張蕊萌，蘇 新，李 鈺，包曉曼，沈明花

（延邊大學，吉林延吉 133002）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球約有11 億吸煙者，預計2025 年將增加到13 億，每年約有600 萬人因吸煙而死亡[1]，2017 年包括二手煙在內的與吸煙有關的肺部疾病死亡人數(shù)為330 萬[2]。吸煙可以導致機體免疫力下降，是引發(fā)心腦血管以及呼吸系統(tǒng)等疾病的公認危險因素。尼古丁是傳統(tǒng)香煙和電子煙中主要致癮成分，是吸煙所致肺損傷的主要因素之一，研究表明它可以通過誘導炎癥反應和氧化應激引起肺組織損傷[3-5]。在COVID-19 疫情的研究過程中發(fā)現(xiàn)，吸煙是導致COVID-19 病情惡化的危險因素之一，吸煙者COVID-19 病情惡化幾率是不吸煙者的1.91 倍[6]。由此可見，吸煙對人體危害不容小覷。

榛蘑，學名蜜環(huán)菌（Armillariella mellea）是一種藥食同源的真菌，屬真菌界、真菌門、擔子菌亞門、白蘑科、蜜環(huán)菌屬，具有抗炎[7]、抗氧化[8]、免疫調節(jié)[9]等多種藥理活性。據(jù)文獻報道，假蜜環(huán)菌多糖可以減輕糖尿病腎病小鼠的炎癥因子水平[10]；吳軍等[11]通過臨床試驗表明，蜜環(huán)菌多糖可通過提高肺癌患者抗氧化酶活力，減少脂質過氧化代謝產物的產生，起到抑制腫瘤作用。然而，尚未見到榛蘑多糖對尼古丁誘導肺損傷相關機制的報道。本課題組前期研究表明，榛蘑多糖可通過抗炎作用減輕脂多糖誘導的大鼠急性肺損傷[12]，通過抗氧化作用減輕三氯化鐵誘導的大鼠動脈內皮損傷[13]。研究表明，尼古丁的致病機制與炎癥和氧化應激有關[5,14]，尼古丁誘導后小鼠肺組織損傷程度及NF-κB 蛋白表達水平明顯高于正常小鼠[15]。榛蘑多糖具有抗炎和抗氧化作用，由此可推測榛蘑多糖可能對尼古丁所致肺損傷有保護作用。因此，本實驗以尼古丁建立大鼠肺損傷模型，觀察榛蘑多糖對尼古丁所致大鼠肺損傷的保護作用并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SD 大鼠（清潔級）32 只，雌雄參半，體重（200±20）g，由延邊大學動物實驗中心提供。合格證號為SCXK（吉）2011～0007；榛蘑 延吉市西市場；尼古丁（N-008）Sigma-Aldrich；TNF-αELISA（F04299）、IL-1βELISA（F12783）、IL-6 ELISA（F03869）上海研謹生物科技公司；MDA 檢測試劑盒（A003-1-2）、SOD 檢測試劑（A001-3-2）南京建成有限公司；NFκB 抗體（8242S）、p-NF-κB 抗體（13346S）Abcam；Nrf2 抗體（sc-365949）、HO-1 抗體（sc-390991）Santa Cruz；β-actin 抗體（bs-0061R）北京博奧森；Lamin B 抗體（WL01775）沈陽萬類生物科技有限公司；核蛋白提取試劑盒（R0050）Solarbio。

冷凍離心機 德國Eppendorf；電泳儀、DYY-7C 型電泳槽 北京六一生物科技有限公司；UVp 凝膠成像分析儀（CA 91786）美國ITVp 公司；酶標分析儀（RT-6000）深圳雷杜生命科學股份有限公司；紫外可見分光光度計（TU-1810）北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 榛蘑多糖制備 榛蘑烘干后加入15 倍的蒸餾水，80 ℃水浴中浸提2 h 后過濾并收集濾液。再向殘渣中加入10 倍量蒸餾水，重復上述操作，合并兩次濾液并離心。將上清液進行加熱濃縮后用80%的乙醇將其沉淀。用無水乙醇反復洗滌沉淀至不再黏稠的顆粒狀。將洗液進行抽濾，所得沉淀干燥至恒質量。再將其配制成10%水溶液，用三氯醋酸沉淀蛋白質，收集上清。再次用80%的乙醇將多糖沉淀，收集沉淀用無水乙醇反復洗滌至不再黏稠的顆粒狀，真空抽濾并加入丙酮清洗，所得沉淀干燥后即得到榛蘑多糖，產率為2.2%[16]。

1.2.2 動物分組及處理 32 只SD 大鼠（清潔級），雌雄各半，體重在（200±20）g。適應性飼養(yǎng)一周后，將其隨機分成四組，分別為對照組，模型組，榛蘑多糖低、高劑量組。每日9:00，除對照組外的其余各組腹腔注射尼古丁2 mg/kg 體質量，對照組腹腔注射等量生理鹽水。每日14:00，榛蘑多糖低、高劑量組分別灌胃榛蘑多糖200、400 mg/kg 體質量，對照組、模型組灌胃等量生理鹽水。連續(xù)四周，最后一次給藥后禁食、禁水12 h。次日，烏拉坦麻醉大鼠，采集心臟血制備血漿，用于生化指標的檢測。取大鼠肺組織進行蛋白免疫印跡實驗及形態(tài)學觀察。

1.2.3 肺組織形態(tài)學觀察 取適當大小肺組織切塊，于4%多聚甲醛中固定24 h 后，經乙醇脫水、石蠟包埋、切片等操作后，進行HE 染色。于光學電子顯微鏡下拍照觀察。

1.2.4 血漿生化指標檢測 將血液采集到枸櫞酸鈉抗凝管內，置于4 ℃冰箱沉降2 h，3000 r/min 離心15 min，收集上層血漿。按試劑盒說明書檢測血漿中TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA 含量以及SOD 活力。

1.2.5 蛋白表達水平檢測 稱取肺組織，在冰上剪碎后收集到研磨器中，每50 mg 組織加入500 μL PBS，在冰上研磨成細胞懸液，收集到1.5 mL 離心管中，500 g 離心3 min，棄掉上清液，加入胞漿蛋白抽提試劑，高速渦旋15 s，置于冰上裂解10 min，然后于4 ℃，12000×g 離心10 min，上清液即為胞漿蛋白，沉淀為細胞核，向細胞核中加入核蛋白抽提試劑，高速渦旋15 s，置于冰上裂解10 min，然后于4 ℃，12000×g 離心10 min，上清液即為核蛋白。蛋白提取后，按照BCA 試劑盒說明書進行蛋白定量。蛋白變性后，取30 μg 蛋白樣品，經電泳、轉膜、5%脫脂奶粉封閉（室溫1 h）、一抗孵育（4 ℃過夜）、次日二抗孵育（室溫2 h）后，通過凝膠成像儀獲取圖像并分析。通過胞漿蛋白觀察Nrf2、HO-1、NF-κB 蛋白水平，核蛋白觀察p-NF-κB 蛋白表達情況。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 榛蘑多糖對大鼠肺組織形態(tài)的影響

圖1 所示，對照組肺泡組織結構完整，肺泡腔輪廓清晰。與對照組相比，模型組肺泡結構被破壞，肺泡間隔明顯增寬，呈實質性病變，周圍肺泡間隔斷裂，肺泡間質水腫，有炎性滲出液，可見出血及微血栓形成。與模型組相比，榛蘑多糖低、高劑量組肺泡間隔增寬程度減輕，肺間質水腫不明顯，有少量炎性滲出液，未見微血栓形成，肺組織結構有所改善。表明榛蘑多糖可以減輕尼古丁所致的大鼠肺組織損傷。

圖1 榛蘑多糖對大鼠肺組織形態(tài)學影響（HE，100×）Fig.1 Effect of Armillaria mellea polysaccharides on lung histomorphology in rats (HE,100×)

2.2 榛蘑多糖對血漿TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平的影響

表1 所示，與對照組相比，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平極顯著增高（P＜0.01）。與模型組相比，榛蘑多糖低劑量組TNF-α、IL-1β水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），榛蘑多糖高劑量組TNF-α、IL-1β、IL-6 水平極顯著降低（P＜0.01），這就提示榛蘑多糖抑制尼古丁誘導的炎癥反應。據(jù)報道，尼古丁可誘導炎癥反應，促使多種炎癥介質（如TNF-α、IL-1β等）的合成和釋放，并導致肺部疾病的發(fā)生[17-18]。TNF-α、IL-1β、IL-6 作為促炎因子，TNF-α可破壞上皮屏障；IL-1β可引起組織損傷；IL-6 參與招募和激活中性粒細胞的過程[19]。Qiu 等[20]研究結果表明，桃葉珊瑚苷通過降低TNF-α、IL-1β等炎癥因子水平來減輕肺組織損傷，這與本實驗結果相符。

表1 榛蘑多糖對血漿TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平的影響Table 1 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on plasma levels of TNF-α,IL-1β and IL-6

2.3 榛蘑多糖對血漿MDA、SOD 水平的影響

表2 所示，與對照組相比，模型組MDA 水平明顯升高、SOD 活力顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組相比，榛蘑多糖高劑量組MDA 水平降低、SOD 活力增強（P＜0.05）。據(jù)報道，尼古丁可引起機體抗氧化能力的下降，從而使脂質過氧化代謝產物MDA 水平增加[14]。An 等[21]研究表明蜜環(huán)菌多糖通過提高SOD 等抗氧化酶活性，清除自由基。這與本實驗結果相一致。

表2 榛蘑多糖對血漿MDA、SOD 水平的影響Table 2 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on plasma levels of MDA and SOD

2.4 榛蘑多糖對大鼠肺組織p-NF-κB 水平的影響

圖2 所示，與對照組相比，尼古丁作用后p-NFκB 蛋白水平明顯升高。與模型組相比，榛蘑多糖高劑量組p-NF-κB 蛋白水平極顯著降低（P＜0.01）。提示榛蘑多糖可能通過抑制NF-κB 信號通路的激活減輕尼古丁所致的大鼠肺組織損傷。

圖2 榛蘑多糖對大鼠肺組織p-NF-κB 水平的影響Fig.2 Effects of Armillaria mellea polysaccharides on p-NF-κB level in rat lung tissue

2.5 榛蘑多糖對肺組織Nrf2，HO-1 蛋白表達的影響

圖3、圖4 所示，與對照組相比，模型組Nrf2、HO-1 水平極顯著下降（P＜0.01）。與模型組相比，榛蘑多糖低劑量組HO-1 水平極顯著升高（P＜0.01），榛蘑多糖高劑量組Nrf2、HO-1 水平極顯著升高（P＜0.01）。提示榛蘑多糖可能通過Nrf2、HO-1 信號通路減輕尼古丁所致的大鼠肺損傷。

圖3 榛蘑多糖對肺組織Nrf2 蛋白表達的影響Fig.3 Effect of Armillaria mellea polysaccharides on Nrf2 protein expression in lung tissue

圖4 榛蘑多糖對肺組織HO-1 蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Armillaria mellea polysaccharides on HO-1 protein expression in lung tissue

3 討論與結論

氧化應激是氧化與抗氧化作用失衡的狀態(tài)，氧化應激發(fā)生時自由基的過量產生會導致組織損傷[22]。尼古丁是煙草中的一種精神活性生物堿，從一些可食用植物中提取，低劑量的尼古丁對多種疾病有保護作用，然而大劑量的尼古丁會引起氧化應激、炎癥等反應[14]。本實驗以2mg/kg 尼古丁建立大鼠肺損傷模型，研究結果顯示，榛蘑多糖干預后，減輕尼古丁所致的大鼠肺損傷；降低血漿TNF-α、IL-6、IL-1β以及MDA 水平，提高SOD 活力。這就提示，榛蘑多糖對尼古丁誘導的炎癥反應、氧化應激有抵抗作用，可以改善肺組織損傷。由于NF-κB 是調控炎癥反應的關鍵轉錄因子[23]，Nrf2/ARE 信號通路是一種對氧化應激極為敏感的信號軸，參與調節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)、炎癥因子釋放等功能[24-25]，所以為探討榛蘑多糖對尼古丁所致肺組織損傷的保護機制，我們進一步觀察了它對NF-κB 信號通路和Nrf2/HO-1 信號通路的調控作用。

NF-κB 是細胞內重要的轉錄因子，調控炎癥反應[23]。生理狀態(tài)下，NF-κB 與I-κB 結合位于細胞質中；當炎癥反應發(fā)生時，I-κB 蛋白被磷酸化，隨后被泛素連接酶識別并降解，促進NF-κB 易位至細胞核，誘導參與炎癥反應的細胞因子（如TNF-α、IL-1β和IL-6 等）產生[26-27]。本研究結果表明，尼古丁作用后肺組織NF-κB 蛋白磷酸化水平上調，炎癥因子TNFα、IL-6、IL-1β水平增高。榛蘑多糖干預后，逆轉了NF-κB 蛋白磷酸化水平的上調，以及TNF-α、IL-6、IL-1β水平的增高，從而抑制尼古丁誘導的炎癥反應。提示榛蘑多糖可能通過調控NF-κB 信號通路，減少炎癥因子的釋放，從而減輕大鼠肺組織損傷。劉雪等[28]研究表明榆干離褶傘溶栓酶可下調NF-κB蛋白水平，抑制炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）的釋放，減輕大鼠炎性損傷，這與本實驗結果相符。

Nrf2 是調節(jié)細胞氧化應激反應的重要轉錄因子，生理狀態(tài)下，Nrf2 與其抑制因子Keap1（Kelchlike ECH-associated protein-1）結合成非活性復合物，被固定在胞質肌動蛋白細胞骨架上，在Keap1 功能結構域BTB 和IVR 區(qū)共同參與下經Cullin3/Rbx1 E3泛素化降解，從而維持其濃度的穩(wěn)定；當氧化應激發(fā)生時，Keap1 中的SH-1 基團構象改變，使兩者解偶聯(lián)，Nrf2 進入細胞核內與Maf 蛋白形成異二聚體后，結合抗氧化反應元件ARE，調節(jié)過氧化氫酶及II 相解毒酶（如，HO-1）等靶基因的表達，從而清除ROS 等有害物質[29-30]。本研究結果顯示，榛蘑多糖可能通過上調Nrf2、HO-1 蛋白水平，提高SOD 活力，減少MDA 的含量，從而降低氧化應激程度，減輕肺組織損傷。Nrf2 除涉及氧化應激外，對炎癥反應也具有調控作用[24-25]。謝璟儀[31]研究結果顯示，健脾清花顆?？梢酝ㄟ^上調Nrf2 的表達，抑制NFκB 信號通路改善脾虛濕熱證大鼠食管粘膜屏障功能。Qiu 等[20]研究結果也表明，桃葉珊瑚苷可以通過上調Nrf2 蛋白的表達，抑制NF-κB 信號通路減少促炎細胞因子的釋放。這與本實驗結果一致，且進一步表明榛蘑多糖可能通過上調Nrf2 蛋白的表達抑制NF-κB 信號通路從而減輕大鼠肺組織損傷。

綜上所述，榛蘑多糖具有良好的抗炎、抗氧化作用，可以保護尼古丁誘導的肺組織損傷，這種保護作用可能與它對NF-κB、Nrf2/HO-1 信號通路的調控有關。榛蘑多糖對NF-κB 和Nrf2/HO-1 信號通路之間的相互作用有待進一步研究。