宋晶晶，趙 昊，王偉雄，張海軍，楊華峰，武 運(yùn)*

（1 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院 烏魯木齊 830052 2 喀什大學(xué)生命與地理科學(xué)學(xué)院 新疆喀什 844000 3 吐魯番樓蘭酒莊股份有限公司 新疆吐魯番 838201 4 新疆鄉(xiāng)都酒業(yè)有限公司 新疆巴音郭勒蒙古自治州 841000）

枸杞（Lycium barbarum L.）又名枸杞子，是一種藥食同源植物，主要種植于我國寧夏、新疆等地[1-2]。枸杞中含有枸杞多糖、多酚、類胡蘿卜素、黃酮、氨基酸、甜菜堿等多種活性成分和微量元素，具有免疫調(diào)節(jié)，抗氧化，抗疲勞，降血糖，降血脂等功效[3-5]。甘草（Glycyrrhizae radix et rhizoma）為豆科植物甘草的干燥根和莖[6]，也是一種藥食同源植物，甘草包括三萜類、黃酮類、多糖類和生物堿類等主要化學(xué)成分[7]，具有抗炎，抗氧化，抗腫瘤，保肝等作用[8]，其提取物在食品和醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9]。葡萄（Vitis vinifera L.）富含多種營(yíng)養(yǎng)成分和微量元素，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌和保護(hù)心血管等功效[10-12]。

近年來，隨著我國經(jīng)濟(jì)呈跨越式發(fā)展的趨勢(shì)，人們面臨的機(jī)會(huì)和挑戰(zhàn)日趨增多，生活節(jié)奏加快，工作壓力增大，使得人們普遍處于免疫力低下，易疲勞等亞健康狀態(tài)[13]。人們的健康保健意識(shí)也逐漸增強(qiáng)，對(duì)養(yǎng)生較為關(guān)注，同時(shí)，飲食方式也發(fā)生了巨大改變，一些具有保健功能的食品興起，保健酒也應(yīng)運(yùn)而生，并占據(jù)了一定的市場(chǎng)[14]。枸杞甘草配制酒的開發(fā)符合國內(nèi)外酒類向營(yíng)養(yǎng)、保健方向發(fā)展的趨勢(shì)，同時(shí)對(duì)免疫力低下人群的免疫功能起到調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞甘草配制酒：實(shí)驗(yàn)室自制。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)昆明小鼠，雄性，平均體重（20±2）g，120 只，新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2020003）。

試劑：環(huán)磷酰胺，北京酷來搏科技有限公司；印度墨汁，廣東洛孚生物科技有限公司；0.01 mol/L、pH 7.4 PBS；DEPC 水、氯仿、75%乙醇，北京陸橋技術(shù)有限公司；小鼠免疫球蛋白（IgG、IgM）酶聯(lián)免疫吸附 （Enzyme-linked immunosorbent assay，Elisa）試劑盒、IFN-γ、IFN-α、IL-1α 試劑盒，美國GBD 公司；其余試劑均為分析純級(jí)；GSH-Px、SOD、MDA 檢測(cè)試劑盒，南京建成生物工程研究所；其余試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

xMark 酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD 公司；HR40-A2 型生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；CP21GⅡ高速冷凍離心機(jī)，日立公司；Premium U410 超低溫冰箱，美國NBS 公司；VORTEX-5 型漩渦混合器，華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；FA2004N型分析天平，上海舜宇恒平實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS 型立式高壓滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；FE20 PLUS 型pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞甘草配制酒的制備

1.3.1.1 葡萄蒸餾酒的制備 釀酒葡萄分選后，清洗、除梗、壓榨取汁，分別添加0.02 g/L 果膠酶、0.05 g/L 的偏重亞硫酸鉀、0.2 g/L 釀酒酵母進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后的葡萄酒采用夏朗德壺式蒸餾法進(jìn)行蒸餾。蒸餾時(shí)采用二次蒸餾工藝，蒸餾酒酒精度為52%vol。

1.3.1.2 枸杞甘草發(fā)酵液的制備 保溫浸提：將枸杞甘草盛于容器中并加入一定量的蒸餾水，同時(shí)加入0.40%D-異抗壞血酸鈉和果膠酶，靜置；放入60 ℃恒溫水浴鍋中浸提2 h 后，置于超聲器（超聲頻率180 W）中浸提15 min；過濾，加入一定量蒸餾水進(jìn)行二次浸提，重復(fù)上述浸提步驟。

濃縮：將2 次浸提液合并濃縮為原浸提液體積的1/2 倍，加入殘?jiān)|(zhì)，備用。

成分調(diào)整：向枸杞甘草浸提液中加入75 g/L蔗糖。

發(fā)酵：0.2 g/L 酵母菌和0.4 g/L 乳酸菌按1∶2進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵，接入浸提液在26 ℃培養(yǎng)箱中下發(fā)酵7 d。

過濾、殺菌：發(fā)酵結(jié)束后，4 ℃條件下，4 000 r/min 離心10 min，取上清液，80 ℃殺菌30 min 得到枸杞甘草發(fā)酵液。

1.3.1.3 枸杞甘草葡萄蒸餾酒的調(diào)配 根據(jù)市場(chǎng)同類產(chǎn)品的接受度，確定產(chǎn)品酒精度在28%vol，同時(shí)為突出藥食同源葡萄蒸餾酒的風(fēng)格與作用，葡萄蒸餾酒和枸杞甘草發(fā)酵液經(jīng)調(diào)配，得到枸杞甘草葡萄蒸餾酒。

1.3.2 免疫低下小鼠模型構(gòu)建 KM 小鼠適應(yīng)環(huán)境1 周后，隨機(jī)分為6 個(gè)組，見表1。根據(jù)《中國居民營(yíng)養(yǎng)與慢性病狀況報(bào)告（2020）》，中國居民男性平均體重69.6 kg 計(jì)算。各組小鼠腹腔注射劑量為80 mg/kg bw 的環(huán)磷酰胺溶液，空白組腹腔注射等劑量的生理鹽水，連續(xù)注射3 d，構(gòu)建環(huán)磷酰胺所致小鼠免疫功能低下模型。根據(jù) 《中國居民膳食指南》 每人每日酒精攝入量≤25 g，枸杞甘草配制酒的人體日推薦量約為≤1.3 mL/kg，因此設(shè)定低、中、高劑量組分別為5，10，20 mL/（kg·d），每日灌胃1 次，連續(xù)14 d。末次灌胃24 h 后，進(jìn)行碳廓清實(shí)驗(yàn)，眼球采血，收集血清，取小鼠胸腺、脾臟等組織，保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

表1 不同實(shí)驗(yàn)組小鼠給藥方案Table 1 Experimental groups and feeding methods

1.3.3 小鼠免疫器官指數(shù)及碳廓清吞噬指數(shù)的測(cè)定 參照Wang 等[15]方法進(jìn)行測(cè)定。胸腺、脾臟指數(shù)、碳廓清速率K 和吞噬指數(shù)α 按照公式（1，2，3，4）計(jì)算。

式中，OD1——t1（2 min） 血樣本的OD 值；OD2——t2（10 min）血樣本的OD 值。

1.3.4 小鼠血清中IgG、IgM 含量測(cè)定 灌胃周期結(jié)束后，運(yùn)用眼眶采血法，將血液盛放于潔凈離心管內(nèi)，以3 000 r/min 離心15 min，收集血清[16]，存放于-20 ℃環(huán)境下保存。按照IgG、IgM 試劑盒說明書方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 小鼠IL-1α、IFN-γ、TNF-α 含量的測(cè)定初始操作步驟同1.3.4 節(jié)，將小鼠血清稀釋后，利用Elisa 試劑盒通過雙抗體夾心法測(cè)定小鼠IL-1α、IFN-γ、TNF-α 含量。

1.3.6 小鼠血清中的GSH-Px、SOD 活力及MDA濃度測(cè)定 末次灌胃2 h 后用眼眶采血法，收集血清，在4 ℃條件下1 500 r/min 離心10 min，取300 μL 血清于離心管中。各組小鼠血清中的GSH-Px、SOD 活力及MDA 濃度嚴(yán)格按照試劑盒說明書方法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）”。采用方差分析和t 檢驗(yàn)來確定其統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.01）。分別使用SPSS 20.0 和Origin 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖形繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量

觀察各組小鼠體質(zhì)量變化情況，并做記錄如表2所示。

表2 小鼠體質(zhì)量變化Table 2 Changes in body mass of mice

由表2可知，3 個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠末期體質(zhì)量有顯著性差異（P<0.01），說明模型構(gòu)建成功。其它各實(shí)驗(yàn)組在同等條件下，組間差異均不顯著，說明枸杞甘草配制酒的3 個(gè)不同劑量組均不影響小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)。

2.2 小鼠免疫器官指數(shù)

由表3可知，模型組脾臟、胸腺指數(shù)及吞噬指數(shù)（α）比空白組降低了2.40、1.56 和1.31 倍（P＜0.01），說明注射環(huán)磷酰胺明顯抑制了胸腺和脾臟的生長(zhǎng)發(fā)育，免疫抑制組小鼠建模成功。與模型組相比，基酒對(duì)照組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)增長(zhǎng)均不顯著；低劑量組的脾臟指數(shù)增長(zhǎng)52.23%（P＜0.01），胸腺指數(shù)增長(zhǎng)不顯著；中劑量組的脾臟指數(shù)增長(zhǎng)84.91%（P＜0.01），胸腺指數(shù)增長(zhǎng)31.11%（P＜0.05）；高劑量組的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)分別增長(zhǎng)52.71%（P＜0.01）和3.72%（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組中低、中、高劑量組比模型組吞噬指數(shù)分別增長(zhǎng)2.6%，15.52%，12.41%。結(jié)果表明，枸杞甘草配制酒能緩解免疫抑制小鼠免疫器官的生長(zhǎng)，初步認(rèn)為該酒具有調(diào)節(jié)免疫功效的作用。

表3 枸杞甘草配制酒小鼠免疫器官指數(shù)及碳廓清吞噬指數(shù)的影響（±s）Table 3 Effects of preparation of grape spirits on immune organ index and carbon profile phagocytic index in mice （±s）

表3 枸杞甘草配制酒小鼠免疫器官指數(shù)及碳廓清吞噬指數(shù)的影響（±s）Table 3 Effects of preparation of grape spirits on immune organ index and carbon profile phagocytic index in mice （±s）

?

2.3 小鼠血清中IgG 及IgM 含量

由表4可知，空白對(duì)照組與模型組有極顯著差異（P<0.01），說明免疫抑制建模成功。分析可知，高、中、低劑量組血清中IgG 含量均顯著高于模型組（P＜0.05），高劑量組與中、低劑量組有顯著差異（P＜0.05），中、低劑量組之間無明顯差異。模型組與枸杞甘草配制酒中劑量組的血清IgG 含量有極顯著差異（P<0.01），說明枸杞甘草配制酒可以有效提高血清中IgG 含量。枸杞甘草配制酒中劑量組血清中IgM 含量顯著高于模型組（P＜0.01），低劑量組血清中IgM 含量與基酒對(duì)照組無明顯差異。同時(shí)，低、中劑量組血清中IgM 含量均顯著高于高劑量組（P＜0.05）。表明中劑量可以有效提高血清中IgM 的含量，而低劑量對(duì)血清中IgM 含量影響不顯著。說明枸杞甘草配制酒的有效劑量能夠不同程度地促進(jìn)免疫抑制小鼠免疫球蛋白的分泌。

表4 枸杞甘草配制酒對(duì)小鼠血清中IgG、IgM 的影響（±s）Table 4 Effect of preparation of grape spirits on serum IgG and IgM of immunosuppressive mice （xˉ±s）

表4 枸杞甘草配制酒對(duì)小鼠血清中IgG、IgM 的影響（±s）Table 4 Effect of preparation of grape spirits on serum IgG and IgM of immunosuppressive mice （xˉ±s）

?

2.4 小鼠血清中IFN-γ、IL-6 和TNF-α 水平的影響

如表5所示，與正常組相比，模型組IL-6、IFN-γ、TNF-α 含量顯著低于正常組52%，49%，75%（P<0.01），說明造模成功。與模型組相比低、中、高劑量組及基酒組IL-6 水平分別升高29%，42%，45%，24%，相比低、中、高劑量組及基酒組IFN-γ 水平分別升高63%，76%，86%，38%，相比低、中、高劑量組及基酒組TNF-α 水平分別升高20%，30%，22%，8%（P<0.05），說明枸杞甘草配制酒能提高免疫抑制小鼠IL-6、IFN-γ 和TNF-α 水平，具有免疫增強(qiáng)功效。

表5 枸杞甘草配制酒對(duì)小鼠血清IL-6、IFN-γ、TNF-α 的影響（±s）Table 5 Effect of preparation of grape spirits on serum IL-6，IFN-γ and TNF-α of immunosuppressive mice （xˉ±s）

表5 枸杞甘草配制酒對(duì)小鼠血清IL-6、IFN-γ、TNF-α 的影響（±s）Table 5 Effect of preparation of grape spirits on serum IL-6，IFN-γ and TNF-α of immunosuppressive mice （xˉ±s）

?

2.5 枸杞甘草配制酒對(duì)小鼠血清GSH-Px、SOD活力及MDA 濃度的影響

表6為枸杞甘草配制酒對(duì)免疫抑制小鼠血清抗氧化指標(biāo)的影響。與空白組相比，模型組小鼠的GSH-Px 和SOD 活性均明顯降低 （P＜0.01），而MDA 含量則升高（P＜0.05）。與模型組相比，枸杞甘草配制酒高、中、低劑量組GSH-Px 和SOD 活力均顯著提高，其中，中劑量組提高明顯。與模型組相比，枸杞甘草配制酒高、中劑量組MDA 濃度均降低，其中，低劑量組沒有顯著影響。表明不同劑量組對(duì)小鼠的抗氧化作用有一定影響。

表6 枸杞甘草配制酒對(duì)小鼠血清GSH-Px、SOD 活力及MDA 濃度的影響Table 6 Effect of preparation of grape spirits on GSH-Px，SOD activity and MDA levels in serum of mice

3 討論

環(huán)磷酰胺是一種有效的抗腫瘤及癌癥化療藥物，長(zhǎng)期服用可能會(huì)使骨髓和免疫受到抑制，進(jìn)而使紅細(xì)胞生成素缺乏導(dǎo)致貧血[17]。因此，在研究過程中，常將Cy 應(yīng)用于構(gòu)建免疫缺陷模型的誘導(dǎo)藥物[18]，能夠阻止免疫細(xì)胞的生成，進(jìn)而抑制漿細(xì)胞產(chǎn)生，導(dǎo)致免疫抑制[19]。在本研究中，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠臟器指數(shù)明顯降低，且與空白對(duì)照組相比，吞噬指數(shù)、免疫球蛋白和血清細(xì)胞因子下降水平有顯著性差異，表明免疫抑制模型構(gòu)建成功[20]。哺乳動(dòng)物重要的2 個(gè)免疫器官，即脾臟和胸腺，免疫器官直接決定機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱，免疫器官指數(shù)反映了免疫器官的發(fā)育及其免疫功能[21]。

哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)由先天免疫和后天免疫組成，其中先天免疫是宿主抵御入侵病原體的第一道防線[22]。巨噬細(xì)胞承擔(dān)著體內(nèi)非特異性免疫功能，能夠吞噬體內(nèi)損傷、異常的細(xì)胞及病原體[23]。巨噬細(xì)胞在先天免疫中起著至關(guān)重要的作用[24]，巨噬細(xì)胞的活化被認(rèn)為是增強(qiáng)宿主免疫功能的一個(gè)重要的免疫途徑[25]。另一方面，巨噬細(xì)胞的活化在某些病理?xiàng)l件下也會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，如癌癥和癌癥自身免疫性疾病[26]。本研究目的是對(duì)枸杞甘草配制酒免疫增強(qiáng)功效的探究，通過碳廓清吞噬實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)巨噬細(xì)胞非特異性免疫功能，在免疫抑制實(shí)驗(yàn)中，觀察枸杞甘草配制酒對(duì)免疫抑制小鼠的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果表明，枸杞甘草配制酒中劑量組（10 mL/kg）與模型組相比，能使免疫抑制的小鼠脾臟指數(shù)增長(zhǎng)52.71%，胸腺指數(shù)增長(zhǎng)33.72%，吞噬指數(shù)增長(zhǎng)了15.52%，表明免疫功能得到提高。

在巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)中，除了可以促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖，還可以刺激分泌IL-6、IFN-γ 和TNF-α，IL-6 主要通過促進(jìn)B 細(xì)胞增殖和免疫球蛋白的產(chǎn)生來介導(dǎo)體液免疫[27]。由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的腫瘤壞死因子稱為TNF-α，能夠誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程中的其它因子和介質(zhì)的產(chǎn)生[28]，TNF-α 可以促進(jìn)T 細(xì)胞及其它殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，并且可以促進(jìn) B 細(xì)胞的增殖，而過量的TNF-α 分泌可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體局部的炎癥反應(yīng)[13]。IFN-γ 能使巨噬細(xì)胞表面受體數(shù)量增加，NK 細(xì)胞大量生長(zhǎng)繁殖，具有抑制癌細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)免疫功能等作用[29]。

抗氧化酶作為最有作用的防御措施之一，避免不利的氧化應(yīng)激反應(yīng)，能與活性氧的主要酶中和，其中有SOD、GSH-Px 和過氧化氫酶。MDA 是由脂質(zhì)過氧化作用分解所產(chǎn)生的，其濃度能夠反映細(xì)胞膜受損程度[30]。結(jié)果表明，中劑量枸杞甘草配制酒能克服CY 誘導(dǎo)的免疫抑制，巨噬細(xì)胞功能、免疫球蛋白和細(xì)胞因子水平均有改善。發(fā)現(xiàn)枸杞甘草配制酒中劑量組的3 種細(xì)胞因子水平與模型組有顯著差別，枸杞甘草配制酒能促進(jìn)某些細(xì)胞因子的分泌，從而減輕免疫抑制程度，而且能顯著提高KM 小鼠血清中SOD、GSH-Px 活力，并顯著降低血清中MDA 濃度，說明甘草枸杞配制酒對(duì)免疫調(diào)節(jié)作用的影響可能與其抗氧化活性有關(guān)。

綜上，枸杞甘草配制酒對(duì)免疫抑制小鼠起到免疫調(diào)節(jié)的作用，進(jìn)一步推斷其能夠增強(qiáng)人體免疫功能，提高人們的健康水平。本研究結(jié)合枸杞甘草配制酒免疫及抗氧化功能，為開發(fā)枸杞甘草配制酒作為保健酒，增補(bǔ)配制酒市場(chǎng)空白，提供理論依據(jù)。由于其免疫活性與飲用量不呈線性關(guān)系，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。