亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        2-鹵代酸脫鹵酶的表達優(yōu)化

        2022-08-16 10:23:40王亞月董超群靳志遠張萌萌裴冬麗
        商丘師范學院學報 2022年9期
        關(guān)鍵詞:丙酸質(zhì)粒條件

        王亞月,董超群,靳志遠,張萌萌,裴冬麗

        (商丘師范學院 生物與食品學院,河南 商丘 476000)

        含鹵有機物在醫(yī)學和化學領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用,被廣泛用于除草劑、殺蟲劑、抗生素、藥品、塑料制品及有機合成中間體,然而由于這類化合物的不當使用,導(dǎo)致有機鹵化物在環(huán)境中積累.由于很多鹵代物具有“致癌、致畸、致突變”效應(yīng)[1],其在用于生產(chǎn)活動的同時給環(huán)境和人類帶來嚴重的危害.因此,對有機鹵代物脫鹵的研究具有重要意義.

        微生物作為自然界中主要分解者,將復(fù)雜的有機物轉(zhuǎn)化為簡單的化合物,從而保持生命元素的循環(huán)往復(fù).生長在被有機鹵代物污染的環(huán)境中的微生物具有轉(zhuǎn)化這些化合物的能力,即其細胞內(nèi)存在催化脫鹵作用的酶,這類酶被稱為脫鹵酶.DL-2-鹵代酸脫鹵酶(2-haloacid dehalogenase)j 催化裂解鹵代酸中碳-鹵鍵斷裂的一類酶,使之脫去鹵素原子,并產(chǎn)生所對應(yīng)的2-羥基羧酸化合物[2].2-鹵代酸脫鹵酶具有反應(yīng)底物廣譜性和高效的立體選擇性,并且在催化水解反應(yīng)中無需添加還原劑,因而在環(huán)境修復(fù)與化工合成領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用價值.如可制備手性羥基酸與鹵代酸,用作農(nóng)藥、醫(yī)藥及化工合成的中間體[3-6].

        目前已報道的DL-2-鹵代酸脫鹵酶相對較少,包括分離自Pseudomonassp.113的DL-DEX 113,PseudomonasputidaPP3的DehI與Methylobacteriumsp.CPA1的DL-DEX Mb[7-9].天然酶的表達量通常很低,從而限制了改酶的應(yīng)用及深入研究.本研究以分離自P.putidaPP3 菌株的DL-2-鹵代酸脫鹵酶DehI為研究對象,通過將構(gòu)建成功的DehI-pET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EscherichiacoliBL21(DE3),進行原核表達,為獲得較多可溶性表達蛋白,并對其表達條件進行優(yōu)化.以為進一步研究改酶的對映體選擇性機制和改造奠定基礎(chǔ).

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 菌株和質(zhì)粒

        DehI-pET28a重組質(zhì)粒,E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞.

        1.1.2 主要試劑

        氯化鈣(Sigma-aldrich,Germany ),異丙基硫代半乳糖苷IPTG(Takara,北京),卡那霉素(上海生工),L-2-氯丙酸(上海梯希愛),丙烯酰胺(上海生工),甲叉-雙丙烯酰胺(上海生工).

        1.1.3 培養(yǎng)基

        LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L(用1 mol/L的NaOH調(diào)至pH=7.5,121 ℃,滅菌20 min);LB固體培養(yǎng)基則是在上述基礎(chǔ)上加入18 g/L瓊脂.

        1.2 實驗方法

        1.2.1 構(gòu)建DehI原核表達載體

        將前期構(gòu)建成功的DehI-pET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞.

        1.2.2 DehI表達條件優(yōu)化

        表1 DehI表達條件優(yōu)化

        續(xù)表1

        如表1,分別從IPTG濃度,IPTG加入時間,IPTG誘導(dǎo)時間與誘導(dǎo)溫度4個因素方面進行優(yōu)化,設(shè)置因素水平,IPTG濃度分別為0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.5 mmol/L,0.7 mmol/L與1 mmol/L;IPTG加入時間分別是OD600 nm為0.3,0.5,0.6,0.8,0.9,1時加入;IPTG誘導(dǎo)時間分別為3 h,5 h,7 h,9 h與12 h;誘導(dǎo)溫度分別為15 ℃,20 ℃,25 ℃,30 ℃與37 ℃.基于隨機區(qū)組理論基礎(chǔ),使用Design-expert軟件對DehI誘導(dǎo)表達條件進行組合,共獲得30個誘導(dǎo)條件組合(表1).

        取活化的重組菌株菌液0.5 mL轉(zhuǎn)移至50 mL含50 μg/mL 卡那霉素的LB培養(yǎng)基,37 ℃,220 r/min培養(yǎng)至表1中每個誘導(dǎo)組對應(yīng)OD600nm,調(diào)至轉(zhuǎn)速為180 r/min,并置于表1中相應(yīng)條件下進行誘導(dǎo)表達.誘導(dǎo)結(jié)束后,于8000 r/min,4 ℃,離心30 min收集菌體,-80 ℃凍存?zhèn)溆?

        1.2.3 粗酶液制備

        取凍存的菌體,重懸于5 mL預(yù)冷的裂解緩沖液(50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4,pH=8.0)中,冰浴條件下超聲破碎(200 W,工作2 s,間隙2 s,120循環(huán)).12000 r/min,4 ℃,離心30 min,收集上清,即為粗酶液.

        1.2.4 表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析

        通過 SDS-PAGE 方法鑒定不同組合條件下蛋白表達情況[10].取粗酶液45 μL,加入5 μL上樣緩沖液,混勻,煮沸10 min,運用12% SDS-PAGE進行電泳,結(jié)束后使用考馬斯亮藍G-250染液染色,經(jīng)脫色后,觀察蛋白條帶顏色深淺判斷DehI表達水平.

        1.2.5 酶活性分析

        反應(yīng)體系1 mL,包括:10 mmol/L L-2-氯丙酸,100 mmol/L,pH10甘氨酸-NaOH,200μL待測酶液,在30 ℃水浴中反應(yīng)30 min,加入1%(v/v)的濃磷酸(85% w/w)終止反應(yīng).12000 r/min,離心10 min去除沉淀.通過HPLC檢測氯丙酸的減少確定酶活性[11].酶活單位(U)定義為:每分鐘催化轉(zhuǎn)化1 μmol 氯丙酸所需要的酶量.

        注:M,純化的DehI蛋白.圖1 誘導(dǎo)組合1-17條件下重組蛋白表達產(chǎn)物 SDS-PAGE圖

        注:M,純化的DehI蛋白.圖2 誘導(dǎo)組合18-30條件下重組蛋白表達產(chǎn)物SDS-PAGE圖

        2 結(jié)果與分析

        2.1 DehI表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析

        通過SDS-PAGE檢測不同誘導(dǎo)條件組合下蛋白表達量.如圖1和圖2所示,不同誘導(dǎo)組合條件下均獲得可溶性表達,蛋白表達量不盡相同.誘導(dǎo)組合3,7,8,9,12,15,16,20,21,27與28條件下獲得的蛋白表達量較高.其中,誘導(dǎo)組合3,8與16條件下蛋白條帶顏色最深,蛋白量相對較多,即誘導(dǎo)條件3:細胞OD600nm值為0.8,IPTG濃度為0.2 mM,誘導(dǎo)溫度為30 ℃,誘導(dǎo)時間為9 h;誘導(dǎo)條件8:細胞OD600nm值為0.6,IPTG濃度為0.1 mM,誘導(dǎo)溫度為25 ℃,誘導(dǎo)時間為7 h;誘導(dǎo)條件16:細胞OD600nm值為0.5,IPTG濃度為0.7 mM,誘導(dǎo)溫度為30 ℃,誘導(dǎo)時間為5 h;這3種組合下的誘導(dǎo)條件可作為DehI重組蛋白的表達條件.

        2.2 粗酶活性分析

        考慮到SDS-PAGE操作過程中的誤差,進一步分析了不同組合誘導(dǎo)條件下獲得的粗酶液活性.如圖3所示,通過對不同組合酶活性分析,發(fā)現(xiàn)第3組誘導(dǎo)條件下所獲得的DehI催化活性最高為1.36 U/mL粗酶液,與常用誘導(dǎo)表達條件(OD600 nm為0.5,0.5 mM IPTG,37 ℃誘導(dǎo)4 h)相比提高7.6倍;其次是第16組與第20組,催化活性分別是0.90 U/mL與0.75 U/mL粗酶液,與SDS-PAGE結(jié)果一致.綜上可知:第3組誘導(dǎo)條件即菌液OD600 nm為0.8,IPTG終濃度為0.2 mM,溫度為30 ℃,時間為9 h時,所獲得的活性蛋白量最高,因此可作為后續(xù)研究DehI的誘導(dǎo)表達條件.

        圖3 不同誘導(dǎo)組酶催化活性

        3 結(jié) 論

        本研究對DL-2-鹵代酸脫鹵酶DehI進行了蛋白的異源表達優(yōu)化.研究發(fā)現(xiàn),在菌液OD600 nm為0.8,30 ℃,0.2 mmol/L IPTG,180 r/min,誘導(dǎo)9 h 條件下,DehI蛋白可溶性最好,活性最高,為后續(xù)獲得大量DehI活性蛋白及其構(gòu)效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ).

        猜你喜歡
        丙酸質(zhì)粒條件
        排除多余的條件
        選擇合適的條件
        短乳桿菌天然質(zhì)粒分類
        食品科學(2018年10期)2018-05-23 01:27:28
        為什么夏天的雨最多
        食品中丙酸鈉、丙酸鈣測定方法的改進
        K/γ-Al2O3催化丙酸甲酯合成甲基丙烯酸甲酯
        化工進展(2015年3期)2015-11-11 09:07:41
        重組質(zhì)粒rAd-EGF構(gòu)建并轉(zhuǎn)染hDPSCs對其增殖的影響
        2-18F-氟丙酸在正常小鼠體內(nèi)的生物學分布
        Survivin-siRNA重組質(zhì)粒對人神經(jīng)母細胞瘤細胞SH-SY5Y的作用
        BAG4過表達重組質(zhì)粒構(gòu)建及轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌SW480細胞的鑒定
        国产无套护士在线观看| 女同一区二区三区在线观看| 成人影院在线视频免费观看| 人妻哺乳奶头奶水| 欧美日本日韩aⅴ在线视频| 国产码欧美日韩高清综合一区| 五月激情在线观看视频| 国产成人精品无码免费看| 欧洲女人性开放免费网站| 欧美亚洲综合激情在线| 欧美aa大片免费观看视频| 亚洲影院天堂中文av色| 综合图区亚洲另类偷窥 | 日本一区二区三区光视频 | 亚洲精品无码精品mv在线观看| 精品无码日韩一区二区三区不卡 | 国产精品亚洲一区二区麻豆| 国产伦精品一区二区三区妓女| 97se在线| 日韩精品中文字幕免费人妻| 国产变态av一区二区三区调教 | 日本护士一区二区三区高清热线| 中文字幕中文字幕777| 丰满人妻一区二区三区蜜桃| 亚洲成av人在线播放无码| 艳妇乳肉豪妇荡乳av无码福利| 成人国产在线播放自拍| 极品少妇高潮在线观看| 色偷偷久久久精品亚洲| 女性女同性aⅴ免费观女性恋 | 国产一区二区精品网站看黄| 网红尤物泛滥白浆正在播放| 产美女被爽到高潮免费a| 狂野欧美性猛xxxx乱大交| 国产一区二区在线视频| 日本手机在线| 亚洲国产91精品一区二区| 中文无码成人免费视频在线观看| 精品性影院一区二区三区内射| 少妇被爽到自拍高潮在线观看| 亚洲成人中文字幕在线视频|