楊帆帆， 鐘旺景， 馬玲娣△

(1.廣州醫(yī)科大學，廣州 511436；2.惠州市第三人民醫(yī)院，廣東 惠州 516000)

白血病是起源于骨髓造血干/祖細胞惡性變的一組高度異質性疾病，是十大高發(fā)惡性腫瘤之一，兒童和35歲以下的人群占比最高[1]，其特征是白血病細胞在骨髓和其他組織中惡性增殖，伴分化成熟障礙和凋亡受抑，并廣泛浸潤全身組織器官。臨床上出現(xiàn)貧血、出血、發(fā)熱、免疫低下、骨痛及肝脾、淋巴結腫大等癥狀[2]。目前臨床治療白血病主要以造血干細胞移植和化療為主，但移植存在配型困難，需長期服用免疫抑制劑，化療藥毒副作用大，部分患者出現(xiàn)耐藥性，甚至出現(xiàn)腫瘤細胞轉移或侵襲其他組織器官，導致病情反復發(fā)作和惡化，使白血病病人的現(xiàn)狀并不樂觀，因此開發(fā)新的白血病藥物和發(fā)現(xiàn)藥物作用靶點對臨床白血病的治療至關重要。

苦參堿(見圖1)是在豆科植物如苦參、苦豆子中提取的一種四環(huán)喹諾里西啶類的生物堿成分，化學式為C12H24N2O[3]。苦參堿有4種形態(tài)，其中最為常見的為α型，又稱α-苦參堿，結晶形狀為針晶或棱晶，熔點為76 ℃；β型為單斜棱形結晶，熔點為87 ℃；γ型是液體，沸點為223 ℃/6 mmHg；δ型為棱晶，熔點為84 ℃，可溶于水、苯、氯仿、乙醚或二硫化碳，微溶于石油醚[4]?，F(xiàn)代科學研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有抗炎[5]、抗病毒[6]、抗過敏[7]、抗纖維化[8]、抗氧化[9，10]、抗腫瘤[11]等多種作用?？鄥A的抗白血病作用一直是學者關注的熱點話題。本文從苦參堿抑制白血病細胞增殖、誘導白血病細胞凋亡、抑制白血病細胞轉移侵襲、促進白血病細胞分化、增強免疫細胞功能、影響自噬發(fā)生和逆轉白血病細胞的多藥耐藥等方面，對苦參堿抗白血病的藥理作用及分子機制進行研究總結，為苦參堿的臨床應用提供有益啟示和醫(yī)學參考。

圖1 苦參堿的結構示意圖

1 苦參堿抑制白血病細胞增殖

原癌基因和抑癌基因的表達失調導致白血病細胞異常增殖，而細胞增殖嚴格受控于細胞周期。近年來多項研究表明，苦參堿主要通過阻滯細胞G1/S期進程抑制多種白血病細胞系的增殖。王健等[12]研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的苦參堿(0.2 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL)處理白血病細胞不同時間(24 h、48 h、72 h)，苦參堿以濃度-時間依賴的方式抑制白血病細胞增殖。張莉萍等[13]研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mg/mL的苦參堿作用于慢性髓系白血病K562細胞株24 h、48 h、72 h后，細胞周期蛋白(Cyclin)E、細胞周期素依賴蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDK)2、CDK5的蛋白表達水平均提升，G1/S期進程阻滯，細胞增殖率降低。白煜等[14]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL和0.8 mg/mL的苦參堿處理人原代白血病細胞48 h后，G0/G1期細胞比例增多，提示苦參堿抑制細胞周期進程。Asl等[15]研究發(fā)現(xiàn)，2.5 mg/mL的苦參堿可通過上調細胞周期抑制因子P21蛋白，miRNA-17、miRNA-20和miRNA-93的表達，阻滯G0/G1、G1/S期的進程，抑制細胞增殖。Ma等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在白血病細胞中，0.8 mg/mL的苦參堿通過抑制BCR/ABL融合基因介導的胞外調節(jié)蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase/mitogen-activated protein kinase，ERK/MAPK)通路，下調cyclinD1、c-Myc、凋亡抑制基因Bcl-xl、磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，并上調細胞周期抑制因子P27的蛋白水平，從而抑制白血病細胞的增殖。Ma等[17]還發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL的苦參堿下調磷酸化的信號傳導與激活轉錄因子(Phosphorylation signal transducer and activator of transcription，p-STAT)3和磷酸化的蛋白酪氨酸激酶(Phosphorylation janus kinase，p-JAK)2，顯著抑制STAT3的上游激活因子白細胞介素(Interleukin6，IL)6的表達，提示IL-6/JAK/STAT3/通路介導了苦參堿的抗白血病作用。Lin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL的苦參堿通過c-Myc調控己糖激酶(hexokinase，HK)2的表達抑制糖酵解，進而抑制白血病細胞增殖。綜上所述，苦參堿可通過調控細胞周期蛋白cyclinD/E、CDK2/5和細胞周期抑制因子P21、P27的表達，調節(jié)ERK/MAPK通路、IL-6/JAK/STAT3等信號通路，抑制白血病細胞的增殖。

2 苦參堿誘導白血病細胞的凋亡

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞的凋亡密切相關，腫瘤的十大特征之一就是抵抗細胞凋亡[19]。多項研究證實，苦參堿可以誘導白血病細胞的凋亡。李瑞等[20]研究發(fā)現(xiàn)，0.25 mg/mL、0.5 mg/mL 和 1.0 mg/mL的苦參堿作用于急性早幼粒白血病細胞株NB4時，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-containing aspartate-specific proteases，caspase)3和caspase 8活性增強，提示苦參堿通過caspase途徑促進細胞凋亡。Hao等[21]研究發(fā)現(xiàn)，0.4 g/L、0.8 g/L、1.2 g/L、1.6 g/L和2.0 g/L苦參堿可以降低白血病細胞中磷酸化的磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylation phosphoinositide 3-kinase，p-PI3K)，磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylation protein kinase，p-Akt)B，磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶點(phosphorylation mammalian target of rapamycin，p-mTOR)的蛋白水平，證實苦參堿通過PI3K/Akt/mTOR信號通路誘導急性髓系白血病細胞凋亡。Marjan等[22]研究發(fā)現(xiàn)，1.68 mg/mL、3.4 mg/mL和6.75 mg/mL的苦參堿作用于白血病細胞60 min，線粒體膜電位降低、線粒體通透性增加、細胞色素C釋放增加、活性氧產生增加、線粒體腫脹，提示苦參堿通過線粒體途徑誘導急性B淋巴細胞白血病凋亡。因此，苦參堿可能通過上調促凋亡蛋白和下調抗凋亡蛋白的表達，抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路和線粒體功能等方式誘導細胞凋亡。

3 苦參堿抑制白血病細胞的轉移和侵襲

侵襲和轉移是惡性腫瘤的生物學特征，腫瘤發(fā)生侵襲轉移是大多數患者死亡的原因。晁榮等[23]研究發(fā)現(xiàn)，1.0 g/L的苦參堿下調急髓白血病M3型HL-60細胞的基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)2和MMP9的mRNA水平，從而抑制HL-60細胞的黏附力、運動力和侵襲力，與3 μM的三氧化二砷聯(lián)合使用后抑制效果更佳，與張偉等[24]的研究一致。張偉等[25]還發(fā)現(xiàn)，在急性淋巴細胞白血病細胞株Jurkat中，0.1 g/L、0.15 g/L和0.2 g/L苦參堿也能明顯下調細胞中MMP-9的mRNA水平，顯著降低Jurkat細胞的侵襲和黏附能力。聶應明等[26]研究發(fā)現(xiàn)，白血病細胞在低氧(3%或5%O2)環(huán)境下，缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-α, HIF-1α)和血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達上調促進血管生成，進而提高細胞的侵襲和轉移能力。林淑儀等[27]研究發(fā)現(xiàn)，0.2 g/L和0.5 g/L的苦參堿通過下調HIF-1α、VEGF mRNA的表達，有效抑制低氧環(huán)境下K562細胞的黏附、侵襲和轉移能力。以上結果顯示，苦參堿能有效抑制白血病細胞的黏附、侵襲和轉移能力，并通過下調MMPs 、HIF-1α和VEGF等的表達。

4 苦參堿促進白血病細胞的分化

白血病細胞的主要特征之一是血液細胞分化成熟障礙，由于全反式維甲酸誘導白血病細胞分化，成功治療急性早幼粒細胞白血病，使藥物誘導分化治療血液腫瘤成為科學研究的熱點之一。胞質型磷脂酶(cytosolic phospholipase, cPL)A2具有降解磷脂膜的作用，其活性增加是誘導細胞分化的一個重要因素。劉北忠等[28]研究發(fā)現(xiàn)，200 μg/ml苦參堿處理K562細胞可以顯著增強cPLA2活性，從而促進K562細胞的分化。朱付云等[29]研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mM的苦參堿聯(lián)合1 μM的全反式維甲酸作用全反式維甲酸耐藥的急性早幼粒白血病NB4-R1細胞，可抑制DNA拓撲異構酶(topoisomerase，TOPO)Ⅱβ的蛋白表達，使細胞核質比減小，細胞表面分化抗原(cluster of differentiation, CD)11b升高，從而誘導NB4-R1細胞分化。王健等[12]研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿處理K562細胞后，聯(lián)苯胺染色法發(fā)現(xiàn)細胞向紅系方向分化，以0.05 mg/mL苦參堿作用效果最明顯。羅文紀等[30]研究發(fā)現(xiàn)，12.5 μg/mL、25 μg/mL和50 μg/mL的苦參堿作用于HL-60細胞72 h，可促進CD11b、CD15的升高，以25 μg/mL苦參堿作用效果最明顯，苦參堿處理細胞后細胞體積變小，核質比減小，核扭曲呈腎形，核染色質濃集增粗，核仁消失，提示細胞向粒系分化，與李玉紅等[31]的研究一致。與之不同的是，徐建國等[32]研究發(fā)現(xiàn)8 mg/ml苦參煎液可使HL-60細胞向單核巨噬細胞分化。以上研究表明，苦參堿可能通過調節(jié)cPLA2活性、TOPOⅡβ和細胞表面分化抗原CD11b、CD15的表達等方式誘導白血病細胞分化。

5 苦參堿增強免疫細胞對白血病細胞的殺傷能力

免疫系統(tǒng)是人體的天然屏障，免疫細胞是構成免疫系統(tǒng)的重要因素，尤其是對于腫瘤患者來說，免疫細胞的激活可以殺傷腫瘤細胞，因此通過免疫系統(tǒng)殺傷腫瘤細胞是治療腫瘤患者的重要途徑。Lu等[33]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL的苦參堿抑制K562細胞中IL-6的表達，從而抑制JAK/STAT3通路，上調UL16結合蛋白(UL16 binding protein，ULBP)2的表達，激活自然殺傷細胞(natural Killer cell，NK)對白血病細胞的殺傷作用。Zhang L等[34]研究發(fā)現(xiàn)，0.5 mg/mL的苦參堿可上調急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)細胞系和原代白血病細胞中NK細胞活化型受體(natural killer group 2 member D，NKG2D)以及其配體家族(ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表達水平，并抑制CD158、促炎癥細胞因子和黏附分子IL-1α、IL-5、IL-6、IL-10、干擾素(interferon，IFN)-γ和腫瘤壞因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的分泌和表達，同時降低炎癥介質巨噬細胞炎性蛋白(macrophage inflammatory protein，MIP)1a、MIP1b、MMP-9、趨化因子(RANTES)的表達水平，從而調節(jié)NK細胞的免疫活性。結合上述研究，苦參堿通過調節(jié)NK細胞表面配體蛋白、炎癥因子和黏附分子的表達，增強其對腫瘤細胞的殺傷力。

6 苦參堿對白血病細胞自噬的影響

自噬是機體在饑餓、刺激等惡劣環(huán)境下，維持機體正常功能的一種自我保護機制，它對細胞的存活和代謝起著至關重要的作用。研究表明，苦參堿可以調節(jié)白血病細胞的自噬過程。Wu等[35]研究發(fā)現(xiàn)，1.5 g/L的苦參堿處理白血病細胞，可誘導caspase依賴的細胞死亡，促進Akt/mTOR信號通路的磷酸化，從而促進細胞自噬的發(fā)生。胡美薇等[36]研究發(fā)現(xiàn)，0.4 mg/mL的苦參堿聯(lián)合0.5 μM的伊馬替尼處理K562細胞和伊馬替尼耐藥細胞株K562/IM，自噬相關蛋白微管相關蛋白Ⅱ輕鏈3/自噬相關蛋白微管相關蛋白Ⅰ輕鏈3(autophagy-related protein microtubule-related protein Ⅱ light chain 3/autophagy-related protein microtubule-related protein Ⅰ light chain 3, LC3-Ⅱ/LC3Ⅰ)的蛋白比例增高，P62蛋白表達水平降低，自噬相關蛋白(autophagy related protein)Becline-1和剪切形式的caspase-3蛋白表達增加，表明苦參堿促進自噬形成，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可以加強苦參堿對K562/IM細胞誘導的凋亡，自噬誘導劑雷帕霉素抑制苦參堿對K562/IM細胞誘導的凋亡，提示苦參堿誘導的自噬拮抗苦參堿誘導的白血病細胞的凋亡。然而Wang等[37]研究發(fā)現(xiàn),苦參堿可以抑制自噬，當用2 mM的苦參堿處理胃癌細胞SGC7901后，自噬小體增多，進一步研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿降低組織蛋白酶B和組織蛋白酶D的活性，并促進P62的表達，阻礙溶酶體酸化，損壞溶酶體的功能，進而抑制自噬小體的降解，提示苦參堿可作為一種新型的自噬抑制劑發(fā)揮抗腫瘤作用。目前關于苦參堿對自噬的調節(jié)仍存在爭議，針對苦參堿到底是促進還是抑制自噬有待于進一步的研究和探討。

7 苦參堿在逆轉白血病細胞多藥耐藥的作用

近年來，由于白血病化療藥物的更新?lián)Q代，白血病患者病情的緩解率得到顯著提高，但在臨床多數患者出現(xiàn)耐藥性仍是白血病復發(fā)和治療失敗的主要原因。為提升藥物療效，聯(lián)合用藥成為治療白血病的主要策略。Wu等[38]研究發(fā)現(xiàn)，0.1 mM的苦參堿可以提高全反式維甲酸耐藥細胞株NB4-LR1對雷帕霉素治療的敏感性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿通過穩(wěn)定20 S蛋白表達，增強蛋白酶體活性，促進NB4-LR1細胞的泛素化水平，并導致PML RARα融合蛋白的降解。丁艷芳等[39]研究發(fā)現(xiàn)，50 μg/mL苦參堿可誘導阿霉素耐藥細胞株K562/ADM凋亡，并誘導阿霉素耐藥細胞株K562/ADM的凋亡。Chen等[40]研究發(fā)現(xiàn)，300 μmol苦參堿可通過激活caspase-3和caspase-9的表達，抑制核轉錄因子κB(nuclear factorκB,NF-κB)、Bcl-xl、凋亡抑制基因(survivin)、多藥耐藥性蛋白(ATP-Binding Cassette sub-family B member, ABCB)1的活性，從而誘導K562/ADR細胞凋亡。上述結果顯示，苦參堿可以增強雷帕霉素和阿霉素誘導白血病細胞凋亡的敏感性，逆轉其耐藥性。

8 未來前景與存在問題

對苦參堿抗白血病作用機制研究的多篇報道，提示苦參堿在抗白血病藥理學與分子機制研究中具有重要價值。本課題組多年來一直致力于苦參堿抗白血病的作用機制研究，目前已發(fā)現(xiàn)苦參堿可降低白血病細胞IL-6蛋白和轉錄表達水平，抑制JAK/STAT3通路關鍵分子JAK2、STAT3蛋白磷酸化及STAT3調控下游基因Bcl-xL、c-Myc和CyclinD1的表達，下調MEK1和ERK1/2磷酸化抑制BCR/ABL介導的Ras/Raf/ERK/MAPK信號通路，減少c-Myc與HK2基因內含子結合而抑制HK2的表達，上調ULBP2的表達增強NK細胞對K562細胞的殺傷，其抗白血病中發(fā)揮的作用不可忽視?？鄥A抗白血病的作用靶點也是本課題組一直研究的方向。

分析近年來文獻發(fā)現(xiàn)，苦參堿具有多靶點、多環(huán)節(jié)和多效應的特點，可作用于白血病發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)。如阻滯細胞周期進程、抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡、抑制細胞轉移、促進細胞分化、調節(jié)細胞自噬和逆轉白血病多藥耐藥等，其分子機制主要包括上調細胞周期抑制因子P21，促凋亡蛋白、細胞表面分化抗原CD11b和CD15等表達；下調促癌基因c-Myc、HK2、CyclinD1、MMP 、HIF-1α、VEGF和抗凋亡蛋白等表達，調節(jié)ERK/MAPK、PI3K/Akt/mTOR和IL-6/JAK/STAT3等通路，調節(jié)線粒體功能和磷脂酶cPLA2活性，以及調節(jié)相關炎癥因子和黏附分子的表達?？鄥A抗白血病的分子機制復雜多樣，但其最重要的作用靶點尚不明確，仍需進一步的探究。

苦參堿在抗白血病方面具有廣泛的作用，其作為中藥毒副作用小、較少破壞發(fā)育正常細胞，在白血病的治療中具有廣闊的臨床應用前景。目前苦參堿的研究還存在一定的局限性，其發(fā)揮抗白血病的作用主要體現(xiàn)在體外細胞實驗，而在動物實驗和臨床實驗方面的研究還很少；由于苦參堿的特殊結構難以用生物素或熒光基團標記苦參堿進行細胞定位觀察，使得苦參堿最關鍵的作用靶點遲遲未能被發(fā)現(xiàn)。苦參堿半衰期短，作用濃度大，限制了其在臨床的使用。接下來研究者們需在標記苦參堿以及合成新的苦參堿衍生物上做進一步的探索，借助各種組學技術，通過體外和體內實驗相結合，全面闡述苦參堿抗白血病的作用與分子機制。