陳勁海,徐亞麗
(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科,廣東 廣州510260)
鼻咽癌是一種起源于鼻咽黏膜上皮的惡性腫瘤,其全球地理分布極不平衡,80%的鼻咽癌病例都集中在中國(guó)華南地區(qū)和東南亞。大灣區(qū)NPC發(fā)病率高居全球第一,特別是廣東地區(qū)的人患鼻咽癌的概率,是其它低發(fā)病率地區(qū)的20倍。放射治療是非轉(zhuǎn)移性鼻咽癌的主要治療手段[1-2]。但是大約15%~30%的NPC患者在放射治療后出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和/或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,而放療抵抗的存在可能是導(dǎo)致這類患者治療失敗的主要原因,并嚴(yán)重制約了患者的預(yù)后及生存質(zhì)量[3-4]。
腫瘤干細(xì)胞是腫瘤中一群具有干細(xì)胞特性的異質(zhì)細(xì)胞,這些細(xì)胞可以不斷進(jìn)行自我更新和無(wú)限增殖,并且多向分化,促使腫瘤生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移[5]。普遍認(rèn)為CSCs特征的細(xì)胞群比普通腫瘤細(xì)胞具有更明顯的放療抵抗效應(yīng),是造成許多晚期腫瘤患者對(duì)放療耐受和復(fù)發(fā)的重要原因[6]。腫瘤干細(xì)胞學(xué)說(shuō)的提出為我們重新認(rèn)識(shí)腫瘤的起源和本質(zhì)以及臨床腫瘤治療提供了新的方向。仍而,系統(tǒng)應(yīng)用腫瘤干細(xì)胞理論來(lái)指導(dǎo)鼻咽癌的放療增敏,計(jì)算識(shí)別干性相關(guān)基因還未有報(bào)道。因此,本文通過(guò)結(jié)合腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤放療抵抗干性相關(guān)基因和腫瘤特征通路構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),甄別鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)基因和關(guān)鍵的信號(hào)通路,為后期的增敏鼻咽癌放療效果,改善和提高患者生存質(zhì)量及預(yù)后提供了可靠的分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn),具有重要的臨床意義。
在GEO數(shù)據(jù)庫(kù)下載鼻咽癌數(shù)據(jù)集GSE32389。數(shù)據(jù)內(nèi)容主要包括轉(zhuǎn)錄組及對(duì)應(yīng)的輻射信息等臨床數(shù)據(jù),數(shù)據(jù)下載完成后在本地后進(jìn)行統(tǒng)一管理,數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)變換進(jìn)行標(biāo)化操作,共有20例樣本可以可用于下游的數(shù)據(jù)分析。差異表達(dá)基因的篩選條件為調(diào)整P<0.05和|log2FC|>1。
腫瘤干性的數(shù)據(jù)和方法主要參考Tathiane MM[7],該文獻(xiàn)通過(guò)分析人胚胎發(fā)育各階段干性細(xì)胞數(shù)據(jù),采用機(jī)器學(xué)習(xí)模型(單類別的logistic回歸模型)得到了關(guān)于細(xì)胞干性指數(shù)的評(píng)價(jià)指標(biāo)。其具體模型為最小化下述數(shù)學(xué)表達(dá)式為(參考gelnet軟件包技術(shù)文檔):
其中si=wTxi,w為基因干性的權(quán)重系數(shù),gi為基因表達(dá)水平,正則化項(xiàng):
基因的差異表達(dá)采用經(jīng)驗(yàn)貝葉斯模型進(jìn)行分析(limma v3.51.8),后續(xù)通過(guò)下載MSigDB(version 7.0,https:∥www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)提供的基因集數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行基因功能的富集分析(clusterProfiler v 4.3.4),包括GO 聚類和KEGG 信號(hào)通路等,識(shí)別調(diào)控鼻咽癌放療抵抗相關(guān)基因的重要細(xì)胞分子過(guò)程及相關(guān)通路。
通過(guò)Cistrome數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥cistrome.org/)可下載318個(gè)腫瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子(TFs),同時(shí)根據(jù)MSigDB數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的50個(gè)腫瘤特征集(Cacer hallmark),通過(guò)GSVA(version 1.38.0)計(jì)算單樣本通路基因集變異分?jǐn)?shù),再結(jié)合上述識(shí)別的鼻咽癌放療抵抗干性基因,可構(gòu)建鼻咽癌放療抵抗基因網(wǎng)絡(luò),在此基礎(chǔ)上進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析(igraph version 1.2.5),識(shí)別放療抵抗重要的功能模塊(Cystoscape與igraph軟件包),同時(shí)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)點(diǎn)的連接度,介數(shù)及緊密性等指標(biāo)篩選重要的網(wǎng)絡(luò)結(jié)點(diǎn)基因。
本研究均應(yīng)用R(version 4.0.2)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,用ggplot2(version 3.3.3)軟件包等統(tǒng)計(jì)可視化工具軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖,其中熱圖采用ComplexHeatmap(v2.11.1),放療抵抗基因網(wǎng)絡(luò)采用network(v1.17.1)。
圖1 鼻咽癌干性指數(shù)與放療敏感性的ROC曲線
根據(jù)基因表達(dá)數(shù)據(jù)和干性分?jǐn)?shù),分別計(jì)算放療抵抗差異表達(dá)基因733個(gè)和和干性相關(guān)差異基因678個(gè)(圖2A,B和圖3A,B)。GO分析顯示放療抵抗差異基因調(diào)節(jié)的生物過(guò)程主要集中在B細(xì)胞介導(dǎo)免疫、免疫效應(yīng)過(guò)程和分子介導(dǎo)的免疫反應(yīng);調(diào)節(jié)的細(xì)胞成分富集在質(zhì)膜外;調(diào)節(jié)的分子功能富集在細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子結(jié)合和酪氨酸蛋白激酶結(jié)合(圖2C)。KEGG分析顯示差異基因可在Intestinal immune network for IgA production、JAK-STAT、Cytokine-cytokine receptor interaction等信號(hào)通路富集(圖2D)。另外,干性相關(guān)差異基因的GO分析顯示其生物過(guò)程主要集中在細(xì)胞活化的正調(diào)控、適應(yīng)性免疫反應(yīng)、細(xì)胞黏附的正調(diào)控等。KEGG分析顯示基因可在Cytokine-cytokine receptor interaction、I型糖尿病、同種異體移植排斥等相關(guān)信號(hào)通路富集(圖3C,3D)。采用彈性網(wǎng)絡(luò)logistic回歸機(jī)器學(xué)習(xí)方法識(shí)別放療抵抗干性相關(guān)差異表達(dá)相關(guān)基因,共篩選到27個(gè),分別為ACTC1,AGTRAP,CHRM5,CNIH3,DPT,F(xiàn)AM8A1,F(xiàn)ANCL,HAS2,HOXB2,IGLC1,IL1RN,KIFAP3,LNX1,MRPL13,MYL6,NLRP14,PRKDC,RABAC1,RABGAP1L,RALA,SENP5,SERPING1,SMDT1,SPAG7,TMA16,TMTC4和ZBTB33。
注:A:差異基因表達(dá)熱圖;B:差異基因表達(dá)的火山圖;C:差異基因Go分析;D:差異基因KEGG分析
注:A:差異基因表達(dá)熱圖;B:差異基因表達(dá)的火山圖;C:差異基因GO分析;D:差異基因KEGG分析
首先進(jìn)行放療抵抗相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和腫瘤特征的篩選(圖4),進(jìn)而相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子、腫瘤放療抵抗干性相關(guān)基因和腫瘤特征變異分?jǐn)?shù)計(jì)算兩兩相關(guān)系數(shù),再根據(jù)相關(guān)系數(shù)構(gòu)建三者的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)(圖5)。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)分析,識(shí)別放療抵抗重要的功能模塊,同時(shí)根據(jù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)點(diǎn)的連接度,認(rèn)為PRKDC、HOXB2和ZBTB33在網(wǎng)絡(luò)中有著重要的作用,可作為鼻咽癌放療增敏的侯選標(biāo)靶。
注:A、B:鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及對(duì)應(yīng)的P值;C、D:鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)腫瘤特征的變異分?jǐn)?shù)及對(duì)應(yīng)的P值。
注:A:熱圖;B:網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)圖
本研究圍繞鼻咽癌臨床工作中放療抵抗導(dǎo)致治療后腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移這一突出問(wèn)題,立足于腫瘤干細(xì)胞的視野,通過(guò)整合現(xiàn)有的腫瘤干細(xì)胞研究成果和多個(gè)有關(guān)鼻咽癌放療相關(guān)數(shù)據(jù),在統(tǒng)一統(tǒng)計(jì)模型下進(jìn)行分析,識(shí)別鼻咽癌放療抵抗干性相關(guān)基因,該方法可以解決傳統(tǒng)上只針對(duì)大部分腫瘤細(xì)胞而忽略CSCs的問(wèn)題,使靶點(diǎn)更為可靠。
本文采用彈性網(wǎng)絡(luò)logistic回歸機(jī)器學(xué)習(xí)方法識(shí)別到27個(gè)放療抵抗干性相關(guān)差異表達(dá)相關(guān)基因。KEGG通路富集分析結(jié)果表明,其主要富集于JAK-STAT、Cytokine-cytokine receptor interaction等信號(hào)通路。腫瘤干細(xì)胞介導(dǎo)放療抵抗性的機(jī)制涉及到DNA修復(fù)的激活、清除活性氧防止不可逆的氧化應(yīng)激、抗細(xì)胞凋亡和改變腫瘤微環(huán)境[8]。大量研究表明,IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路在許多類型的癌癥中異常高活化,同時(shí)強(qiáng)烈抑制抗腫瘤免疫反應(yīng),它在抑制腫瘤生長(zhǎng)、癌細(xì)胞的耐藥、放療抵抗、抗腫瘤免疫方面具有相當(dāng)大的潛力和前景[9-13]。但I(xiàn)L-6/JAK/STAT3信號(hào)通路在鼻咽癌中的相關(guān)研究卻并不多見,尤其是放療抵抗方面的研究則更少見。
本研究最終確定的3個(gè)核心基因,PRKDC、HOXB2和ZBTB33均可以通過(guò)調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等方面,維持不同腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)[14-17]。
PRKDC(Proteinkinase,DNA-activated,catalytic subunit)基因編碼合成細(xì)胞核內(nèi)DNA依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(DNA-PK)的催化亞基,其蛋白產(chǎn)物為非同源末端連接修復(fù)(nonhomologous end joining,NHEJ)通路中重要的功能執(zhí)行因子。帥等通過(guò)綜合分析GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),并結(jié)合預(yù)后差異發(fā)現(xiàn),PRKDC與食管鱗癌放射敏感性和預(yù)后均相關(guān),且高表達(dá)患者經(jīng)過(guò)放射治療更易獲得完全緩解,預(yù)后也越好[18]。與其不同的是,Chen等發(fā)現(xiàn)miRNA-218-5p可以抑制抗輻射肺癌細(xì)胞的PRKDC的活性,從而加速DNA損傷、細(xì)胞凋亡并增加細(xì)胞的放療敏感性[19]。Zhang等發(fā)現(xiàn)敲低胃癌細(xì)胞的PRKDC表達(dá)可以促進(jìn)DNA損傷,并提高胃癌細(xì)胞的化療抵抗性,提示PRKDC可作為克服胃癌化療抵抗的潛在靶點(diǎn)[20]。
Jing等發(fā)現(xiàn)HOXB2 and FOXC1通過(guò)促進(jìn)Wilms瘤細(xì)胞的增殖和遷移作用而協(xié)同驅(qū)動(dòng)Wilms腫瘤的進(jìn)展[16]。Xu等發(fā)現(xiàn)HOXB2可以直接與c-Myc和Nanog的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合而激活其轉(zhuǎn)錄功能從而促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌干細(xì)胞特性[21]。
ZBTB33基因位于Xq23,編碼的Kaiso蛋白屬于鋅指蛋白超家族中BTB/POZ轉(zhuǎn)錄因子亞家族的成員。Singha等研究發(fā)現(xiàn)Kaiso(ZBTB33)的亞細(xì)胞分布與其他乳腺癌生物標(biāo)志物之間的多重多元分析揭示了Kaiso和自噬相關(guān)蛋白LC3A/B之間新的功能和預(yù)測(cè)聯(lián)系,這些蛋白與腫瘤免疫微環(huán)境、生存和種族的特征相關(guān)[22]。Feng等發(fā)現(xiàn)miR-4262可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,接著又通過(guò)生信分析和熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)ZBTB33是miR-4262的潛在靶基因[15]。李等通過(guò)建立肺癌細(xì)胞增殖調(diào)控網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn),ZBTB33可以通過(guò)p53信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[23]。
綜上所述,本研究基于生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),PRKDC、HOXB2和ZBTB33可能是導(dǎo)致鼻咽癌放療抵抗的干性相關(guān)基因,這些基因可能成為提高鼻咽癌放療增敏、改善預(yù)后的潛在治療靶點(diǎn)。接下來(lái),本研究團(tuán)隊(duì)將設(shè)計(jì)相關(guān)生物實(shí)驗(yàn)及臨床樣本進(jìn)一步研究其分子機(jī)制,以期為今后臨床試驗(yàn)和工作提供更加可靠的依據(jù)。
廣州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2022年3期