王亞月,董超群,靳志遠,張萌萌,裴冬麗
(商丘師范學院 生物與食品學院,河南 商丘 476000)
含鹵有機物在醫(yī)學和化學領(lǐng)域發(fā)揮著舉足輕重的作用,被廣泛用于除草劑、殺蟲劑、抗生素、藥品、塑料制品及有機合成中間體,然而由于這類化合物的不當使用,導(dǎo)致有機鹵化物在環(huán)境中積累.由于很多鹵代物具有“致癌、致畸、致突變”效應(yīng)[1],其在用于生產(chǎn)活動的同時給環(huán)境和人類帶來嚴重的危害.因此,對有機鹵代物脫鹵的研究具有重要意義.
微生物作為自然界中主要分解者,將復(fù)雜的有機物轉(zhuǎn)化為簡單的化合物,從而保持生命元素的循環(huán)往復(fù).生長在被有機鹵代物污染的環(huán)境中的微生物具有轉(zhuǎn)化這些化合物的能力,即其細胞內(nèi)存在催化脫鹵作用的酶,這類酶被稱為脫鹵酶.DL-2-鹵代酸脫鹵酶(2-haloacid dehalogenase)j 催化裂解鹵代酸中碳-鹵鍵斷裂的一類酶,使之脫去鹵素原子,并產(chǎn)生所對應(yīng)的2-羥基羧酸化合物[2].2-鹵代酸脫鹵酶具有反應(yīng)底物廣譜性和高效的立體選擇性,并且在催化水解反應(yīng)中無需添加還原劑,因而在環(huán)境修復(fù)與化工合成領(lǐng)域具有巨大應(yīng)用價值.如可制備手性羥基酸與鹵代酸,用作農(nóng)藥、醫(yī)藥及化工合成的中間體[3-6].
目前已報道的DL-2-鹵代酸脫鹵酶相對較少,包括分離自Pseudomonassp.113的DL-DEX 113,PseudomonasputidaPP3的DehI與Methylobacteriumsp.CPA1的DL-DEX Mb[7-9].天然酶的表達量通常很低,從而限制了改酶的應(yīng)用及深入研究.本研究以分離自P.putidaPP3 菌株的DL-2-鹵代酸脫鹵酶DehI為研究對象,通過將構(gòu)建成功的DehI-pET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入EscherichiacoliBL21(DE3),進行原核表達,為獲得較多可溶性表達蛋白,并對其表達條件進行優(yōu)化.以為進一步研究改酶的對映體選擇性機制和改造奠定基礎(chǔ).
1.1.1 菌株和質(zhì)粒
DehI-pET28a重組質(zhì)粒,E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞.
1.1.2 主要試劑
氯化鈣(Sigma-aldrich,Germany ),異丙基硫代半乳糖苷IPTG(Takara,北京),卡那霉素(上海生工),L-2-氯丙酸(上海梯希愛),丙烯酰胺(上海生工),甲叉-雙丙烯酰胺(上海生工).
1.1.3 培養(yǎng)基
LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L(用1 mol/L的NaOH調(diào)至pH=7.5,121 ℃,滅菌20 min);LB固體培養(yǎng)基則是在上述基礎(chǔ)上加入18 g/L瓊脂.
1.2.1 構(gòu)建DehI原核表達載體
將前期構(gòu)建成功的DehI-pET28a重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞.
1.2.2 DehI表達條件優(yōu)化
表1 DehI表達條件優(yōu)化
續(xù)表1
如表1,分別從IPTG濃度,IPTG加入時間,IPTG誘導(dǎo)時間與誘導(dǎo)溫度4個因素方面進行優(yōu)化,設(shè)置因素水平,IPTG濃度分別為0.1 mmol/L,0.2 mmol/L,0.5 mmol/L,0.7 mmol/L與1 mmol/L;IPTG加入時間分別是OD600 nm為0.3,0.5,0.6,0.8,0.9,1時加入;IPTG誘導(dǎo)時間分別為3 h,5 h,7 h,9 h與12 h;誘導(dǎo)溫度分別為15 ℃,20 ℃,25 ℃,30 ℃與37 ℃.基于隨機區(qū)組理論基礎(chǔ),使用Design-expert軟件對DehI誘導(dǎo)表達條件進行組合,共獲得30個誘導(dǎo)條件組合(表1).
取活化的重組菌株菌液0.5 mL轉(zhuǎn)移至50 mL含50 μg/mL 卡那霉素的LB培養(yǎng)基,37 ℃,220 r/min培養(yǎng)至表1中每個誘導(dǎo)組對應(yīng)OD600nm,調(diào)至轉(zhuǎn)速為180 r/min,并置于表1中相應(yīng)條件下進行誘導(dǎo)表達.誘導(dǎo)結(jié)束后,于8000 r/min,4 ℃,離心30 min收集菌體,-80 ℃凍存?zhèn)溆?
1.2.3 粗酶液制備
取凍存的菌體,重懸于5 mL預(yù)冷的裂解緩沖液(50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4,pH=8.0)中,冰浴條件下超聲破碎(200 W,工作2 s,間隙2 s,120循環(huán)).12000 r/min,4 ℃,離心30 min,收集上清,即為粗酶液.
1.2.4 表達產(chǎn)物SDS-PAGE分析
通過 SDS-PAGE 方法鑒定不同組合條件下蛋白表達情況[10].取粗酶液45 μL,加入5 μL上樣緩沖液,混勻,煮沸10 min,運用12% SDS-PAGE進行電泳,結(jié)束后使用考馬斯亮藍G-250染液染色,經(jīng)脫色后,觀察蛋白條帶顏色深淺判斷DehI表達水平.
1.2.5 酶活性分析
反應(yīng)體系1 mL,包括:10 mmol/L L-2-氯丙酸,100 mmol/L,pH10甘氨酸-NaOH,200μL待測酶液,在30 ℃水浴中反應(yīng)30 min,加入1%(v/v)的濃磷酸(85% w/w)終止反應(yīng).12000 r/min,離心10 min去除沉淀.通過HPLC檢測氯丙酸的減少確定酶活性[11].酶活單位(U)定義為:每分鐘催化轉(zhuǎn)化1 μmol 氯丙酸所需要的酶量.
注:M,純化的DehI蛋白.圖1 誘導(dǎo)組合1-17條件下重組蛋白表達產(chǎn)物 SDS-PAGE圖
注:M,純化的DehI蛋白.圖2 誘導(dǎo)組合18-30條件下重組蛋白表達產(chǎn)物SDS-PAGE圖
通過SDS-PAGE檢測不同誘導(dǎo)條件組合下蛋白表達量.如圖1和圖2所示,不同誘導(dǎo)組合條件下均獲得可溶性表達,蛋白表達量不盡相同.誘導(dǎo)組合3,7,8,9,12,15,16,20,21,27與28條件下獲得的蛋白表達量較高.其中,誘導(dǎo)組合3,8與16條件下蛋白條帶顏色最深,蛋白量相對較多,即誘導(dǎo)條件3:細胞OD600nm值為0.8,IPTG濃度為0.2 mM,誘導(dǎo)溫度為30 ℃,誘導(dǎo)時間為9 h;誘導(dǎo)條件8:細胞OD600nm值為0.6,IPTG濃度為0.1 mM,誘導(dǎo)溫度為25 ℃,誘導(dǎo)時間為7 h;誘導(dǎo)條件16:細胞OD600nm值為0.5,IPTG濃度為0.7 mM,誘導(dǎo)溫度為30 ℃,誘導(dǎo)時間為5 h;這3種組合下的誘導(dǎo)條件可作為DehI重組蛋白的表達條件.
考慮到SDS-PAGE操作過程中的誤差,進一步分析了不同組合誘導(dǎo)條件下獲得的粗酶液活性.如圖3所示,通過對不同組合酶活性分析,發(fā)現(xiàn)第3組誘導(dǎo)條件下所獲得的DehI催化活性最高為1.36 U/mL粗酶液,與常用誘導(dǎo)表達條件(OD600 nm為0.5,0.5 mM IPTG,37 ℃誘導(dǎo)4 h)相比提高7.6倍;其次是第16組與第20組,催化活性分別是0.90 U/mL與0.75 U/mL粗酶液,與SDS-PAGE結(jié)果一致.綜上可知:第3組誘導(dǎo)條件即菌液OD600 nm為0.8,IPTG終濃度為0.2 mM,溫度為30 ℃,時間為9 h時,所獲得的活性蛋白量最高,因此可作為后續(xù)研究DehI的誘導(dǎo)表達條件.
圖3 不同誘導(dǎo)組酶催化活性
本研究對DL-2-鹵代酸脫鹵酶DehI進行了蛋白的異源表達優(yōu)化.研究發(fā)現(xiàn),在菌液OD600 nm為0.8,30 ℃,0.2 mmol/L IPTG,180 r/min,誘導(dǎo)9 h 條件下,DehI蛋白可溶性最好,活性最高,為后續(xù)獲得大量DehI活性蛋白及其構(gòu)效關(guān)系研究奠定基礎(chǔ).