℃）貯藏0，12，24 d 的伽師瓜果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，旨在研究貯藏溫度對采后伽師瓜硬度，特別是相關(guān)基因表達(dá)的影響，以期為伽師瓜的軟化調(diào)控及貯藏保鮮提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

從新疆石河子121 團(tuán)農(nóng)場采摘成熟度為八成熟（可溶性固形物含量12%左右）、大小均勻、無病蟲害和機(jī)械損傷的伽師瓜。采摘后，將每個哈密瓜置于獨(dú)立塑料網(wǎng)中，然后放入標(biāo)準(zhǔn)紙箱（50 cm×40 cm×18 cm，每箱3～4 個），運(yùn)往石河子大學(xué)食品學(xué)院，貯藏溫度分別為21，3 ℃和0.5 ℃，相對濕度85%～95%。

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒，上海優(yōu)選生物科技有限公司；RNA 試劑盒（Trizol），生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TA.XT plus 質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Systems 公司；Multifuge X1R 高速冷凍離心機(jī)，賽默飛世爾科技（中國） 有限公司；1X71 多功能酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；LightCycler480 II 型熒光定量PCR 儀，瑞士Rotkreuz 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品收集 預(yù)冷24 h 后設(shè)置為對照組0 d，對3 個溫度貯藏下的伽師瓜分別于0，12，24 d取樣，每組取樣包含6 個瓜，設(shè)置3 次重復(fù)。取樣時(shí)，去除2 mm 果皮，并從表面獲取4～5 g 哈密瓜組織，樣品置于液氮速凍并轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，備用。

1.3.2 硬度的測定 根據(jù)Ning 等[15]的方法測定伽師瓜果實(shí)硬度。將伽師瓜切成厚度為1.5 cm 的薄片，利用質(zhì)構(gòu)儀在穿刺模式下測定其硬度，每個瓜設(shè)置5 個重復(fù)，取平均值。

1.3.3 酶活的測定 果膠酯酶（PE）和β-葡萄糖苷酶（β-Glu）活力均采用ELISA 試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.4 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析

1.3.4.1 測序 使用TRIzol RNA 提取試劑盒提取伽師瓜總RNA，cDNA 文庫的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序由深圳華大基因研究院完成。

1.3.4.2 基因表達(dá)分析 利用RSEM[16]工具進(jìn)行基因表達(dá)定量，表達(dá)定量的結(jié)果以FPKM 為單位，具體計(jì)算公式如下：

式中，C——比對到某基因的fragments 數(shù)；N——比對到參考基因的總fragments 數(shù)；L——基因編碼區(qū)的堿基數(shù)。

1.3.4.3 差異表達(dá)基因的篩選 通過控制錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）來決定P-value 的閾值，該基因的表達(dá)水平（FPKM 值）用于計(jì)算樣品之間表達(dá)的倍數(shù)變化，以|log2（Ratio）|≥1 且FDR ≤0.001 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。

1.3.4.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）分析 使用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物序列（表1），使用LightCycler480 II 型熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR 檢測，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃，3 min；反應(yīng)循環(huán)45 次，循環(huán)過程95 ℃，5 s；60 ℃，30 s。使用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的相對表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物序列Table 1 The sequences of specific primers used for qRT-PCR analysis

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010、Origin 2018、SPSS 17.0 和TBtools 等軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度對伽師瓜果實(shí)硬度的影響

由圖1可以看出，隨著貯藏時(shí)間的延長，伽師瓜果實(shí)的硬度不斷降低。0.5 ℃貯藏條件下，伽師瓜硬度下降較為緩慢，且在整個貯藏過程中始終高于3 ℃處理組和21 ℃處理組。貯藏開始時(shí)（0 d），伽師瓜果實(shí)硬度為1.53 N，貯藏結(jié)束時(shí)（30 d），0.5 ℃處理組伽師瓜硬度為1.32 N，相對于貯藏前下降了13.7%（P<0.05）；3 ℃處理組伽師瓜硬度為1.28 N，相對于貯藏前下降了16.3%（P<0.05）；21 ℃處理組伽師瓜硬度為1.21 N，相對于貯藏前下降了20.9%（P<0.05）。由此可知，低溫貯藏能夠延緩伽師瓜的軟化，尤其是0.5 ℃貯藏，能夠較好的維持伽師瓜的硬度。

圖1 不同貯藏溫度對伽師瓜果實(shí)硬度的影響Fig.1 Effect of different storage temperatures on the firmness of Jiashi melon

2.2 貯藏溫度對伽師瓜果實(shí)PE、β-Glu 活性的影響

如圖2a 所示，伽師瓜果實(shí)的PE 活性在貯藏過程中呈先上升后下降的趨勢。貯藏12 d 時(shí)，21℃處理組的PE 活力最高，為280.53 U/mL，3 ℃和0.5 ℃處理組的PE 活力分別為248.29 U/mL 和241.84 U/mL。貯藏24 d 時(shí)，21 ℃處理組的PE 活力顯著低于3 ℃和0.5 ℃處理組（P<0.05），同時(shí)，0.5 ℃處理組的PE 活力在12 d 和24 d 均低于3℃處理組。

由圖2b 可知，常溫貯藏下伽師瓜果實(shí)β-Glu活性隨著貯藏時(shí)間的延長呈先上升后下降的趨勢。貯藏12 d 時(shí)，0.5 ℃處理組和3 ℃處理組的β-Glu 活力分別為10.37 U/mL 和12.04 U/mL，均低于21 ℃處理組，低溫會抑制伽師瓜果實(shí)β-Glu 活力，這種抑制作用在貯藏后期更為明顯。

圖2 不同貯藏溫度對伽師瓜果實(shí)PE 和β-Glu 活性的影響Fig.2 Effect of different storage temperatures on the activity of PE and β-Glu in Jiashi melon

2.3 采后貯藏期間伽師瓜果實(shí)轉(zhuǎn)錄組分析

與對照組（0 d）相比，不同貯藏溫度和不同貯藏時(shí)間下的差異表達(dá)基因如圖3所示。在3 個貯藏溫度下，與對照組相比，貯藏24 d 時(shí)的差異表達(dá)基因數(shù)目均高于12 d，并且整個貯藏期間下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目均大于上調(diào)表達(dá)基因數(shù)。12 d 時(shí)，3 ℃貯藏條件下的下調(diào)表達(dá)基因數(shù)最多，0.5 ℃貯藏條件下的上調(diào)表達(dá)基因數(shù)最多；24 d 時(shí)，0.5 ℃貯藏條件下的下調(diào)表達(dá)基因數(shù)最多，3 ℃貯藏條件下的上調(diào)表達(dá)基因數(shù)最多。結(jié)果表明，伽師瓜果實(shí)中許多基因的表達(dá)水平都受到貯藏條件的影響，并且不同貯藏溫度和貯藏時(shí)間的影響各不相同。此外，低溫動員了更多基因的差異表達(dá)，這些基因表達(dá)水平的變化，對于調(diào)節(jié)哈密瓜對冷的應(yīng)答并保護(hù)細(xì)胞免受冷害損傷，具有非常重要的作用。

圖3 不同貯藏條件下差異表達(dá)基因數(shù)Fig.3 Number of DEGs in different storage conditions

2.4 21 ℃下軟化相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選與分析

從轉(zhuǎn)錄組和KEGG pathway 數(shù)據(jù)庫篩選得到33 個β-Glu 基因，32 個β-Gal 基因，31 個PE 基因，9 個PG 基因，7 個EGase 基因和6 個β-Xyl 基因。以上118 個基因表達(dá)結(jié)果顯示，與對照組相比，21 ℃-12 d 組中篩選出14 個顯著差異表達(dá)基因，21 ℃-24 d 組中篩選出42 個顯著差異表達(dá)基因（圖4）。進(jìn)一步分析表明，10 個基因在2 個時(shí)間點(diǎn)均差異表達(dá)（表2），包括3 個EGase 基因（ID：103482819；103493091；103499972），2 個β-Gal 基因（103492646 ；103503132 ），2 個 PE 基因（103483370；103483991），1 個 β -Xyl 基因（103488410），1 個β-Glu 基因 （103492048） 和1個PG 基因（103493318）。這些基因表達(dá)水平的變化可能與21 ℃貯藏條件下伽師瓜硬度的變化特性直接相關(guān)。

圖4 21 ℃下差異表達(dá)基因維恩圖Fig.4 Venn diagram of DEGs at 21 ℃

表2 21 ℃貯藏條件下伽師瓜軟化相關(guān)基因表達(dá)情況Table 2 Expression of softening-related genes in Jiashi melon at 21 ℃

2.5 3 ℃下軟化相關(guān)基因的表達(dá)水平分析

利用FPKM 法計(jì)算基因表達(dá)量，以研究溫度對采后伽師瓜貯藏期間硬度相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。篩選獲得68 個軟化相關(guān)基因在3 ℃和21℃下表達(dá)模式相反（圖5），包括18 個PE 基因，22個β-Glu 基因，19 個β-Gal 基因，4 個PG 基因，4個β-Xyl 基因以及1 個EGase 基因。進(jìn)一步分析表明，與對照組相比，7 個β-Glu 基因，6 個β-Gal基因和3 個PE 基因在21 ℃條件下表達(dá)水平無變化，然而在3 ℃下顯著下調(diào)表達(dá)（表3），其中下調(diào)倍數(shù)最大的是β-Glu 基因103488476 [log2ratio（12 d/0 d）=-3.37；log2ratio（24 d/0 d）=-3.51]。此外，β-Gal 基因（103492389；103492528），β-Glu基因（103489355；103497095），PE 基因（103487960）變化倍數(shù)也較大，這些基因的表達(dá)變化可能與3 ℃貯藏條件下伽師瓜的硬度變化減緩有關(guān)。

表3 3 ℃貯藏條件下伽師瓜軟化相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)情況Table 3 Down-regulated expression of softening-related genes in Jiashi melon at 3 ℃storage

（續(xù)表3）

圖5 21 ℃和3 ℃間表達(dá)模式相反的差異表達(dá)基因熱圖分析Fig.5 Heatmap of DEGs with opposite regulating patterns between 21 ℃and 3 ℃

2.6 0.5 ℃下軟化相關(guān)基因的表達(dá)水平分析

篩選獲得69 個軟化相關(guān)基因在0.5 ℃和21℃貯藏條件下表達(dá)模式相反（圖6），其中，包括19個PE 基因，19 個β-Glu 基因，20 個β-Gal 基因，4個PG 基因，5 個β-Xyl 基因，2 個EGase 基因。與對照組相比，16 個軟化相關(guān)基因在21 ℃條件下表達(dá)水平無變化，然而在0.5 ℃下顯著下調(diào)表達(dá)（表4），包括7 個β-Glu 基因，4 個PE 基因，4 個β-Gal 基因和1 個PG 基因。其中，β-Gal 基因（103503204）和β-Glu 基因（103494776）在12 d和24 d 下調(diào)倍數(shù)均較大，此外，12 d 時(shí)β-Glu 基因（103491100）、PE 基因（107992140），以及24 d時(shí)PE 基因（103499643）、β-Glu 基因（103502767；103501132；103489355）下調(diào)倍數(shù)也較大。這些基因可能與伽師瓜在0.5 ℃和21 ℃貯藏下硬度的變化差異直接相關(guān)。

圖6 21 ℃和0.5 ℃間表達(dá)模式相反的差異表達(dá)基因熱圖分析Fig.6 Heatmap of DEGs with opposite regulating patterns between 21 ℃and 0.5 ℃

表4 0.5 ℃貯藏條件下伽師瓜軟化相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)情況Table 4 Down-regulated expression of softening-related genes in Jiashi melon at 0.5 ℃storage

2.7 3 個溫度下硬度相關(guān)基因的表達(dá)水平分析

篩選21 ℃-3 ℃，21 ℃-0.5 ℃和3 ℃-0.5 ℃組的差異表達(dá)基因來評估貯藏溫度對軟化相關(guān)基因表達(dá)水平的影響。由圖7可知，貯藏12 d 時(shí)，在21 ℃-3 ℃，21 ℃-0.5 ℃和3 ℃-0.5 ℃組中均差異表達(dá)的基因有10 個，在21 ℃-3 ℃和3 ℃-0.5 ℃組中均差異表達(dá)的基因有23 個，在21 ℃-0.5 ℃和3 ℃-0.5 ℃組中均差異表達(dá)的基因有25 個。貯藏24 d 時(shí)，在21 ℃-3 ℃，21 ℃-0.5 ℃和3 ℃-0.5℃組中均差異表達(dá)的基因有17 個，在21 ℃-3 ℃和3 ℃-0.5 ℃組中均差異表達(dá)的基因有33 個，在21 ℃-0.5 ℃和3 ℃-0.5 ℃組中均差異表達(dá)的基因有35 個。這些基因受貯藏溫度的影響差異顯著，可能與不同溫度貯藏下，果實(shí)果膠物質(zhì)的水解程度直接相關(guān)，進(jìn)而影響果實(shí)硬度的變化。

圖7 3 ℃-0.5 ℃，21 ℃-0.5 ℃和21 ℃-3 ℃組差異表達(dá)基因維恩圖Fig.7 Venn diagram of DEGs among the sets of 3 ℃-0.5 ℃，21 ℃-0.5 ℃，and 21 ℃-3 ℃

對在3 個對比組中均差異表達(dá)的基因分析可知，貯藏12 d 時(shí)，與21 ℃相比，4 個基因在3 ℃和0.5 ℃下調(diào)表達(dá)，且在0.5 ℃的下調(diào)程度高于3 ℃，包括2 個β-Gal 基因（103494366；103503204），1個β-Glu 基因 （103501132）和1 個PE 基因（103483370）（圖8a）。同樣地，貯藏24 d 時(shí)，與21℃相比，4 個基因在3 ℃和0.5 ℃下調(diào)表達(dá)，且在0.5 ℃的下調(diào)程度高于3 ℃，2 個β-Glu 基因（103497772；103501132），1 個 β -Gal 基因（103500059） 和1 個PE 基因 （103483986）（圖8b）。

圖8 共差異表達(dá)基因表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of common DEGs

2.8 qRT-PCR 驗(yàn)證分析基因表達(dá)

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，選擇6 個軟化相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR 分析，包括2 個PE 基因（103483370；103487960），2 個 β -Glu 基因（103501132；103502767），2 個 β -Gal 基因（103494366；103492528）。結(jié)果如圖9所示，qRTPCR 驗(yàn)證的基因表達(dá)變化趨勢與RNA-Seq 鑒定的基因表達(dá)趨勢一致，表明轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果具有較高的可靠性。

圖9 不同貯藏溫度對基因表達(dá)量的影響Fig.9 Effect of different storage temperatures on the gene expression

3 討論

硬度是評價(jià)果實(shí)品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，果實(shí)軟化是硬度降低的外在表現(xiàn)[17]。哈密瓜是典型的呼吸躍變型果實(shí)，在采后常溫貯藏條件下易發(fā)生軟化，嚴(yán)重縮短了其貨架期，并限制了貯藏和運(yùn)輸[1]。對李子的研究發(fā)現(xiàn)低溫能夠在一定程度上抑制各細(xì)胞壁酶的活性，從而影響李子的軟化[18]，這與本研究結(jié)果一致，在貯藏前期（12 d），低溫處理組的PE、β-Glu 活性均低于常溫處理組，果膠的降解減慢，伽師瓜的硬度降低較緩。后期21 ℃處理組的PE 活力急劇降低，可能與貯藏后期果實(shí)的腐爛有關(guān)；β-Glu 主要參與后期的果實(shí)軟化。此外，通過采前乙酰水楊酸處理[19]和采后1-MCP 處理[7，20]，均可降低甜瓜果實(shí)β-Glu 活性，減緩果實(shí)硬度的下降。

通過對不同貯藏溫度下哈密瓜軟化相關(guān)基因表達(dá)變化的分析可知，低溫主要通過調(diào)控β-Glu基因、β-Gal 基因、PE 基因以及PG 基因的表達(dá)來減緩采后伽師瓜的軟化（表3，表4，圖8）。在果實(shí)軟化過程中，PE 和PG 基因表達(dá)量較高，參與細(xì)胞壁的修飾從而導(dǎo)致果膠降解和果實(shí)軟化[21]。PE 基因（107992140）在低溫（0.5 ℃和3 ℃）下的表達(dá)模式與21 ℃相反，并且與對照組相比，該基因在21℃條件下表達(dá)水平無變化，然而在低溫下顯著下調(diào)表達(dá)；同樣地，PG 基因（103492385）在0.5 ℃下顯著下調(diào)表達(dá)，然而在21 ℃下表達(dá)水平無變化。這些基因的表達(dá)差異可能是低溫下哈密瓜硬度維持的主要原因。對杏的研究表明β-Gal 基因的表達(dá)峰值時(shí)間與最大乙烯產(chǎn)量時(shí)間一致，同時(shí)1-MCP 處理可抑制其表達(dá)[22]。PpBGAL10 和PpBGAL16 是影響乙烯依賴型桃果實(shí)軟化的主要β-Gal 基因，其下調(diào)表達(dá)時(shí)可通過降低PG 和PE 活性，抑制細(xì)胞壁的降解和乙烯的生成，從而延緩桃果實(shí)軟化[23]。β-Glu 屬于細(xì)胞壁多糖水解酶類，能與纖維素酶協(xié)調(diào)作用，在植物細(xì)胞生長發(fā)育過程中參與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的松弛或加固[24]。Ge 等[25]研究表明β-Glu 在延緩棗果實(shí)硬度下降中發(fā)揮重要作用。β-Glu 基因DkBG1 的過表達(dá)可通過提高脫落酸水平來改變果實(shí)成熟度，并通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因番茄中的可溶性糖水平來影響果實(shí)品質(zhì)。目前，操縱糖苷酶活性和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控是提高果實(shí)品質(zhì)性狀的一種重要策略，在本研究結(jié)果中，較多的β-Gal和β-Glu 基因在不同的貯藏條件下顯著差異表達(dá)，因此，調(diào)節(jié)β-Gal 和β-Glu 相關(guān)基因的表達(dá)可能是減少采后伽師瓜硬度損失的重要方法。

4 結(jié)論

運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分別對采后0.5，3 ℃和21℃貯藏0，12 d 和24 d 的伽師瓜果實(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選得到118 個軟化相關(guān)基因，結(jié)果表明貯藏溫度顯著影響了軟化相關(guān)基因的表達(dá)水平，低溫通過抑制細(xì)胞壁酶的活性以及調(diào)控軟化相關(guān)基因的表達(dá)，來減緩伽師瓜果實(shí)的軟化進(jìn)程。另外，挖掘出了部分調(diào)控軟化的重要基因，為通過基因操作改善伽師瓜貯藏軟化提供支撐。