舒玉鳳，盧靜靜，陳 旭

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205）

蒲公英 （Taraxacum mongolicum） 味微苦，寒性，具有清熱解毒和利尿等功效[1]，多糖作為蒲公英中的活性成分，具備增強(qiáng)機(jī)體免疫力、降低血脂、預(yù)防衰老和抗輻射等功能，在醫(yī)療和保健方面具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值[2-3]，因此蒲公英中多糖提取的研究越來(lái)越引起人們的關(guān)注?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外比較普遍的使用酶解法和熱水浸提法提取蒲公英中的多糖[4-5]。與前兩者提取法相比較，超聲波輔助提取具有用時(shí)短、容易操作、效果良好等特點(diǎn)，已應(yīng)用于植物有效成分的提取[6]，但在蒲公英多糖提取方面有關(guān)的報(bào)道不多。

自由基又稱游離基，能夠破壞細(xì)胞的化學(xué)物質(zhì)，破壞機(jī)體內(nèi)的遺傳基因組織、酶、脂肪、碳水化合物等，進(jìn)而導(dǎo)致食品發(fā)生腐敗變質(zhì)。為有效扼制食品中有害微生物的生長(zhǎng)和減緩其被氧化變質(zhì)的過(guò)程，目前主要通過(guò)添加防腐劑和抗氧化劑，但工業(yè)合成的抗氧化物存在較多安全隱患。從食物和天然產(chǎn)物中尋找活性物質(zhì)，開(kāi)發(fā)抑菌、抗氧化、降低血糖、血脂及高血壓等功能性食品或藥物成為現(xiàn)下研究的熱門(mén)[7]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，天然活性成分可提供氫離子或螯合金屬離子，達(dá)到清除自由基的目的[8]，所以研究植物及中藥提取物對(duì)抑制其產(chǎn)生具有重要意義。

利用超聲波輔助水提法提取蒲公英多糖，探究各因素對(duì)蒲公英多糖得率的影響，并對(duì)此進(jìn)行優(yōu)化以確定最佳提取條件，同時(shí)研究蒲公英多糖抗氧化活性，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)蒲公英多糖尋找較為恰當(dāng)?shù)奶崛》椒ê蜅l件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蒲公英，購(gòu)自當(dāng)?shù)刂兴幍辏黄咸烟?、濃硫酸、苯酚、乙醇、三氯化鐵、硫酸亞鐵、DPPH、H2O2和鄰苯三酚試劑，均為國(guó)產(chǎn)分析純；試驗(yàn)用水為蒸餾水，購(gòu)自屈臣氏。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800 CP 型紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司產(chǎn)品；FW-200 型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；HH-S4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司產(chǎn)品；MEC 型超聲波清洗機(jī)，深圳市明和超音波工業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；DHG-9240（A） 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；TDL-5-A 型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

選取無(wú)蟲(chóng)蛀、無(wú)霉斑的干燥蒲公英植株，置于高速粉碎機(jī)中粉碎，過(guò)60 目篩，將制備的蒲公英粉末采用索氏抽提法在50 ℃條件下，用石油醚回流處理4 h 后得到脫脂蒲公英粉末，過(guò)篩干燥備用。

1.3.2 蒲公英多糖提取工藝

稱取適量脫脂蒲公英粉，加入去離子水?dāng)嚢杈鶆?，熱水浸提后取出室溫下冷卻。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，取上清液，加入3 倍體積的95%乙醇，密封后于4 ℃的條件下靜置24 h，再次以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心20 min，數(shù)次清洗沉淀，將沉淀用去離子水溶解并定容至100 mL，于波長(zhǎng)490 nm 處測(cè)定吸光度。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量[13]，并按照公式計(jì)算蒲公英多糖得率。

式中：m1——多糖質(zhì)量，g；

m2——樣品質(zhì)量，g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

以蒲公英粉末為試驗(yàn)原料，利用超聲波輔助熱水浸提法，研究提取時(shí)間 （60，90，120，150，180 min）、超聲功率 （40，80，120，160，200 W）、提取溫度 （50，60，70，80，90 ℃） 和料液比 （1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50） 對(duì)多糖得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)條件下，將Box-behnken 試驗(yàn)作為依據(jù)設(shè)計(jì)試驗(yàn)原理，將蒲公英多糖得率作為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，并驗(yàn)證最佳提取工藝條件。

響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.5 抗氧化活性測(cè)定

（1） DPPH·清除能力的測(cè)定。參考文獻(xiàn)[9-10]。準(zhǔn)確取2.0 mL 不同濃度的樣品溶液和0.1 mmol/L 的DPPH 溶液2.0 mL 混合，充分搖勻，避光反應(yīng)30 min，以無(wú)水乙醇作為空白，于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度。以維C 作為對(duì)照品，試驗(yàn)3 次，取平均值。

（2） 羥基自由基（·OH） 清除能力的測(cè)定。參考文獻(xiàn)[9-10]。分別取不同濃度樣品溶液1.0 mL，加入 6 mmol/L 的 FeSO4溶液 1 mL，6 mmol/L 水楊酸 -乙醇溶液 1 mL 和 6 mmol/L 的 H2O2溶液 1 mL，于37 ℃下水浴400 min，然后于波長(zhǎng)510 nm 處測(cè)定吸光度。以相同濃度的維C 作為對(duì)照，以相同體積的蒸餾水作空白組，試驗(yàn)3 次，取平均值。

（3） 超氧陰離子自由基 （O2-·） 清除能力的測(cè)定。參考文獻(xiàn)[9-10]。分別取不同濃度的樣液2.0 mL，然后加入2.5 mL 濃度為0.05 mol/L 的Tris-HCl 緩沖液（pH 值8.8）。室溫下混勻后加入濃度為6 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.1 mL 后開(kāi)始計(jì)時(shí)5 min，每隔30 s記錄波長(zhǎng)320 nm 處的吸光度。以相同濃度的維C 作為對(duì)照，以相同體積的蒸餾水作空白組，試驗(yàn)3 次，取平均值。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均平行3 次，取平均值。單因素及抗氧化試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin 8.0 軟件處理，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)采用Design Expert.V 8.0.6 軟件分析，并進(jìn)行模型方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助提取蒲公英多糖的研究

2.1.1 單因素試驗(yàn)

不同超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度和料液比對(duì)蒲公英多糖得率的影響見(jiàn)圖1。

由圖 1 （a） 可知，提取時(shí)間在 1.0～2.5 h 過(guò)程中，蒲公英多糖得率與時(shí)間呈正相關(guān)，在2.5 h 時(shí)多糖得率達(dá)到峰值，為58.6 mg/g，隨著提取時(shí)間增加至3 h 時(shí)，蒲公英多糖得率開(kāi)始下滑。這可能是因?yàn)槠压⒅械亩嗵请S著超聲波引起的熱量匯集而開(kāi)始溶解[11]，從而使多糖得率下跌。因此，超聲時(shí)間選擇2.5 h。由圖 1（b） 可知，超聲功率為 40～120 W時(shí)，蒲公英多糖得率隨與超聲功率呈正相關(guān)，功率為120 W 時(shí)多糖的得率達(dá)到峰值，為73.3 mg/g，繼續(xù)增大功率，多糖得率開(kāi)始下滑。主要原因可能是超聲功率加大，劇烈的機(jī)械作用使得分子擴(kuò)散速度加快，蒲公英多糖更容易滲出，但是機(jī)械功率過(guò)大之后，蒲公英中其他水溶性物質(zhì)也被提取出來(lái)與多糖發(fā)生反應(yīng)，從而使多糖得率下降。綜合實(shí)際因素，超聲功率定為120 W。由圖1（c） 可知，提取溫度為50～80 ℃時(shí)，蒲公英多糖得率與提取溫度呈正相關(guān)。在80 ℃時(shí)多糖得率達(dá)到最峰值，為59.6 mg/g，隨著提取溫度的升高，多糖的得率逐漸下降?？赡苁窃诔晽l件下細(xì)胞中內(nèi)容物的擴(kuò)散更方便，使多糖的溶出更容易[11]，當(dāng)溫度大于80 ℃時(shí)，超聲溫度過(guò)高使糖苷鍵發(fā)生斷裂，從而多糖得率有所下降。所以提取溫度為80 ℃。由圖1（d） 可知，在料液比為1∶20 時(shí)，蒲公英多糖得率最達(dá)到峰值，為68.3 mg/g，繼續(xù)增加料液比，蒲公英多糖得率減小，這是由于在超聲條件下，溶劑含量較大，蒲公英中其他水溶性雜質(zhì)也容易溶出，經(jīng)過(guò)濃縮之后，多糖與其發(fā)生反應(yīng)，從而使多糖得率下降。最佳料液比為1∶20（g∶mL）。

圖1 不同超聲時(shí)間、超聲功率、提取溫度和料液比對(duì)蒲公英多糖得率的影響

2.1.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

（1） 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案和試驗(yàn)結(jié)果

采用Design Eexpert V8.0.6 軟件對(duì)表2 中試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸，得到蒲公英多糖得率對(duì)超聲時(shí)間（A）、超聲功率（B）、提取溫度（C） 和料液比（D） 的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和方差分析見(jiàn)表3。

由表3 可知，模型的p＜0.000 1＜0.01，差異極顯著；失擬項(xiàng)的p 值為0.052 4，不顯著，說(shuō)明模型穩(wěn)定，數(shù)據(jù)沒(méi)有異常點(diǎn)；決定系數(shù)R2=0.999 7，調(diào)整確定系數(shù)R2Adj=0.999 4，響應(yīng)值的變化有99.94% 來(lái)源于所選的超聲溫度、超聲時(shí)間和料液比3 個(gè)因素，說(shuō)明模型擬合程度可靠，回歸方程能很好地展現(xiàn)各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系。考查p 值與F 值大小，可知料液比的影響最大，提取溫度次之，超聲時(shí)間其后，超聲功率的影響最小。

表3 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)和方差分析

各因素交互作用對(duì)蒲公英多糖得率的響應(yīng)面見(jiàn)圖2。

響應(yīng)曲面坡度體現(xiàn)了響應(yīng)值面對(duì)操作條件改變的靈敏程度，即曲面陡峭度與多糖得率對(duì)于超聲時(shí)間、提取溫度、提超聲功率、料液比4 個(gè)條件的改變呈正相關(guān)。由圖2 可知，各因素交互作用的影響順序?yàn)?BC＞AD＞CD＞AC＞AB＞BD，與表 3 結(jié)果一致，即超聲功率和提取溫度曲面最陡峭，兩者交互作用對(duì)蒲公英多糖得率影響最大。而提取溫度和料液比的交互作用響應(yīng)面較平緩，說(shuō)明提取溫度和料液比的交互作用對(duì)蒲公英多糖得率影響不大。

2.2 最佳工藝條件驗(yàn)證

通過(guò)回歸模型預(yù)計(jì)測(cè)得超聲波輔助提取蒲公英多糖的最佳工藝條件為超聲時(shí)間154.2 min，超聲功率136.55 W，提取溫度82.52 ℃，料液比1∶22.33（g∶mL），此條件下蒲公英多糖得率89.38 mg/g。

根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件調(diào)整提取工藝。超聲波輔助提取蒲公英多糖的工藝條件為超聲時(shí)間154 min，超聲功率137 W，提取溫度82.5 ℃，料液比1∶22（g∶mL）。

根據(jù)調(diào)整后工藝條件，設(shè)置5 組平行試驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果表明，超聲波輔助提取蒲公英多糖得率88.62±0.18 mg/g，與理論值相差微小，證明該回歸模型獲得了較為準(zhǔn)確的優(yōu)化參數(shù)。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法優(yōu)化超聲波輔助提取蒲公英多糖工藝參數(shù)。結(jié)果表明，超聲波輔助法提取蒲公英多糖的最佳條件為超聲時(shí)間154 min，超聲功率137 W，提取溫度82.5 ℃，料液比1∶22（g∶mL），此條件下多糖得率可到達(dá)88.62 mg/g，說(shuō)明超聲波輔助提取法對(duì)蒲公英多糖的提取有較為明顯的增強(qiáng)作用，是一種操作性強(qiáng)且經(jīng)濟(jì)有效的提取方法。在各影響因素中，影響最大的是料液比，超聲功率和提取溫度兩者交互作用對(duì)蒲公英多糖得率影響最顯著。方差分析中決定系數(shù)R2為99.97%，變異系數(shù)為0.54%，說(shuō)明試驗(yàn)的數(shù)據(jù)穩(wěn)定、可靠，為蒲公英多糖提取的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。

試驗(yàn)還研究了最優(yōu)工藝條件下提取的多糖在抗氧化性能力方面的效果。結(jié)果表明，蒲公英多糖對(duì)DPPH·，·OH 和 O2-·3種自由基均有一定清除作用，對(duì)DPPH·自由基清除率較強(qiáng)[12]，可用于天然抗氧化劑開(kāi)發(fā)或功能性食品原料。綜上所述，試驗(yàn)所提供的超聲波輔助提取蒲公英能顯著提高多糖得率。同時(shí)，有效保護(hù)了多糖的抗氧化活性，為蒲公英的深度開(kāi)發(fā)提供了一定技術(shù)支持和理論依據(jù)。