蔡維震，張?zhí)祢U，王慶慧，丁 寧，胡 煒，王靜鳳*

（1 中國海洋大學(xué) 山東青島 266000 2 青島墨爾文中學(xué) 山東青島 266000 3 山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司 山東威海 264200）

肝臟是機(jī)體最重要的解毒代謝器官之一，在蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類等物質(zhì)的代謝中起著重要作用，被稱為“物質(zhì)代謝的中樞”。數(shù)據(jù)估計(jì)，中國超過五分之一的人群受到肝臟疾病的困擾，使得肝病成為我國發(fā)病率和死亡率的主要影響因素之一[1]。急性肝損傷與多種肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)；急性肝損傷引發(fā)的肝功能衰竭病死率占肝病患者的60%～80%[2]，嚴(yán)重危害人類健康。臨床藥物甘草酸制劑、水飛薊素等在治療肝臟疾病的同時(shí)，伴有水腫、嘔吐、腹瀉等一定副作用。迫切需要尋找一種具有保肝、護(hù)肝且無毒副作用的活性物質(zhì)。

海參蒸煮液 （Sea cucumber cooking liquid，SCCL）是海參蒸煮滅酶過程中產(chǎn)生的大量墨綠色液體。前期研究發(fā)現(xiàn)，海參蒸煮液中含有大量的多糖、多肽、脂質(zhì)和皂苷類等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化，抗腫瘤，降血糖等功效。海參蒸煮液中多糖和可溶性蛋白含量分別為0.546，0.535 g/L[3]。若直接將液體倒掉，則會(huì)造成環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。有研究指出每噸海參蒸煮液可提取海參活性成分12 kg 左右，價(jià)值高達(dá)20 多萬元；全國每年排放的海參蒸煮液的經(jīng)濟(jì)價(jià)值估計(jì)在100 億元以上[4]。翟二林等[5]發(fā)現(xiàn)海參蒸煮液中皂苷可以顯著抑制S180 皮下腫瘤的生長，表現(xiàn)出良好的免疫活性。李超峰[6]研究表明海參蒸煮液中酸性黏多糖能夠顯著抑制HeLa 細(xì)胞增殖。然而，目前尚未見海參蒸煮液在保肝、護(hù)肝方面的研究報(bào)道。本研究為實(shí)現(xiàn)海參蒸煮液的高值化利用，通過經(jīng)典的CCl4急性肝損傷小鼠模型，探究SCCL 對(duì)肝損傷小鼠的預(yù)防保護(hù)作用，為保肝、護(hù)肝食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及原料 海參蒸煮液干粉，山東好當(dāng)家海洋發(fā)展股份有限公司。4～5 周齡雄性ICR小鼠，SPF 級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK （魯）20190003。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（23±1）℃，濕度為40%～50%，12 h 光/12 h 暗節(jié)律交替。

1.1.2 試劑與藥品 水飛薊賓膠囊，天津天士力圣特制藥有限公司；金龍魚玉米油，益海嘉里食品營銷有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、谷胱甘肽（GSH）、8-異前列腺素 （8-iso-PG）、蛋白質(zhì)羰基試劑盒（PCO），南京建成生物工程研究所；M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，美國Promega 公司；引物，上海生工生物工程有限公司；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純級(jí)。

1.1.3 儀器與設(shè)備 GL-20M 型高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器公司；680 型酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad 公司；Light Cycler480 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （Polymerase chain reaction，PCR）儀，瑞士Roche 公司；Mili-Q Synthesis 超純水系統(tǒng)，美國Milipore 公司；馬弗爐，鄭州儀器設(shè)備有限公司；凱氏定氮儀，德國福斯公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型建立 雄性ICR 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5 d，隨機(jī)分5 組，分別為：正常組、模型組、陽性藥組（水飛薊素30 mg/kg）、SCCL 低劑量組（50 mg/kg）、SCCL 高劑量組（200 mg/kg），每組6只。預(yù)灌胃15 d，末次灌胃2 h 后，正常組腹腔注射花生油，其余各組腹腔注射體積分?jǐn)?shù)5%的CCl4玉米油溶液建立急性肝損傷模型，注射劑量為10 mL/kg·bw；禁食不禁水20 h 后，麻醉摘眼球取血、脫頸椎處死小鼠。血清分離后-20 ℃冰箱保存，用于生化指標(biāo)測(cè)定；肝臟摘取后拍照，部分肝臟固定，部分肝臟保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 血清AST、ALT 等生化指標(biāo)測(cè)定 血清ALT、AST 等使用普通試劑盒按相應(yīng)試劑盒說明書測(cè)定。

1.2.3 肝臟SOD、MDA、GSH-Px、GSH 等生化指標(biāo)測(cè)定 使用生理鹽水制備質(zhì)量濃度為0.1 g/mL的肝臟勻漿液，6 000 r/min，4 ℃離心20 min，收集上清液。用普通商品試劑盒測(cè)定SOD、GSH-Px 等活性和MDA 含量，Elisa 試劑盒檢測(cè)8-iso-PG 含量。以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品，肝臟蛋白濃度BCA 試劑盒測(cè)定肝臟蛋白濃度。

1.2.4 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察 肝臟組織使用4%多聚甲醛固定24 h，酒精脫水，石蠟包埋，制備5 μm 切片，蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin，H &E）染色，BH-2 型光學(xué)顯微鏡觀察組織形態(tài)。

1.2.5 qRT-PCR 法檢測(cè)Keap1、Nrf2 等mRNA 的表達(dá) 使用TRIzol 試劑提取肝臟總RNA，NanoDrop-2000 微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度和純度。采用M-MLV 將1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以此為模版進(jìn)行qRT-PCR 反應(yīng)。反應(yīng)總體系25 μL：cDNA 樣品5 μL，各基因?qū)?yīng)引物0.15 μL，DEPC 水7.2 μL，SYBR 熒光染料12.5 μL。反應(yīng)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃沿伸30 s，35 個(gè)循環(huán)。以βactin 為內(nèi)參，采用目的基因與內(nèi)參基因比值來表征目的基因相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 目的基因引物序列Table 1 The primer sequence of target genes

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析，并同時(shí)用LSD 法進(jìn)行組間差異比較，以P＜0.05 為顯著性差異，P＜0.01 為極顯著差異；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（xˉ±s）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCCL 基本成分分析

經(jīng)過實(shí)驗(yàn)測(cè)得SCCL 中含有較多的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為38.01%，35.34%；其次為糖類和灰分，分別為11.36%，10.17%。

2.2 SCCL 對(duì)急性肝損傷小鼠血清AST、ALT 酶活力的改善作用

血清AST、ALT 活性反映了肝臟損傷程度，為臨床上判斷肝臟損傷的重要手段[7]。如圖1所示，相較于正常組，模型組小鼠血清AST、ALT 酶活力極顯著升高 （P＜0.01），SCCL-H 組血清ALT、AST活力相較于模型組分別降低了40.96%和41.09%（P＜0.01），并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系（ALT 酶活力）。上述結(jié)果說明，SCCL 可以在一定程度上減小肝細(xì)胞損傷，降低轉(zhuǎn)氨酶的釋放。

圖1 SCCL 對(duì)血清ALT、AST 酶活性的影響Fig.1 Effect of SCCL on serum ALT，AST levels inacute liver injury mice

2.3 SCCL 對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的改善作用

由圖2肝組織HE 染色（200 倍）可知，正常組肝細(xì)胞排列致密，肝索以肝門靜脈為中心，呈放射狀排列，細(xì)胞核正常無固縮現(xiàn)象。模型組肝細(xì)胞以肝門靜脈為中心出現(xiàn)大面積壞死現(xiàn)象，肝細(xì)胞邊界喪失，肝索斷裂，核固縮嚴(yán)重，細(xì)胞質(zhì)大量流失；SCCL-H 組肝細(xì)胞損傷明顯減輕，無大面積壞死現(xiàn)象（P＜0.01），肝索排列整齊，SCCL-L 組肝組織形態(tài)與模型組相比有一定程度改善，而與SCCLH 組相比效果稍差。氧化應(yīng)激與肝臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)，DNA 的氧化損傷可能為肝病的共同發(fā)病機(jī)制[8]。8-羥基脫氧鳥苷（8-OH dG）為DNA 氧化損傷的標(biāo)志產(chǎn)物，在肝臟的積累量可反映出肝細(xì)胞DNA 氧化損傷的程度。由圖3肝組織8-OH dG 免疫組化染色（200 倍）可知，模型組較正常組陽性表達(dá)顯著增加（P＜0.01），SCCL 干預(yù)組較模型組陽性表達(dá)面積顯著減少（P＜0.01）；提示SCCL 可顯著減少DNA 的氧化損傷。

圖2 SCCL 對(duì)肝細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)的影響Fig.2 Effect of SCCL on hepatocyte histomorphology in acute liver injury mice

圖3 SCCL 對(duì)DNA 氧化產(chǎn)物8-OH dG 表達(dá)的影響Fig.3 Effect of SCCL on the expression of 8-OH dG，the product of DNA oxidative in acute liver injury mice

2.4 SCCL 對(duì)急性肝損傷小鼠血清、肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的改善作用

MDA、8-異前列腺素，蛋白質(zhì)羰基分別為脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過氧化產(chǎn)物，肝臟、血清中過氧化產(chǎn)物的積累量可以反映機(jī)體抗氧化的能力[9]。如圖4所示，模型組的MDA、8-iso-PG、PCO 含量較正常組極顯著升高（P＜0.01），說明CCl4進(jìn)入機(jī)體后會(huì)引起多種生物大分子物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致機(jī)體組織、器官損傷。SCCL 預(yù)防后，血清、肝臟MDA、8-iso-PG、PCO 含量相較于模型組均極顯著下降（P＜0.01）；結(jié)果提示SCCL 干預(yù)可改善氧化產(chǎn)物在體內(nèi)的累積。

圖4 SCCL 對(duì)血清、肝臟氧化產(chǎn)物含量的影響Fig.4 Effect of SCCL on serum and liver oxidation products in mice with liver injury induced by CCl4

抗氧化酶是清除機(jī)體自由基的重要物質(zhì)，它能對(duì)自由基誘發(fā)的氧化反應(yīng)起保護(hù)作用[10]。由圖5可以得出，模型組血清、肝臟中SOD、GSH-Px、GSH 含量較正常組極顯著降低（P＜0.01），SCCL 組血清、肝臟中其含量相較于模型組都有不同程度的升高（P＜0.01）；提示SCCL 可提高機(jī)體抗氧化物的酶活力，增強(qiáng)機(jī)體清除自由基的能力，減小CCl4對(duì)機(jī)體造成的氧化損傷。

圖5 SCCL 對(duì)血清、肝臟抗氧化物酶、底物含量的影響Fig.5 Effect of SCCL on the content of serum，liver antioxidant enzymes and substrates in acute liver injury mice

2.5 SCCL 對(duì)急性肝損傷小鼠肝臟Nrf2 通路相關(guān)基因表達(dá)的影響

Nrf2 是細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的轉(zhuǎn)錄因子，在活性氧的刺激下進(jìn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件相互作用，并誘導(dǎo)下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)，起到保護(hù)細(xì)胞的作用[11]。SCCL 對(duì)肝臟Nrf2、HO-1 mRNA 表達(dá)影響如圖6所示。與正常組相比，模型組Nrf2、Keap-1 mRNA 表達(dá)極顯著降低（P＜0.01）。SCCL-H 組Nrf2、Keap-1 mRNA 表達(dá)較模型組分別上升了255%和222%（P＜0.01）。HO-1、NQO-1 為重要的Ⅱ相解毒酶，模型組其mRNA表達(dá)較正常組極顯著下降 （P＜0.01）；SCCL 干預(yù)后，HO-1、NQO-1 mRNA 表達(dá)較模型組顯著增加了90%和85%（P＜0.01）。說明SCCL 能通過激活Nrf-2/HO-1 通路改善CCl4誘導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激。

圖6 SCCL 對(duì)肝臟Nrf2 通路相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.6 Effect of SCCL on the expression of genes related to liver Nrf2 pathway in acute liver injury mice

3 討論

急性肝損傷是大量肝細(xì)胞在較短時(shí)間內(nèi)受到外界因素影響而引起的肝臟急性炎癥性疾病，包括各種急性病毒性肝炎、急性缺血性肝損傷及急性毒性肝損傷。CCl4誘導(dǎo)的肝臟急性損傷是經(jīng)典的急性肝損傷模型，經(jīng)常被用來模擬急性病毒性肝炎、急性毒性肝損傷等疾病[12]。CCl4誘導(dǎo)肝臟損傷的機(jī)制目前公認(rèn)為：在細(xì)胞色素P450 作用下，CCl4會(huì)被代謝產(chǎn)生CCl3·和CCl3OO·引發(fā)鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜的脂質(zhì)過氧化，造成膜結(jié)構(gòu)和功能失常；并且氧自由基還與肝臟蛋白、DNA 等結(jié)合造成后者功能喪失，最終導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷、壞死[13]。

AST 和ALT 主要分布在心肌、肝臟、腎臟等組織中，正常血清中含量較低；然而當(dāng)肝細(xì)胞受到損傷時(shí)，細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞漿中的AST、ALT 釋放進(jìn)入血液，其含量會(huì)在血液中顯著增加；血清中AST 和ALT 的濃度可直接反映肝臟功能狀態(tài)和肝損傷程度[14-15]。在本研究中，SCCL 干預(yù)后明顯降低了血清中AST、ALT 的活性，這可能與SCCL 中含有部分多糖有關(guān)。滕來賓[16]研究發(fā)現(xiàn)，海參巖藻聚糖硫酸酯可以減輕酒精性肝損傷小鼠模型中血清AST、ALT 水平，改善小鼠肝臟損傷，與本研究結(jié)果一致。

研究證明，氧自由基對(duì)生物膜脂質(zhì)的過氧化作用是引起肝細(xì)胞病理損傷的原因之一。CCl4公認(rèn)的致肝損傷機(jī)制是由于其生成的自由基以及誘導(dǎo)產(chǎn)生的過氧化反應(yīng)導(dǎo)致。CCl4經(jīng)酶代謝產(chǎn)生的自由基可以與細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜的磷脂分子結(jié)合，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA、8-iso-PG 等[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，SCCL 顯著降低了血清和肝臟中兩者的累積；與此同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的過氧化產(chǎn)物PCO 含量在SCCL 組顯著降低，PCO 形成是多種氨基酸在蛋白質(zhì)的氧化修飾過程中的早期標(biāo)志，其含量反應(yīng)了蛋白質(zhì)損傷程度[9]。SOD、GSH-Px 在機(jī)體抗氧化防御體系中起著重要作用，SOD 可以清除體內(nèi)超氧陰離子，使細(xì)胞內(nèi)氧自由基處于低水平狀態(tài)，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原反應(yīng)平衡；GSH-Px 可以特異性的催化GSH 對(duì)氫過氧化物的還原反應(yīng)，減輕脂質(zhì)過氧化物對(duì)細(xì)胞膜造成的破壞[19-20]。綜上，SCCL 可顯著提高血清和肝臟中SOD、GSH-Px、GSH 水平，降低MDA、8-iso-PG、PCO 等氧化產(chǎn)物的累積；提示SCCL 對(duì)肝臟的預(yù)防作用可能是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的氧化應(yīng)激，來減輕CCl4對(duì)肝臟造成的損傷。

進(jìn)一步，檢測(cè)了SCCL 對(duì)肝臟Nrf2/HO-1 通路的影響，Nrf2/HO-1 通路是機(jī)體保護(hù)正常細(xì)胞抵抗氧化應(yīng)激，以及外源性損傷的抗氧化信號(hào)通路[21]。當(dāng)肝細(xì)胞受到CCl4刺激后，Nrf2 磷酸化入核，與核內(nèi)的抗氧化元件ARE 的DNA 序列結(jié)合，啟動(dòng)ARE 調(diào)控的下游Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶基因的表達(dá)，從而抵抗氧化應(yīng)激引起的損傷。周金鑫等[22]研究發(fā)現(xiàn)高濃度的CCl4處理會(huì)導(dǎo)致大量肝細(xì)胞壞死及毒物的侵襲，導(dǎo)致Nrf2 及其下游抗氧化酶基因的表達(dá)能力明顯減弱。本研究結(jié)果顯示在5%的CCl4染毒下，小鼠肝臟中Nrf2、Keap-1、HO-1、NQO-1 等基因表達(dá)顯著下調(diào)，SCCL 干預(yù)組Nrf2、Keap1、HO-1、NQO-1 等基因表達(dá)顯著上調(diào)，機(jī)體SOD、GSH-Px 等抗氧化酶活力顯著提高，提示SCCL 可促進(jìn)Nrf2 解偶聯(lián)入核，顯著提高機(jī)體解毒能力，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，這與左瑋等[23]的結(jié)果基本一致?？傊?，本研究提示SCCL 保護(hù)肝臟的機(jī)制可能是其所含有的多糖[24]、EPA[25]等物質(zhì)協(xié)同作用促進(jìn)Nrf2 入核，增強(qiáng)肝組織中HO-1、NQO-1 表達(dá)，從而抵抗氧化應(yīng)激引起的損傷。

4 結(jié)論

本研究表明SCCL 能夠增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減少肝細(xì)胞氧化損傷，從而預(yù)防CCl4導(dǎo)致的急性肝損傷；進(jìn)一步證實(shí)了SCCL 是通過Nrf2-Keap1-ARE 信號(hào)通路來發(fā)揮保肝護(hù)肝的作用。