王佩瑤，張凌怡，張維冰

（華東理工大學 化學與分子工程學院 上海市功能性材料化學重點實驗室，上海 200237）

天然酶在自然界中發(fā)揮著非常重要的作用，但其制備成本高、儲存條件嚴格，具有一定的局限性［1］。納米酶是具有類似天然酶催化活性的無機納米材料，作為新一代的人工酶，具有成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，彌補了天然酶的不足，成為近年來的研究熱點。自2007年Fe3O4納米粒子作為過氧化物酶的模擬物被發(fā)現(xiàn)以來［2］，大量基于納米酶的研究不斷涌現(xiàn)。典型的納米酶包括碳納米材料（如碳納米管、氧化石墨烯、碳量子點），金屬納米粒子（如Ag、Au、Pt、Pd），金屬氧化物（如Fe3O4），金屬有機框架材料（Metal organic frameworks，簡稱MOFs）及各種復合材料等。納米酶已被運用在越來越多的領域，如對離子、分子、癌細胞等的檢測，對環(huán)境污染物的處理，在抗菌、抗癌、抗氧化方面的應用等［3］。

MOFs 是由金屬離子/簇與有機配體配位而成的多孔材料，具有大量的活性位點，研究表明MIL-53、MIL-88、MIL-100 和MIL-101 等MOFs 具有良好的催化活性［4］。如MIL-53（Fe）被證明具有類過氧化物酶活性，在H2O2的存在下可以催化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）和鄰苯二胺（OPD）的氧化，并實現(xiàn)對H2O2的比色檢測［5］。MOFs 材料具有良好的類過氧化物酶活性，Valekar 等［6］使用N，N，N'，N'-四甲基-1，4-丁二胺（TMBDA）將MIL-100（Fe）功能化后與膽堿和乙酰膽堿特異性酶結(jié)合，成功地檢測了牛奶和血清中分別存在的膽堿和乙酰膽堿。Xu等［7］采用微波輔助法合成了Fe3O4@MIL-100（Fe），證實該材料具有良好的類過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，發(fā)展了簡單有效的谷胱甘肽比色檢測法，該方法的線性范圍為1 ～45μmol/L，檢出限（LOD）為0.26μmol/L。

碳納米材料作為典型的類酶材料，成為納米酶研究的熱點。Song 等［8］合成了羧基修飾的氧化石墨烯（GO-COOH），并成功用于葡萄糖的檢測。Zhang等［9］制備了ZIF-8-還原氧化石墨烯（ZIF-8-rGO）負載的雙金屬（AuPt）納米顆粒，并作為一種新型的過氧化物酶模擬物用于H2O2的高靈敏度檢測。Li等［10］將氮雜原子（N）摻雜到Q-石墨烯（QG）中，制備得到的碳基納米酶具有高特異性的類過氧化物酶催化活性，其催化性能大大提高。煤系針狀焦（NC）是以煤焦油、瀝青及其重要餾分為原料［11］制成的固體炭材料，在顯微鏡下具有明顯的針狀紋理結(jié)構，片層狀結(jié)構堆積整齊［12］，其結(jié)構及組成與石墨烯相似，可用于制備特種炭素材料及其復合材料、超高功率電極［11］等。目前將石墨烯作為納米酶的研究較多，然而并無基于針狀焦的納米酶的相關報道?？紤]到針狀焦的低成本及其與石墨烯的相似性，發(fā)展基于針狀焦的新型復合納米酶具有極大的應用潛力。

生物硫醇主要包括谷胱甘肽和半胱氨酸，在人體代謝中起著至關重要的作用。體液中這些低分子量硫醇的異常水平與一些疾病密切相關，包括糖尿病、癌癥和心血管疾病等［13］，因此發(fā)展谷胱甘肽和半胱氨酸的檢測方法具有重要的生物學意義。目前已發(fā)展了各類材料用于生物硫醇的檢測，如FeS2/SiO2［14］、MoS2@CoFe2O4［15］、Ru@G［16］、Fe3+［17］等。Liu等［18］利用靈芝多糖還原并功能化氧化石墨烯，并將得到的材料用于半胱氨酸檢測，檢出限為0.1μmol/L，線性范圍為2 ～30μmol/L；Deng 等［19］制備了鐵和氮共摻雜的石墨烯量子點，實現(xiàn)了復方氨基酸片中半胱氨酸的檢測；Wu等［20］合成了石墨氮化碳并將其應用于血清樣品中半胱氨酸的檢測。

本文以針狀焦為基底，利用其與MIL-100（Fe）間的靜電相互作用制備了復合材料NC@MIL-100（Fe），對材料進行表征并研究了其類過氧化物酶活性。以NC@MIL-100（Fe）為納米酶發(fā)展了谷胱甘肽和半胱氨酸的分析方法，優(yōu)化了分析條件，并進一步應用于實際樣品人血清中生物硫醇濃度的檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

煤系針狀焦由鞍山熱能院提供；均苯三甲酸（H3BTC）購于西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；乙醇、硝酸、氯化鉀購于上海凌峰試劑有限公司；精氨酸（Arg）購于上海百靈威化學技術有限公司；九水硝酸鐵（Fe（NO3）3·9H2O）、30%過氧化氫（30% H2O2）購于國藥集團化學試劑有限公司；谷胱甘肽（GSH）、二甲基亞砜（DMSO）、L-半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）購于上海麥克林生化科技有限公司；無水乙酸鈉（NaAc）、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）、氯化鈉、氯化鎂、乙酸（HAc）、L-組氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）等其他氨基酸購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；健康人血清來自復旦大學附屬中山醫(yī)院；實驗所用試劑均為分析純；實驗用水均為超純水。

S-3400N 掃描電子顯微鏡（SEM，日本日立公司）；JEM-1400 生物透射電子顯微鏡（TEM，日本電子株式會社）；FT-IR 6700傅里葉變換紅外光譜儀（美國尼高力公司）；D/max2550VB/PC X 射線衍射儀（XRD，日本理學電機）；UV-2550紫外-可見分光光度計（日本島津公司）。

1.2 NC@MIL-100（Fe）的制備

將14.43 g Fe（NO3）3·9H2O 與5.04 g H3BTC 溶于36 mL 水中，超聲1 h，隨后轉(zhuǎn)移至反應釜中160 ℃下反應12 h，之后加水在70 ℃下攪拌3 h，再加乙醇在65 ℃下攪拌3 h以洗去雜質(zhì)。最后將所得材料置于50 ℃真空烘箱下過夜烘干，得到MIL-100（Fe）［21］。

稱取500 mg針狀焦，倒入60 mL濃硝酸，60 ℃油浴下攪拌7 h，水洗至中性后置于50 ℃烘箱過夜，得到酸化后的針狀焦。

將7.21 g Fe（NO3）3·9H2O與2.52 g H3BTC溶于18 mL水中，取25 mg酸化后的針狀焦溶于50 mL水。將以上兩種溶液分別超聲1 h，之后將兩者混合攪拌1 h，轉(zhuǎn)移至反應釜中150 ℃下反應15 h。反應完成后，將材料離心，之后加水在70 ℃下攪拌3 h，再加乙醇在65 ℃下攪拌3 h，洗去雜質(zhì)。最后將所得材料置于90 ℃烘箱下過夜烘干，得到NC@MIL-100（Fe）。

1.3 NC@MIL-100（Fe）的類過氧化物酶活性研究

將4.8μL TMB（10 mg/mL）、100μL 30%的H2O2及20μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）與0.2 mol/L的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，使反應液總體積為1 mL。隨后在37 ℃下孵育，用紫外-可見分光光度計檢測其在500 ～800 nm 波長范圍的吸收光譜，并考察其在652 nm 波長下的吸光度隨時間的變化曲線。作為對比，針狀焦和MIL-100（Fe）也在相同條件下測試。

在保持其他條件一致的情況下，考察了不同的H2O2濃度（0.1 ～5 mmol/L），TMB濃度（0.1 ～4 mmol/L），納米酶質(zhì)量濃度（2 ～100μg/mL）及孵育時間（5 ～30 min）下，反應體系在652 nm波長下吸光度的大小。

取20μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），不同體積（1.2、2.4、4.8、7.2、9.6、12、16.8、24μL）的TMB溶液（10 mg/mL）與0.2 mol/L的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，37 ℃下孵育20 min，加入100μL 30%的H2O2使反應液總體積為1 mL，檢測其在652 nm波長下的吸光度隨時間的變化。將吸光度增加速率轉(zhuǎn)換為催化反應速度v，并將v和底物濃度擬合到米氏方程，計算動力學常數(shù)Vmax和Km。米氏方程如下所示：

其中Vmax為飽和底物濃度下的最大反應速率，［S］是底物的濃度，Km是米氏常數(shù)。Km反映了納米酶對其底物的親和力，定義為最大速率一半時的底物濃度，Km越小說明材料對底物的親和力越強。

以H2O2為底物時，取20μL 的NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），不同體積（1、2、4、6、8、10、14、20 μL）的H2O2溶液（50 mmol/L）與0.2 mol/L 的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，37 ℃下孵育20 min，加入120μL TMB溶液（10 mg/mL）使反應液總體積為1 mL，其他步驟同上。

1.4 對生物硫醇的檢測

將4.8 μL TMB 溶液（10 mg/mL），20 μL H2O2溶液（50 mmol/L），20 μL 的NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），不同體積（0、0.6、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、14、16、18μL）的谷胱甘肽溶液（5 mmol/L）與0.2 mol/L的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，使反應液總體積為1 mL，37 ℃下孵育20 min，用紫外-可見分光光度計檢測其在500 ～800 nm 波長處的吸收光譜。檢測半胱氨酸時，則將谷胱甘肽溶液替換為不同體積（0、1、10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、140、160、180μL）的半胱氨酸溶液（1 mmol/L），其他條件同上。

將4.8 μL TMB 溶 液（10 mg/mL），20 μL H2O2溶 液（50 mmol/L），20 μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），20μL 濃度為5 mmol/L 的組氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、色氨酸（Trp）、苯丙氨酸（Phe）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、天冬氨酸（Asp）、精氨酸（Arg）、Na+、Mg2+和K+溶液與0.2 mol/L 的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，使反應液總體積為1 mL。在37 ℃下孵育，并檢測其在652 nm波長下的吸光度。

將4.8 μL TMB 溶 液（10 mg/mL），20 μL H2O2溶 液（50 mmol/L），20 μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL），健康人血清與0.2 mol/L 的NaAc-HAc（pH 3.6）緩沖液混合，使反應液總體積為1 mL 且最終人血清的濃度被稀釋10 倍。在37 ℃下孵育，并在652 nm 波長下檢測其吸光度。將吸光度變化值轉(zhuǎn)化為濃度，即可得到人血清中生物硫醇的含量。加標實驗分別將200μmol/L 和400μmol/L 的半胱氨酸加入上述反應體系中，使其最終濃度被稀釋10倍，計算血清中生物硫醇的實際濃度和回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 NC@MIL-100（Fe）的制備與表征

由于煤系針狀焦表面基團較少，為了使MIL-100（Fe）順利吸附，首先用濃硝酸氧化針狀焦，在其表面引入羥基、羧基等基團。利用酸化后的針狀焦與MIL-100（Fe）間的靜電相互作用制備NC@MIL-100（Fe）具有成本低、一次制備產(chǎn)量較大、制備方法簡單等優(yōu)勢。

采用掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）對材料的形貌進行表征，結(jié)果如圖1 所示。針狀焦呈片層狀結(jié)構，MIL-100（Fe）為直徑約100 nm 的顆粒；而從NC@MIL-100（Fe）的電鏡圖可看出，基于針狀焦的片層結(jié)構，MIL-100（Fe）能較為均勻地分布在其上，減少了MIL-100（Fe）的團聚現(xiàn)象。

圖1 NC（A）、MIL-100（Fe）（B）、NC@MIL-100（Fe）（C）的SEM圖及NC（D）、MIL-100（Fe）（E）、NC@MIL-100（Fe）（F）的TEM圖Fig.1 SEM images of NC（A），MIL-100（Fe）（B），NC@MIL-100（Fe）（C）and TEM images of NC（D），MIL-100（Fe）（E），NC@MIL-100（Fe）（F）

圖2A 為材料的XRD 表征結(jié)果?？煽闯鲠槧罱乖?6.3°（002）［21］處出現(xiàn)了較強的衍射峰；MIL-100（Fe）在5.3°（333）、10.8°（428）、14.2°（088）、18.2°（7911）、24°（6618）和27.7°（9321）處出現(xiàn)了衍射峰，與文獻報道一致［22］；而在NC@MIL-100（Fe）中，MIL-100（Fe）的衍射峰均有出現(xiàn)，但針狀焦的衍射峰并不明顯，可能是因為MIL-100（Fe）較多的覆蓋在針狀焦的表面。圖2B為材料的紅外光譜圖，針狀焦中3424、1654、1631、1051 cm-1處的峰分別對應O—H、—C==O、—C==C、—C—O基團；MIL-100（Fe）中3417、1623、1574、1446、758、711 cm-1處的峰分別對應O—H基團和苯環(huán)［23］；而在NC@MIL-100（Fe）中，針狀焦和MIL-100（Fe）的特征峰均有出現(xiàn)。圖2C為材料的N2吸附-脫附等溫線，可得到針狀焦、MIL-100（Fe）和NC@MIL-100（Fe）的BET比表面積分別為20.53、1354.92、912.38 m2/g。復合材料NC@MIL-100（Fe）仍保持了較大的比表面積。以上表征均證明NC@MIL-100（Fe）成功合成。

圖2 NC、MIL-100（Fe）和NC@MIL-100（Fe）的XRD圖譜（A）、紅外光譜（B）和N2吸附-脫附等溫線（C）Fig.2 XRD patterns（A），F(xiàn)T-IR spectra（B）and N2 adsorption-desorption isotherms（C）of NC，MIL-100（Fe）and NC@MIL-100（Fe）

2.2 類過氧化物酶活性研究

為了考察NC@MIL-100（Fe）材料作為納米酶的性能，對其類過氧化物酶活性進行了研究。由于類過氧化物酶在H2O2的存在下可以催化TMB的氧化，使反應體系由無色變?yōu)樗{色，因此使用紫外-可見分光光度計對反應體系的吸光度進行檢測，以吸光度的變化值為參數(shù)評價NC@MIL-100（Fe）的類酶活性。首先檢測了相同條件下，針狀焦、MIL-100（Fe）和NC@MIL-100（Fe）的吸收光譜及吸光度隨時間的變化曲線。如圖3A 所示，NC@MIL-100（Fe）在652 nm 下的吸光度明顯高于單獨的針狀焦與MIL-100（Fe）；圖3B 顯示在相同時間下，NC@MIL-100（Fe）吸光度的變化值最大，說明在單位時間內(nèi)NC@MIL-100（Fe）的催化性能優(yōu)于針狀焦與MIL-100（Fe）。

圖3 NC、MIL-100（Fe）、NC@MIL-100（Fe）的紫外-可見吸收光譜（A）及吸光度隨時間的變化曲線（B）Fig.3 UV-Vis absorption spectra of NC，MIL-100（Fe），NC@MIL-100（Fe）（A）and the curves of absorbance versus time（B）conditions：4.8μL TMB（10 mg/mL），100μL 30%H2O2 and 20μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）

對納米酶催化條件進行優(yōu)化（圖4），分別考察了其他條件不變時不同H2O2濃度、TMB 濃度、納米酶質(zhì)量濃度和孵育時間對反應體系相對吸光度的影響。結(jié)果顯示催化反應的最佳條件為1 mmol/L H2O2、3 mmol/L TMB、80μg/mL NC@MIL-100（Fe）和20 min的孵育時間。

圖4 不同的H2O2濃度（A）、TMB濃度（B）、納米酶質(zhì)量濃度（C）及孵育時間（D）對反應體系相對吸光度的影響Fig.4 The effect of different H2O2 concentrations（A），TMB concentrations（B），nanozyme mass concentration（C）and incubation time（D）on the relative absorbance of the reaction systemconditions：24μL TMB（10 mg/mL），20μL H2O2（50 mmol/L），20 min incubation time and 20μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）

分別以TMB 和H2O2為底物，研究了各材料的類過氧化物酶催化動力學，結(jié)果見表1。經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，針狀焦的Km和Vmax較小，說明針狀焦對底物的親和力較高，但催化反應速度較慢；MIL-100（Fe）的Km和Vmax較大，說明其催化反應速度較快，但對底物的親和力較低；而不論是以TMB 還是以H2O2作為底物，NC@MIL-100（Fe）的Km值均介于針狀焦與MIL-100（Fe）之間，且Vmax值大于針狀焦和MIL-100（Fe），說明該材料結(jié)合了針狀焦和MIL-100（Fe）的優(yōu)勢，對底物的親和力較高且催化反應速度較快，具有良好的類過氧化物酶活性。

表1 各材料的動力學參數(shù)Table 1 The kinetic parameters of each material

表2列舉了其他納米酶和本文合成的納米酶的催化動力學常數(shù)。在分別以TMB和H2O2為底物的情況下，與辣根過氧化物酶（HRP）相比，NC@MIL-100（Fe）的Km值比HRP小1.61倍和8.6倍，說明該材料比天然酶對底物的親和力更強；與其他納米酶相比，NC@MIL-100（Fe）也表現(xiàn)出較為優(yōu)異的催化效果。

表2 各種納米酶Km值與Vmax值的對比Table 2 Comparison of Km and Vmax value of various nanozymes

（續(xù)表2）

2.3 對生物硫醇的檢測

基于NC@MIL-100（Fe）良好的類過氧化物酶活性，將其應用于谷胱甘肽和半胱氨酸的分析。由于谷胱甘肽和半胱氨酸含有巰基，加入反應體系后將與TMB競爭H2O2因被還原而產(chǎn)生的羥基［15］，導致被氧化的TMB 含量減少，從而使反應體系的藍色變淺。如圖5A 和圖5B 所示，隨著谷胱甘肽或半胱氨酸濃度的增加，反應體系在652 nm下的吸光度逐漸減小。以吸光度的變化值（ΔA）為縱坐標，不同的谷胱甘肽和半胱氨酸濃度為橫坐標繪制散點圖（圖5C 和圖5D），發(fā)現(xiàn)在較高濃度下ΔA趨于飽和。在3 ～70μmol/L 范圍內(nèi)ΔA與谷胱甘肽的濃度呈線性關系，方程為ΔA=0.0143cGSH+9×10-6（r2=0.998），檢出限（LOD，3σ/S）為0.33μmol/L；在1 ～80μmol/L 范圍內(nèi)ΔA與半胱氨酸的濃度呈線性關系，方程為ΔA=0.0095cCys+0.0184（r2=0.998），LOD（3σ/S）為0.22μmol/L。

圖5 加入不同濃度谷胱甘肽（A）和半胱氨酸（B）的吸收光譜及體系吸光度隨兩者濃度的變化值（C、D）Fig.5 The UV absorption spectra（A，B）and changes in absorbance（C，D）with different concentrations of GSH and Cysconditions：20μL H2O2（50 mmol/L），4.8μL TMB（10 mg/mL）and 20μL NC@MIL-100（Fe）（1 mg/mL）

表3為多種納米酶檢測谷胱甘肽和半胱氨酸的線性范圍及LOD 值。相比其他材料，NC@MIL-100（Fe）檢測的線性范圍更寬，且LOD較小，是檢測谷胱甘肽和半胱氨酸的良好材料。

表3 各納米酶對谷胱甘肽和半胱氨酸的線性范圍及LOD的比較Table 3 Comparison of the linear ranges and LODs of GSH and Cys detected by various nanozymes

2.4 反應體系的選擇性

研究了其他氨基酸及離子對反應體系的干擾情況。加入濃度均為100μmol/L的谷胱甘肽、半胱氨酸及干擾物質(zhì)，并檢測反應體系的吸光度。由圖6可知，包含谷胱甘肽和半胱氨酸的反應體系吸光度發(fā)生了明顯變化，溶液褪色明顯。以半胱氨酸為例，在幾種干擾物質(zhì)中，組氨酸、谷氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、精氨酸對反應體系具有一定的干擾，其濃度為100 μmol/L 時，相對誤差為10.6% ～18.9%；其它組分的干擾較小，濃度為100μmol/L 時，相對誤差為0.5%～8.3%，說明反應體系對谷胱甘肽和半胱氨酸的檢測具有較好的選擇性。但應注意的是，若檢測過程中，反應體系內(nèi)存在能被羥基自由基氧化的其他還原性物質(zhì)，則該還原性物質(zhì)也會與TMB 競爭羥基自由基，從而對生物硫醇的檢測產(chǎn)生干擾。

圖6 體系對GSH和Cys檢測的選擇性Fig.6 Selectivity of detection for GSH and Cysconditions：the interfering substance is 100μmol/L，and other conditions are the same as those in Fig.5

2.5 實際樣品測定

由于人血清中半胱氨酸的濃度遠高于谷胱甘肽的濃度［25］，因此以血清中半胱氨酸為分析對象。檢測結(jié)果如表4 所示，人血清中生物硫醇的濃度為178 μmol/L，測定的相對標準偏差為（RSD）為4.2%。向上述樣品中分別加入200、400μmol/L 的半胱氨酸標準溶液進行加標實驗，得到其回收率為94.5%～103%，RSD 為2.3%～2.4%。結(jié)果表明該方法在實際樣品中的檢測效果良好。但基于本方法的檢測原理，如果樣品中同時含有谷胱甘肽和半胱氨酸，則本方法不能實現(xiàn)兩者的分別測定，僅能對其總量進行估測。

表4 NC@MIL-100（Fe）用于人血清中半胱氨酸濃度的檢測Table 4 NC@MIL-100（Fe）for the detection of Cys concentration in human serum

3 結(jié)論

本文以針狀焦為基底，通過其與MIL-100（Fe）間的靜電相互作用制備了新型納米酶NC@MIL-100（Fe），并應用于谷胱甘肽和半胱氨酸的分析。NC@MIL-100（Fe）不僅原料成本較低、使用量小、合成方法簡單，且對底物的親和力較高，催化反應速度較快。NC@MIL-100（Fe）作為性能優(yōu)良的納米酶，有望在生物樣品分析和疾病診斷等領域發(fā)揮重要作用。