龐文靜，韓慶竹，尤甲甲，李東航，李佩澤，李玥瑩，楊洪江

（工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457）

銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一種機(jī)會(huì)致病菌，可引起人類一系列感染疾病[1]。在某些環(huán)境中，銅綠假單胞菌可污染食物，引起食源性疾病[2]。目前在食品、醫(yī)療領(lǐng)域中常用使用抗生素以達(dá)到對其的治療和預(yù)防作用，然而在臨床分離菌株中，約90%的銅綠假單胞菌對單一抗生素產(chǎn)生了耐藥性，這極大威脅到了人類的公共健康、食品安全及畜禽飼料安全，因此具有宿主特異性的噬菌體療法應(yīng)被重視。

噬菌體（phage）是細(xì)菌病毒，能夠特異性地殺死宿主菌，是一種具有抑菌活性的天然抗菌劑并具有一定的防腐能力[3-5]。噬菌體可特異性裂解多重耐藥性菌株，菌株的耐藥性與噬菌體感染過程無關(guān)，且噬菌體在感染宿主菌的過程中數(shù)量不僅不會(huì)減少，反而會(huì)在宿主菌內(nèi)增多，有較好的抑菌效果[6-8]。目前已分離鑒定多株銅綠假單胞菌噬菌體，其中部分銅綠假單胞菌噬菌體的受體已被發(fā)現(xiàn)，如噬菌體MPK7[9]和D3112[10]的受體為Type IV 菌毛，噬菌體K8[11]、C11[12]、O4[13]、K5[14]、FIZ15[15]、PaP1[16]、PaP3[17]、JG024[18]的受體為LPS。噬菌體具有宿主特異性，很多銅綠假單胞菌噬菌體的受體是脂多糖（LPS），銅綠假單胞菌的LPS 結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，血清型較多，噬菌體識別LPS 特異性較強(qiáng)，因此宿主范圍較窄。為了滿足噬菌體應(yīng)用需求，盡可能多的分離鑒定噬菌體，分析噬菌體受體、基因組功能注釋，此舉將為制備不同噬菌體制劑提供實(shí)驗(yàn)材料[19]。

本實(shí)驗(yàn)室在之前的工作中以P.aeruginosaPAK為指示菌，從公園污泥中分離得到了一株銅綠假單胞菌噬菌體K4[20]。透射電鏡顯示噬菌體K4 具有正二十面體的頭部和可伸縮的尾部。本研究以噬菌體K4 為研究對象，分別對其生物學(xué)特性、基因組學(xué)、比較基因組學(xué)以及在牛奶和午餐肉中的抑菌效率進(jìn)行分析，探討噬菌體K4 在食品安全[10]等領(lǐng)域中控制銅綠假單胞菌污染的可能性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銅綠假單胞菌菌株、噬菌體、質(zhì)粒等 如表1所示；牛奶、午餐肉 購自超市；蛋白胨、酵母浸粉北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉、氫氧化鈉（分析純）天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；硫酸慶大霉素（純度≥590 mcg/mg）北京博奧拓達(dá)科技有限公司；氨芐青霉素鈉（純度≥85%）北京索萊寶科技有限公司。

HZQ-X100 恒溫振蕩培養(yǎng)箱 蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TG16-W 微量高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；LRH-250S 恒溫培養(yǎng)箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Infinite F50 ELISA 酶標(biāo)儀瑞士TECAN 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 噬菌體K4 懸液的制備 培養(yǎng)100 mL 銅綠假單胞菌PAK 至對數(shù)生長期（OD600=0.4），加入109PFU/mL噬菌體K4，于37 ℃條件下振蕩培養(yǎng)4 h，裂解液12000 r/min 離心10 min，上清液再用0.22 μm 濾膜過濾除菌制得噬菌體K4 懸液。

1.2.2 噬菌體K4 的氯仿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取500 μL 噬菌體懸液與500 μL 氯仿充分振蕩后靜置1 h，12000 r/min離心10 min，10-4～10-8系列稀釋的樣品分別與指示菌混合倒雙層平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后噬菌斑計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)液中噬菌體的濃度，測定上清液中噬菌體滴度。

1.2.3 噬菌體K4 的熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 分別取1 mL 滴度為3.84×1010PFU/mL 噬菌體K4 懸液分裝于1.5 mL EP 管中，分別置于30、40、50、60、70、80 ℃的水浴鍋中處理1 h，10-1～10-7梯度稀釋處理后的樣品，測定噬菌體滴度，計(jì)算噬菌體在各個(gè)溫度下的存活率。將30 ℃處理的樣品設(shè)置為對照組。

1.2.4 噬菌體K4 宿主范圍的確定 選擇銅綠假單胞菌野生型PAK 和多株插入突變株（表1），確定宿主范圍。挑取單菌落于LB 培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，制備雙層平板，稀釋噬菌體懸液至108PFU/mL 取1 μL噬菌體稀釋液點(diǎn)板，進(jìn)行spotting 實(shí)驗(yàn)，所用噬菌體K4[20]、K5[14]、K8[11]、O4[13]、C11[12]。

表1 本研究中所用菌株、噬菌體和質(zhì)粒Table 1 Strains,phages and plasmids used in this study

1.2.5 噬菌體K4 基因組的提取及測序 按照文獻(xiàn)[22]提供的方法提取噬菌體基因組，具體為：培養(yǎng)宿主菌PAK 至OD600=0.6，加入噬菌體K4 裂解液，振蕩培養(yǎng)4～5 h，擴(kuò)增噬菌體。

向裂解液中加入氯化鈉，終濃度為0.1 mol/L 冰浴1 h 后，12000 r/min 離心去除沉淀。上清液中加入DNase I 和RNase A 至終濃度均為10 μg/mL，37 ℃靜置1 h，去除宿主菌的DNA 和RNA。上清液中加入聚乙二醇6000（PEG 6000）至終濃度為10%（w/v）充分溶解，4 ℃靜置過夜。

12000 r/min 離心保留沉淀，用2 mL TM 溶液（0.05 mol/L Tris-HCl 與0.2% MgSO4·7H2O 混合，pH 調(diào)至7.0）重懸噬菌體，分別加入DNase I 和RNase A 至終濃度為10 μg/mL，37 ℃靜置1 h。分別加入SDS 和蛋白酶K，終濃度分別為0.5%和50 μg/mL，56 ℃水浴4 h。加入與重懸液等體積的氯仿/異戊醇（24:1），振蕩30 s，12000 r/min 離心10 min，收集上層水相，去除PEG 6000，再用等體積的苯酚-氯仿抽提至無蛋白膜后用氯仿抽提一次，加入2.5 倍體積的95%乙醇，-20 ℃靜置2 h，12000 r/min 離心10 min，用70%乙醇洗滌，干燥后用ddH2O 重懸噬菌體基因組DNA。

將K4 基因組DNA 送至金唯智公司（www.genewiz.com）進(jìn)行測序，測序平臺(tái)為Illumina Hiseq2500。將測序結(jié)果使用Trimmomatic（v0.30）軟件去除低質(zhì)量及接頭序列獲得Clean Data，有4229838 條reads，共計(jì)419367181 bp。使用軟件Velvet_v1.12.10 進(jìn)行組裝拼接，獲得1 條組裝基因組序列，共計(jì)50284 bp。并將該序列保存在NCBI 的GenBank 中，登錄號為MW929175。

1.2.6 噬菌體K4 基因組的功能注釋 使用在線網(wǎng)站RAST Server（https://rast.nmpdr.org/）[23]和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）對噬菌體K4 的基因組進(jìn)行蛋白功能注釋。推定銅綠假單胞菌噬菌體K4 基因組上的編碼基因，將基因編碼的蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行分析比對，推測其蛋白的功能[24]。使用在線軟件CGview Server（http://cgview.ca/）繪制基因組功能注釋圖[25]。

1.2.7 噬菌體K4 的比較基因組分析與分類 利用NCBI 數(shù)據(jù)庫對K4 基因組序列進(jìn)行同源性搜索，獲得與噬菌體K4 同源的噬菌體基因組序列，利用在線軟件Circoletto 分析基因組間的同源性（http://tools.bat.infspire.org/circoletto/）。另一方面，利用在線軟件CoreGenes5.0（https://coregenes.ngrok.io/），分別分析噬菌體K4 與其它噬菌體蛋白質(zhì)組相似的程度。對病毒蛋白編碼基因堿基序列的相似性，其Evalue 小于1e-5 的且覆蓋率大于或等于75%，則判斷為相似。兩個(gè)噬菌體蛋白質(zhì)組中，超過40%的噬菌體蛋白相似，則將兩個(gè)噬菌體分類為同一屬[26-27]。

1.2.8 噬菌體K4 的一步生長曲線 宿主菌培養(yǎng)至OD600=0.6，5000 r/min 離心5 min，收集的宿主菌細(xì)胞重懸于500 μL 液體LB 培養(yǎng)基中，加入等體積噬菌體懸液，使得MOI 約為0.0001，混勻后靜置吸附1 min，12000 r/min 離心30 s，去除上清液，將沉淀重懸于100 mL 新鮮LB 液體培養(yǎng)基中。每隔5 min取樣100 μL，測定噬菌體滴度。

1.2.9 噬菌體K4 的抑菌活性分析 將300 μL 宿主菌PAK 以3%轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接至含有100 mL 液體LB 培養(yǎng)基中，將噬菌體K4（滴度約為3.384×1010PFU/mL）分別控制MOI 在10、1、0.1、0.01、0.001 和0.0001；按照不同MOI，使指示菌與噬菌體混合，取上述混合培養(yǎng)液200 μL 至無菌96 孔板中，每個(gè)MOI 設(shè)置6 個(gè)平行。并加入200 μL 液體LB 培養(yǎng)基作為對照組。將96 孔板置于37 ℃搖床中，160 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，每隔30 min 測量96 孔板中培養(yǎng)物的OD600數(shù)值，測定細(xì)菌濃度，繪制噬菌體抑菌曲線。

1.2.10 噬菌體對牛奶中細(xì)菌的影響 取20 mL 規(guī)格為1×250 mL 的無菌牛奶與20 μL 109CFU/mL 的宿主菌PAK 混勻后，取1.8 mL 混合液分裝于4 mL無菌EP 管中。將用0.22 μm 濾膜過濾處理兩次的噬菌體裂解液系列稀釋，取200 μL 稀釋液與1.8 mL牛奶樣品混勻，使得最終MOI 為1 和10，樣品分別于4 和25 ℃靜置培養(yǎng)24 h。取樣系列稀釋后涂布LB 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)液中的細(xì)菌濃度。系列稀釋的樣品分別與指示菌混合倒雙層平板，37 ℃培養(yǎng)過夜培養(yǎng)后噬菌斑計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)液中噬菌體的濃度。只加噬菌體K4 和只加宿主菌的樣品作為空白對照，每組設(shè)立三個(gè)平行。

1.2.11 噬菌體對午餐肉中細(xì)菌的影響 將340 g/罐的無菌午餐肉罐頭切成1.5 cm×1.5 cm 的小方塊，然后放于30×40 mm，體積為20 mL 的無菌取樣瓶中。取10 μL 宿主菌PAK 滴加到午餐肉切塊表面（菌濃為106CFU/mL）。分別取10 μL 噬菌體裂解液（滴度約為3.38×108和3.38×109PFU/mL），以MOI為1 和10 滴加到午餐肉表面，樣品分別于4 和25 ℃靜置培養(yǎng)24 h。取樣系列稀釋后涂布LB 平板，37 ℃培養(yǎng)過夜培養(yǎng)后菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)液中的細(xì)菌濃度。系列稀釋的樣品分別與指示菌混合倒雙層平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后噬菌斑計(jì)數(shù)，計(jì)算培養(yǎng)液中噬菌體的濃度。只加噬菌體K4 和只加宿主菌的樣品作為空白對照，每組設(shè)立三個(gè)平行。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中每組數(shù)據(jù)均為3 次重復(fù)，利用Student ttest 進(jìn)行組間數(shù)據(jù)分析，采用Excel 2016 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體K4 的穩(wěn)定性分析

噬菌體在氯仿中的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明：在滴度為3.84×1010PFU/mL 的噬菌體K4 裂解液中加入氯仿，結(jié)果如圖1A 所示，噬菌體滴度降至1.6×1010PFU/mL，存活率為42%，其氯仿的耐受程度高于噬菌體PA-27-1[28]、PaP6[29]、PHW2[30]等銅綠假單胞菌噬菌體。

噬菌體在不同溫度下的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明：滴度為3.84×1010PFU/mL 的噬菌體K4 分別在30、40、50、60、70、80 ℃培養(yǎng)1 h 后，測定噬菌體滴度變化如圖1B 所示。在32～50 ℃噬菌體滴度輕微下降，50 ℃時(shí)存活率為74.12%，60 ℃時(shí)存活率為28.10%，70 ℃時(shí)存活率僅為1.10%，80 ℃幾乎檢測不到噬菌體，噬菌體K4 與噬菌體D204[31]、PaP3[32]、PA-YS35[33]的溫度敏感性相似，即在30～60 ℃溫度范圍內(nèi)較穩(wěn)定，60 ℃以上噬菌體數(shù)量急劇下降。綜上所述，該噬菌體易于制備、儲(chǔ)存及運(yùn)輸，為在食品中應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)材料[34]。

圖1 噬菌體K4 的穩(wěn)定性分析Fig.1 Stability analysis of phage K4

2.2 噬菌體K4 的宿主范圍

為了進(jìn)一步確定噬菌體K4 的受體是否與LPS相關(guān)。本研究分別測定了噬菌體K4[20]作用于噬菌體K8[11]、C11[12]、K5[14]、O4[13]完全耐受突變株M4、SK45（阻斷基因?yàn)閣bpR），M19（阻斷基因?yàn)閣bpT），M25、M30、SK75（阻斷基因?yàn)閣zy），M39、SK16（阻斷基因?yàn)閣bpV），RC11-2（阻斷基因?yàn)锽N889_05221），SK98（阻斷基因?yàn)閟sg）及回復(fù)株的敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表2 所示，噬菌體K4、K5、O4 在除RC11-2 突變株外，均無透明區(qū)域形成，K8、C11 在10 株突變株上均能形成透明區(qū)域；上述噬菌體在10 株突變株的互補(bǔ)株上均出現(xiàn)透明區(qū)域。上述基因均為生物合成O-specific antigen（OSA）的相關(guān)基因，因此本研究推測OSA 為噬菌體K4 的受體。

表2 噬菌體K4 的宿主范圍分析Table 2 Host range of phage K4

2.3 基因組末端的確定

通過Illumina Hiseq2500 對噬菌體K4 進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示組裝基因組大小為50284 bp。將測序結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行BlastN 比對，噬菌體K4與噬菌體O4 有96%同源性，且均為銅綠假單胞菌噬菌體。噬菌體O4 為線性雙鏈DNA，推測噬菌體K4 也為線狀。噬菌體O4 基因組末端存在74 bp 的正向末端重復(fù)序列，比對分析發(fā)現(xiàn)，噬菌體K4 基因組序列的6436～6509 bp 與噬菌體O4 的末端74 bp的重復(fù)序列具有100%同源性，推測其可能為噬菌體K4 的正向末端重復(fù)序列。為了驗(yàn)證噬菌體K4重組基因組結(jié)果的正確性，本研究提取噬菌體K4 基因組，進(jìn)行補(bǔ)平連接和擴(kuò)增，測序后發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物中有兩個(gè)74 bp 的相同序列，為該基因組的真實(shí)末端序列。本文將噬菌體K4 基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行重新調(diào)整，在基因組3'端加上一個(gè)74 bp 的拷貝，修訂后的噬菌體K4 實(shí)際基因組大小為50358 bp。

2.4 基因組功能注釋

噬菌體K4 基因組分別通過RAST Server、CGview Server 在線軟件和NCBI 蛋白數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，選取最優(yōu)匹配結(jié)果作為注釋信息。外環(huán)表正義鏈和負(fù)義鏈上的基因，次外環(huán)表示為GC Skew，計(jì)算公式為（G-C）/（G+C），綠色代表（G-C）/（G+C）＞0，紫色代表（G-C）/（G+C）＜0，內(nèi)環(huán)表示基因組G+C 含量的分布。噬菌體K4 基因組的GC 含量為44.61%，與其他假單胞菌噬菌體相近，其中K8 基因組[11]和K5 基因組[14]的GC 含量為49.35%，O4 基因組[13]的GC 含量為44.55%，而PAK 菌株的GC 含量為66.25%（圖2）。K4 基因組長度為50358 bp，編碼46 個(gè)假定蛋白、31 個(gè)具有假定功能的蛋白以及1 個(gè)tRNA-Arg 基因。噬菌體K4 基因組中蛋白編碼基因包含參與復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、DNA 修復(fù)蛋白、磷代謝的蛋白以及假定蛋白；有22 個(gè)基因位于負(fù)義鏈上，56 個(gè)基因位于正義鏈上。除gp01、gp10、gp45基因僅存在于K4 噬菌體基因組外，其余基因均與其他噬菌體有不同程度的相似性（表3）。

圖2 噬菌體K4 基因組序列的注釋Fig.2 Annotation of the phage K4 genome

表3 噬菌體K4 基因組注釋Table 3 Annotation of the phage K4 genome

噬菌體K4 基因組中g(shù)p51和gp46分別編碼DNA的核酸外切酶，此外噬菌體還攜帶編碼DNA 和RNA聚合酶、DNA 結(jié)合蛋白等基因，在噬菌體復(fù)制及裂解宿主菌發(fā)揮作用。在K4 基因組中，gp01、gp10和gp45等基因編碼的蛋白為假定蛋白，在數(shù)據(jù)庫中沒有發(fā)現(xiàn)同源蛋白，其功能有待于進(jìn)一步研究。噬菌體K4 編碼末端酶大亞基具有核酸內(nèi)切酶活性和拓?fù)涿富钚?，在沒有小亞基的存在的情況下完成噬菌體基因組的包裝[35]。

2.5 比較基因組學(xué)分析與分類

利用BLASTN 軟件，在NCBI 的GENBANK數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，獲得8 個(gè)噬菌體基因組序列，與噬菌體K4 基因組序列具有較高的同源性。噬菌體K4 與噬菌體O4（NC_031274.1）、IME180（MF788 075.1）、TC6（MG676466.1）、PA11（NC_007808.1）、BUCT566（MW748993.1）、MD8（KX198612.1）、LKA5（KC900378.1）和F116（NC-006552.1）的同源性分別為99.53%、98.18%、95.2%、95.08%、71.84%、95.56%、86.27%、86.27%，與之相應(yīng)的覆蓋率分別為96%、94%、85%、82%、1%、0%、0%和0%。分析顯示，噬菌體K4 與噬菌體O4、IME180、TC6、PA11的同源性較高，而與噬菌體LKA5、F116、BUCT566、MD8 覆蓋率極低，幾乎沒有同源性。

如圖3，將這些基因組序列導(dǎo)入線上分析軟件Circoletto，進(jìn)一步分析噬菌體K4 和8 株噬菌體基因組的同源性。圓環(huán)內(nèi)為使用circletto 軟件將比對的序列不同的色帶表示blast 生成的數(shù)據(jù)局部對齊。顏色根據(jù)bitscore 的寬度和對齊長度劃分，相似度不同即絲帶的顏色不同，絲帶顏色表示為最大的命中值，即藍(lán)色≤25%，綠色≤50%，黃色≤75%，紅色＞75%。

圖3 噬菌體比較基因組學(xué)分析Fig.3 Comparative genomic analysis of phage

進(jìn)一步通過CoreGenes5.0 在線軟件分析發(fā)現(xiàn)，噬菌體K4 與噬菌體O4（NC_031274.1）、IME180（MF788075.1）、TC6（MG676466.1）、PA11（NC_007808.1）、共享核心基因的比例分別為85.9%、87.1%、70.5%、70.5%，超過了40%的標(biāo)準(zhǔn)，屬于同一屬的病毒。根據(jù)國際病毒分類委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）（https://talk.ictvonline.org/）發(fā)布的病毒分類清單（ICTV 2020 Master Species List，MSL36）顯示，PA11 屬于Zobellviridae 科Paundecimvirus屬，因此噬菌體K4 可能是該屬的新成員[26-27,36-37]。

2.6 噬菌體K4 的抑菌活性

在MOI 約為10-5時(shí)，噬菌體K4 一步生長曲線的結(jié)果顯示，噬菌體K4 的潛伏期約為15 min，13～28 min 噬菌體滴度急劇增加，此時(shí)為噬菌體的爆發(fā)期，爆發(fā)期后的10 min 內(nèi)噬菌體數(shù)量幾乎無變化，即此時(shí)間段為噬菌體進(jìn)入穩(wěn)定期。根據(jù)釋放量公式：釋放量=平臺(tái)期噬菌體平均滴度/潛伏期噬菌體平均滴度，即此噬菌體釋放量約為95.2 PFU/Infection Center，一個(gè)感染周期約為35 min（圖4A）。

不同MOI 的噬菌體K4 與宿主菌銅綠假單胞菌PAK 混合培養(yǎng)，測定噬菌體K4 作用于PAK 的抑菌曲線。結(jié)果表明，隨著加入的噬菌體效價(jià)的增加，宿主菌銅綠假單胞菌生長趨勢明顯下降，當(dāng)MOI=10 和MOI=1 時(shí)，宿主菌幾乎不生長；當(dāng)MOI=0.00001和0.0001 時(shí)，宿主菌0～2 h 生長趨勢與對照組幾乎一致，2～3 h 之間菌液生長趨勢迅速下降且在3 h 后宿主菌PAK 不繼續(xù)生長（圖4B）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，噬菌體K4 能顯著抑制銅綠假單胞菌PAK 的生長，噬菌體應(yīng)用在食品中控制致病菌將成為一個(gè)熱點(diǎn)和趨勢[38]。

圖4 噬菌體K4 生物學(xué)特性Fig.4 Biological characteristics of phage K4

2.7 噬菌體K4 控制牛奶中細(xì)菌的生長

Donovan 等將噬菌體phi11 應(yīng)用到牛奶中的實(shí)驗(yàn)表明該噬菌可有效控制牛奶中的致病菌[39]。本研究在牛奶中加入銅綠假單胞菌，分析噬菌體K4 的殺菌效果。在4 ℃條件下，對照組中的細(xì)菌濃度為1.31×108CFU/mL，實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌濃度分別為8.08×106CFU/mL（MOI=1）和1.26×108CFU/mL（MOI=10），殺菌效率分別為93.73%和99.02%，殺菌效果顯著。在抑制細(xì)菌增長的同時(shí)，噬菌體由2.20×107PFU/mL分別增長到1.59×109PFU/mL（MOI=1）和4.95×108PFU/mL（MOI=10），分別增長了約71 和22 倍。25 ℃條件下，對照組的細(xì)菌濃度為6.79×108CFU/mL，實(shí)驗(yàn)組細(xì)菌濃度分別為1.41×108CFU/mL（MOI=1）和7.90×106CFU/mL，殺菌效率分別為79.29%和98.84%。與此同時(shí)，噬菌體濃度由1.47×107PFU/mL 分別增長到2.20×109PFU/mL（MOI=1）和2.09×109PFU/mL（MOI=10），噬菌體分別增長了約149 和142 倍（圖5）。結(jié)果顯示，在牛奶中，噬菌體K4 可以有效抑制銅綠假單胞菌的生長。

圖5 在4 和25 °C 條件下不同MOI 的噬菌體在牛奶中的細(xì)菌濃度和噬菌體滴度Fig.5 Colony forming unit and titer of phage with different MOI in milk at 4 and 25 °C

2.8 噬菌體K4 控制午餐肉中細(xì)菌的生長

在午餐切片上涂布銅綠假單胞菌細(xì)胞，分析噬菌體K4 的殺菌效果，在4 ℃條件下，對照組的細(xì)菌濃度為9.30×104CFU/mL。MOI=10 時(shí)，細(xì)菌的濃度為3.40×103CFU/mL 殺菌效率為96.34%，噬菌體由3.30×104PFU/mL 增長到1.44×105PFU/mL，噬菌體增長了約3 倍；當(dāng)MOI=1 時(shí)，細(xì)菌的濃度為1.09×104CFU/mL，殺菌效率為88.28%，噬菌體由3.30×104PFU/mL 增長到2.26×105PFU/mL，增長了約6 倍。在25 ℃條件下，在MOI 分別為1 和10時(shí)，噬菌體的殺菌效率分別為94.89%和99.15%，均能超過90%，殺菌效果顯著，噬菌體分別增長了約33 和78 倍（圖6）。數(shù)據(jù)顯示，在不同條件下，噬菌體K4 可以有效抑制銅綠假單胞菌在午餐肉表面的生長[38,40]。

圖6 在4 和25 °C 條件下不同MOI 的噬菌體在午餐肉中的細(xì)菌濃度和噬菌體滴度Fig.6 Colony forming unit and titer of phage with different MOI in Luncheon meat at 4 and 25 °C

3 結(jié)論

一步生長曲線結(jié)果顯示，該噬菌體具有潛伏期較短、釋放量大的特點(diǎn)，具有較高的感染性。另一方面，噬菌體K4 在抑菌曲線等實(shí)驗(yàn)中，顯示了較強(qiáng)的殺菌活性。其基因組不攜帶重組酶、抗性及毒力因子等編碼基因，具有安全性，能夠有效地控制牛奶和午餐肉等食品中銅綠假單胞菌的生長。因此，噬菌體K4 可以用于食品等行業(yè)控制銅綠假單胞菌的污染。