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        海參蒸煮液干粉對(duì)四氯化碳致小鼠急性肝損傷的預(yù)防作用

        2022-08-17 05:56:24蔡維震張?zhí)祢U王慶慧王靜鳳
        中國食品學(xué)報(bào) 2022年7期
        關(guān)鍵詞:小鼠血清模型

        蔡維震,張?zhí)祢U,王慶慧,丁 寧,胡 煒,王靜鳳*

        (1 中國海洋大學(xué) 山東青島 266000 2 青島墨爾文中學(xué) 山東青島 266000 3 山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司 山東威海 264200)

        肝臟是機(jī)體最重要的解毒代謝器官之一,在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)的代謝中起著重要作用,被稱為“物質(zhì)代謝的中樞”。數(shù)據(jù)估計(jì),中國超過五分之一的人群受到肝臟疾病的困擾,使得肝病成為我國發(fā)病率和死亡率的主要影響因素之一[1]。急性肝損傷與多種肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān);急性肝損傷引發(fā)的肝功能衰竭病死率占肝病患者的60%~80%[2],嚴(yán)重危害人類健康。臨床藥物甘草酸制劑、水飛薊素等在治療肝臟疾病的同時(shí),伴有水腫、嘔吐、腹瀉等一定副作用。迫切需要尋找一種具有保肝、護(hù)肝且無毒副作用的活性物質(zhì)。

        海參蒸煮液 (Sea cucumber cooking liquid,SCCL)是海參蒸煮滅酶過程中產(chǎn)生的大量墨綠色液體。前期研究發(fā)現(xiàn),海參蒸煮液中含有大量的多糖、多肽、脂質(zhì)和皂苷類等多種活性物質(zhì),具有抗氧化,抗腫瘤,降血糖等功效。海參蒸煮液中多糖和可溶性蛋白含量分別為0.546,0.535 g/L[3]。若直接將液體倒掉,則會(huì)造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。有研究指出每噸海參蒸煮液可提取海參活性成分12 kg 左右,價(jià)值高達(dá)20 多萬元;全國每年排放的海參蒸煮液的經(jīng)濟(jì)價(jià)值估計(jì)在100 億元以上[4]。翟二林等[5]發(fā)現(xiàn)海參蒸煮液中皂苷可以顯著抑制S180 皮下腫瘤的生長,表現(xiàn)出良好的免疫活性。李超峰[6]研究表明海參蒸煮液中酸性黏多糖能夠顯著抑制HeLa 細(xì)胞增殖。然而,目前尚未見海參蒸煮液在保肝、護(hù)肝方面的研究報(bào)道。本研究為實(shí)現(xiàn)海參蒸煮液的高值化利用,通過經(jīng)典的CCl4急性肝損傷小鼠模型,探究SCCL 對(duì)肝損傷小鼠的預(yù)防保護(hù)作用,為保肝、護(hù)肝食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及原料 海參蒸煮液干粉,山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司。4~5 周齡雄性ICR小鼠,SPF 級(jí),體質(zhì)量18~22 g,濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。動(dòng)物合格證號(hào):SCXK (魯)20190003。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為(23±1)℃,濕度為40%~50%,12 h 光/12 h 暗節(jié)律交替。

        1.1.2 試劑與藥品 水飛薊賓膠囊,天津天士力圣特制藥有限公司;金龍魚玉米油,益海嘉里食品營銷有限公司;谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、谷胱甘肽(GSH)、8-異前列腺素 (8-iso-PG)、蛋白質(zhì)羰基試劑盒(PCO),南京建成生物工程研究所;M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶,美國Promega 公司;引物,上海生工生物工程有限公司;BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司;其它試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

        1.1.3 儀器與設(shè)備 GL-20M 型高速冷凍離心機(jī),上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司;680 型酶標(biāo)儀,美國Bio-Rad 公司;Light Cycler480 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase chain reaction,PCR)儀,瑞士Roche 公司;Mili-Q Synthesis 超純水系統(tǒng),美國Milipore 公司;馬弗爐,鄭州儀器設(shè)備有限公司;凱氏定氮儀,德國福斯公司。

        1.2 方法

        1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 雄性ICR 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3~5 d,隨機(jī)分5 組,分別為:正常組、模型組、陽性藥組(水飛薊素30 mg/kg)、SCCL 低劑量組(50 mg/kg)、SCCL 高劑量組(200 mg/kg),每組6只。預(yù)灌胃15 d,末次灌胃2 h 后,正常組腹腔注射花生油,其余各組腹腔注射體積分?jǐn)?shù)5%的CCl4玉米油溶液建立急性肝損傷模型,注射劑量為10 mL/kg·bw;禁食不禁水20 h 后,麻醉摘眼球取血、脫頸椎處死小鼠。血清分離后-20 ℃冰箱保存,用于生化指標(biāo)測(cè)定;肝臟摘取后拍照,部分肝臟固定,部分肝臟保存于-80 ℃冰箱備用。

        1.2.2 血清AST、ALT 等生化指標(biāo)測(cè)定 血清ALT、AST 等使用普通試劑盒按相應(yīng)試劑盒說明書測(cè)定。

        1.2.3 肝臟SOD、MDA、GSH-Px、GSH 等生化指標(biāo)測(cè)定 使用生理鹽水制備質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的肝臟勻漿液,6 000 r/min,4 ℃離心20 min,收集上清液。用普通商品試劑盒測(cè)定SOD、GSH-Px 等活性和MDA 含量,Elisa 試劑盒檢測(cè)8-iso-PG 含量。以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)品,肝臟蛋白濃度BCA 試劑盒測(cè)定肝臟蛋白濃度。

        1.2.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察 肝臟組織使用4%多聚甲醛固定24 h,酒精脫水,石蠟包埋,制備5 μm 切片,蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin,H &E)染色,BH-2 型光學(xué)顯微鏡觀察組織形態(tài)。

        1.2.5 qRT-PCR 法檢測(cè)Keap1、Nrf2 等mRNA 的表達(dá) 使用TRIzol 試劑提取肝臟總RNA,NanoDrop-2000 微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度和純度。采用M-MLV 將1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以此為模版進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)總體系25 μL:cDNA 樣品5 μL,各基因?qū)?yīng)引物0.15 μL,DEPC 水7.2 μL,SYBR 熒光染料12.5 μL。反應(yīng)參數(shù):95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃沿伸30 s,35 個(gè)循環(huán)。以βactin 為內(nèi)參,采用目的基因與內(nèi)參基因比值來表征目的基因相對(duì)表達(dá)量,引物序列見表1。

        表1 目的基因引物序列Table 1 The primer sequence of target genes

        1.2.6 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析,并同時(shí)用LSD 法進(jìn)行組間差異比較,以P<0.05 為顯著性差異,P<0.01 為極顯著差異;實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”(xˉ±s)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 SCCL 基本成分分析

        經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測(cè)得SCCL 中含有較多的脂質(zhì)和蛋白質(zhì),質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為38.01%,35.34%;其次為糖類和灰分,分別為11.36%,10.17%。

        2.2 SCCL 對(duì)急性肝損傷小鼠血清AST、ALT 酶活力的改善作用

        血清AST、ALT 活性反映了肝臟損傷程度,為臨床上判斷肝臟損傷的重要手段[7]。如圖1所示,相較于正常組,模型組小鼠血清AST、ALT 酶活力極顯著升高 (P<0.01),SCCL-H 組血清ALT、AST活力相較于模型組分別降低了40.96%和41.09%(P<0.01),并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系(ALT 酶活力)。上述結(jié)果說明,SCCL 可以在一定程度上減小肝細(xì)胞損傷,降低轉(zhuǎn)氨酶的釋放。

        圖1 SCCL 對(duì)血清ALT、AST 酶活性的影響Fig.1 Effect of SCCL on serum ALT,AST levels inacute liver injury mice

        2.3 SCCL 對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的改善作用

        由圖2肝組織HE 染色(200 倍)可知,正常組肝細(xì)胞排列致密,肝索以肝門靜脈為中心,呈放射狀排列,細(xì)胞核正常無固縮現(xiàn)象。模型組肝細(xì)胞以肝門靜脈為中心出現(xiàn)大面積壞死現(xiàn)象,肝細(xì)胞邊界喪失,肝索斷裂,核固縮嚴(yán)重,細(xì)胞質(zhì)大量流失;SCCL-H 組肝細(xì)胞損傷明顯減輕,無大面積壞死現(xiàn)象(P<0.01),肝索排列整齊,SCCL-L 組肝組織形態(tài)與模型組相比有一定程度改善,而與SCCLH 組相比效果稍差。氧化應(yīng)激與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān),DNA 的氧化損傷可能為肝病的共同發(fā)病機(jī)制[8]。8-羥基脫氧鳥苷(8-OH dG)為DNA 氧化損傷的標(biāo)志產(chǎn)物,在肝臟的積累量可反映出肝細(xì)胞DNA 氧化損傷的程度。由圖3肝組織8-OH dG 免疫組化染色(200 倍)可知,模型組較正常組陽性表達(dá)顯著增加(P<0.01),SCCL 干預(yù)組較模型組陽性表達(dá)面積顯著減少(P<0.01);提示SCCL 可顯著減少DNA 的氧化損傷。

        圖2 SCCL 對(duì)肝細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.2 Effect of SCCL on hepatocyte histomorphology in acute liver injury mice

        圖3 SCCL 對(duì)DNA 氧化產(chǎn)物8-OH dG 表達(dá)的影響Fig.3 Effect of SCCL on the expression of 8-OH dG,the product of DNA oxidative in acute liver injury mice

        2.4 SCCL 對(duì)急性肝損傷小鼠血清、肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的改善作用

        MDA、8-異前列腺素,蛋白質(zhì)羰基分別為脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過氧化產(chǎn)物,肝臟、血清中過氧化產(chǎn)物的積累量可以反映機(jī)體抗氧化的能力[9]。如圖4所示,模型組的MDA、8-iso-PG、PCO 含量較正常組極顯著升高(P<0.01),說明CCl4進(jìn)入機(jī)體后會(huì)引起多種生物大分子物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng),導(dǎo)致機(jī)體組織、器官損傷。SCCL 預(yù)防后,血清、肝臟MDA、8-iso-PG、PCO 含量相較于模型組均極顯著下降(P<0.01);結(jié)果提示SCCL 干預(yù)可改善氧化產(chǎn)物在體內(nèi)的累積。

        圖4 SCCL 對(duì)血清、肝臟氧化產(chǎn)物含量的影響Fig.4 Effect of SCCL on serum and liver oxidation products in mice with liver injury induced by CCl4

        抗氧化酶是清除機(jī)體自由基的重要物質(zhì),它能對(duì)自由基誘發(fā)的氧化反應(yīng)起保護(hù)作用[10]。由圖5可以得出,模型組血清、肝臟中SOD、GSH-Px、GSH 含量較正常組極顯著降低(P<0.01),SCCL 組血清、肝臟中其含量相較于模型組都有不同程度的升高(P<0.01);提示SCCL 可提高機(jī)體抗氧化物的酶活力,增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力,減小CCl4對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷。

        圖5 SCCL 對(duì)血清、肝臟抗氧化物酶、底物含量的影響Fig.5 Effect of SCCL on the content of serum,liver antioxidant enzymes and substrates in acute liver injury mice

        2.5 SCCL 對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟Nrf2 通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

        Nrf2 是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子,在活性氧的刺激下進(jìn)入細(xì)胞核,與抗氧化反應(yīng)元件相互作用,并誘導(dǎo)下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá),起到保護(hù)細(xì)胞的作用[11]。SCCL 對(duì)肝臟Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)影響如圖6所示。與正常組相比,模型組Nrf2、Keap-1 mRNA 表達(dá)極顯著降低(P<0.01)。SCCL-H 組Nrf2、Keap-1 mRNA 表達(dá)較模型組分別上升了255%和222%(P<0.01)。HO-1、NQO-1 為重要的Ⅱ相解毒酶,模型組其mRNA表達(dá)較正常組極顯著下降 (P<0.01);SCCL 干預(yù)后,HO-1、NQO-1 mRNA 表達(dá)較模型組顯著增加了90%和85%(P<0.01)。說明SCCL 能通過激活Nrf-2/HO-1 通路改善CCl4誘導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激。

        圖6 SCCL 對(duì)肝臟Nrf2 通路相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of SCCL on the expression of genes related to liver Nrf2 pathway in acute liver injury mice

        3 討論

        急性肝損傷是大量肝細(xì)胞在較短時(shí)間內(nèi)受到外界因素影響而引起的肝臟急性炎癥性疾病,包括各種急性病毒性肝炎、急性缺血性肝損傷及急性毒性肝損傷。CCl4誘導(dǎo)的肝臟急性損傷是經(jīng)典的急性肝損傷模型,經(jīng)常被用來模擬急性病毒性肝炎、急性毒性肝損傷等疾病[12]。CCl4誘導(dǎo)肝臟損傷的機(jī)制目前公認(rèn)為:在細(xì)胞色素P450 作用下,CCl4會(huì)被代謝產(chǎn)生CCl3·和CCl3OO·引發(fā)鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的脂質(zhì)過氧化,造成膜結(jié)構(gòu)和功能失常;并且氧自由基還與肝臟蛋白、DNA 等結(jié)合造成后者功能喪失,最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死[13]。

        AST 和ALT 主要分布在心肌、肝臟、腎臟等組織中,正常血清中含量較低;然而當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí),細(xì)胞膜通透性增加,導(dǎo)致細(xì)胞漿中的AST、ALT 釋放進(jìn)入血液,其含量會(huì)在血液中顯著增加;血清中AST 和ALT 的濃度可直接反映肝臟功能狀態(tài)和肝損傷程度[14-15]。在本研究中,SCCL 干預(yù)后明顯降低了血清中AST、ALT 的活性,這可能與SCCL 中含有部分多糖有關(guān)。滕來賓[16]研究發(fā)現(xiàn),海參巖藻聚糖硫酸酯可以減輕酒精性肝損傷小鼠模型中血清AST、ALT 水平,改善小鼠肝臟損傷,與本研究結(jié)果一致。

        研究證明,氧自由基對(duì)生物膜脂質(zhì)的過氧化作用是引起肝細(xì)胞病理損傷的原因之一。CCl4公認(rèn)的致肝損傷機(jī)制是由于其生成的自由基以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的過氧化反應(yīng)導(dǎo)致。CCl4經(jīng)酶代謝產(chǎn)生的自由基可以與細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜的磷脂分子結(jié)合,導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng),生成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA、8-iso-PG 等[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn),SCCL 顯著降低了血清和肝臟中兩者的累積;與此同時(shí),研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的過氧化產(chǎn)物PCO 含量在SCCL 組顯著降低,PCO 形成是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標(biāo)志,其含量反應(yīng)了蛋白質(zhì)損傷程度[9]。SOD、GSH-Px 在機(jī)體抗氧化防御體系中起著重要作用,SOD 可以清除體內(nèi)超氧陰離子,使細(xì)胞內(nèi)氧自由基處于低水平狀態(tài),維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)平衡;GSH-Px 可以特異性的催化GSH 對(duì)氫過氧化物的還原反應(yīng),減輕脂質(zhì)過氧化物對(duì)細(xì)胞膜造成的破壞[19-20]。綜上,SCCL 可顯著提高血清和肝臟中SOD、GSH-Px、GSH 水平,降低MDA、8-iso-PG、PCO 等氧化產(chǎn)物的累積;提示SCCL 對(duì)肝臟的預(yù)防作用可能是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激,來減輕CCl4對(duì)肝臟造成的損傷。

        進(jìn)一步,檢測(cè)了SCCL 對(duì)肝臟Nrf2/HO-1 通路的影響,Nrf2/HO-1 通路是機(jī)體保護(hù)正常細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激,以及外源性損傷的抗氧化信號(hào)通路[21]。當(dāng)肝細(xì)胞受到CCl4刺激后,Nrf2 磷酸化入核,與核內(nèi)的抗氧化元件ARE 的DNA 序列結(jié)合,啟動(dòng)ARE 調(diào)控的下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表達(dá),從而抵抗氧化應(yīng)激引起的損傷。周金鑫等[22]研究發(fā)現(xiàn)高濃度的CCl4處理會(huì)導(dǎo)致大量肝細(xì)胞壞死及毒物的侵襲,導(dǎo)致Nrf2 及其下游抗氧化酶基因的表達(dá)能力明顯減弱。本研究結(jié)果顯示在5%的CCl4染毒下,小鼠肝臟中Nrf2、Keap-1、HO-1、NQO-1 等基因表達(dá)顯著下調(diào),SCCL 干預(yù)組Nrf2、Keap1、HO-1、NQO-1 等基因表達(dá)顯著上調(diào),機(jī)體SOD、GSH-Px 等抗氧化酶活力顯著提高,提示SCCL 可促進(jìn)Nrf2 解偶聯(lián)入核,顯著提高機(jī)體解毒能力,增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力,這與左瑋等[23]的結(jié)果基本一致??傊?,本研究提示SCCL 保護(hù)肝臟的機(jī)制可能是其所含有的多糖[24]、EPA[25]等物質(zhì)協(xié)同作用促進(jìn)Nrf2 入核,增強(qiáng)肝組織中HO-1、NQO-1 表達(dá),從而抵抗氧化應(yīng)激引起的損傷。

        4 結(jié)論

        本研究表明SCCL 能夠增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力,減少肝細(xì)胞氧化損傷,從而預(yù)防CCl4導(dǎo)致的急性肝損傷;進(jìn)一步證實(shí)了SCCL 是通過Nrf2-Keap1-ARE 信號(hào)通路來發(fā)揮保肝護(hù)肝的作用。

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