王坤，王旭，施政良，寧梓文，何任杰，董開顏，李彥林

（昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院運動醫(yī)學科，云南昆明 650031）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis,OA）是一種世界范圍內(nèi)的老年性常見疾病，目前約有2.5 億人受OA 的困擾，是老年人致殘的主要原因之一[1]。迄今尚無藥物可使OA 的病理進程逆轉(zhuǎn)或停止，不能從根本上治愈，致使許多終末期OA 患者不得不通過手術(shù)治療來恢復(fù)關(guān)節(jié)功能和消除疼痛。因此，發(fā)現(xiàn)一種安全、有效的抗OA 藥物是科學界長期研究的熱點與目的。基質(zhì)細胞衍生因子-1（stromal cell derived factor-1,SDF-1）是一種8 kD 趨化因子，其通過與趨化因子受體4（C-X-C chemokine receptor type 4,CXCR4）結(jié)合而發(fā)揮作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)SDF-1/CXCR4 信號通路在OA 患者軟骨退變的病理進程中起關(guān)鍵性作用[2-3]，CXCR4 拮抗劑通過阻斷SDF-1/CXCR4 信號通路而防止OA 患者關(guān)節(jié)軟骨退變[4]，CXCR4 拮抗劑由于具有顯著的延緩關(guān)節(jié)軟骨退變作用而有望成為一種抗OA 藥物。目前研究較多的CXCR4 拮抗劑主要有TN14003、T140 及AMD3100，但關(guān)于這3 種小分子拮抗劑的對比研究甚少。本研究通過對這3 種小分子拮抗劑的比較，旨在找到一種高效、安全的OA 治療藥物。前期實驗研究[5-6]表明，CXCR4 拮抗劑（T140、AMD3100）均具有延緩關(guān)節(jié)軟骨退變的實驗療效，但T140 生物穩(wěn)定性欠佳，而AMD3100 是一種部分拮抗劑，其拮抗效率低于T140[7]。TN14003 是T140 的衍生物，是一種CXCR4受體安全、有效、穩(wěn)定的完全拮抗劑，目前主要用于抗腫瘤、抗人類免疫缺陷病毒（HIV）等方面的研究[8]，但應(yīng)用于OA 方面研究較少。Ⅱ型膠原（CollagenⅡ, ColⅡ）是由軟骨細胞分泌并構(gòu)成關(guān)節(jié)軟骨的主要基質(zhì)，研究認為軟骨細胞內(nèi)ColⅡ的降解往往與OA 病理進程有關(guān)，ColⅡ是量化OA 退變程度和研究抗OA 藥物療效的主要觀察指標。本研究深入比較TN14003、T140、AMD3100 靶向阻斷SDF-1/CXCR4 信號通路對人OA 軟骨細胞ColⅡ的影響，為探尋高效的OA 靶向治療藥物奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 人OA軟骨組織標本獲取

收集昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院2016年1月—2017年1月行膝關(guān)節(jié)置換術(shù)患者截骨后留下的骨表面軟骨組織標本（改良Mankin 評分為0 分或1 分）。收集標準：采用中華醫(yī)學會骨科學分會制訂的《骨關(guān)節(jié)炎診治指南（2007 版）》的膝骨關(guān)節(jié)炎診斷標準[9]，以此標準為參考納入OA 患者。排除標準：化膿性關(guān)節(jié)炎、創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎、痛風性關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎等其他類型關(guān)節(jié)炎。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，軟骨組織標本的采集均獲得患者知情同意。

1.2 主要實驗試劑與儀器

本實驗在昆明醫(yī)科大學生物醫(yī)學工程研究中心完成。TN14003 凍干粉、T140 凍干粉（北京中科亞光生物科技有限公司），AMD3100 凍干粉、SDF-1 凍干粉（美國PeproTech 公司），特級胎牛血清（美國Sigma 公司），Trizol Reagent 總RNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，PrimeScript?RT Reagent Kit 試劑盒、Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（中國大連TaKaRa 公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]，自動溫控細胞培養(yǎng)箱（美國賽默飛世爾科技公司），PCR 儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 人OA軟骨細胞培養(yǎng)及實驗分組

無菌條件下將人OA 軟骨組織塊切成1 mm3的碎塊，采用胰酶聯(lián)合Ⅱ型膠原酶兩步消化法體外培養(yǎng)OA 原代軟骨細胞，用甲苯胺藍染色鑒定。當培養(yǎng)瓶內(nèi)原代軟骨細胞長滿約95%時用胰酶消化并傳代，經(jīng)過第1 次傳代后為P1 代OA 軟骨細胞。由于OA 軟骨細胞多次傳代后容易衰老并失去軟骨細胞生物學特性，因此本實驗選用P1 代OA 軟骨細胞作為實驗細胞。將P1 代OA 軟骨細胞隨機分成A 組、B 組、C 組、D 組，其中，A 組（TN14003 組）1 000 nmol/L TN14003 和100 ng/mL SDF-1； B 組（T140 組）內(nèi)含有1 000 nmol/L T140 和100 ng/mL SDF-1；C 組（AMD3100 組）濃度為1 000 nmol/L AMD3100 和100 ng/mL SDF-1；D 組（SDF-1 組）僅有100 ng/mL SDF-1。各小分子拮抗劑濃度參考TN14003 等小分子拮抗劑的藥理特性及筆者前期研究進行[4]。

1.4 實驗方法

A 組、B 組、C 組分別預(yù)先加入1 000 nmol/L 的TN14003、T140 及AMD3100 拮抗劑1 h，然后4 組同時加入100 ng/mL 的SDF-1，放入37℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4 組細胞每隔4 d 換液1 次，每組細胞培養(yǎng)基為含15%胎牛血清及雙抗（100 u/mL青霉素+0.1 mg/mL 鏈霉素）的高糖DMEM 培養(yǎng)基。

1.4.1 qRT-PCR檢測4 組細胞在加藥干預(yù)培養(yǎng)第2 天、第4 天時進行qRT-PCR 檢測，按以下步驟進行，并重復(fù)3 次。Trizol 提取OA 軟骨細胞總RNA，RNA 變性電泳觀察18 s、28 s 條帶，用紫外分光光度計分別在波長為260 nm 和280 nm 處檢測吸光度，260/280 nm 吸光度比值為1.8～2.0。取該比值區(qū)間的RNA 進行后續(xù)實驗。待檢測RNA 純度和濃度符合上述標準后，參照Prime Script?RT Reagent Kit 試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)引物設(shè)計原則，使用Primers Express Software 軟件設(shè)計各基因引物，委托安徽通用生物公司合成各基因引物。實驗過程參照Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明書操作，擴增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 min，95℃變性10 s，60℃退火30 s，60℃延伸30 s，共40 個循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參對照，計算目的基因ColⅡmRNA相對表達量（2-ΔΔCt）。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.2 Western blotting 檢測4 組細胞在加藥干預(yù)培養(yǎng)第2 天、第4 天時用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3 次后進行Western blotting 檢測。首先用RIPA 裂解液提取各組軟骨細胞總蛋白，然后用BCA 法測定總蛋白濃度，計算上樣緩沖液中總蛋白含量并使各組總蛋白水平相等。在濃縮膠上進行SDS-PAGE 電泳30 min 至樣本到分離膠上，繼續(xù)用分離膠將樣本蛋白質(zhì)進行分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF 膜進行抗原抗體雜交反應(yīng)。將轉(zhuǎn)膜后的PVDF 膜浸入5%的脫脂奶粉室溫下封閉1 h，用TBST 緩沖液洗滌后加入一抗（鼠抗人ColⅡ單克隆抗體，1∶2 000）并旋轉(zhuǎn)搖動4℃過夜，再次用TBST 洗滌后加二抗（羊抗鼠IgG，1∶5 000）并室溫下孵育2 h。在暗室內(nèi)加入免疫印跡化學發(fā)光試劑曝光顯影，圖像分析軟件（Image J）進行目標蛋白和β-actin 的光密度測定，用目標條帶與β-actin 光密度比值反映蛋白相對表達量。

1.4.3 ColⅡ免疫組織化學染色在6 孔板內(nèi)預(yù)先放置無菌蓋玻片，每孔內(nèi)加入0.5×105個/mL 的細胞懸液2 mL 進行細胞爬片，2 d 后用PBS 洗2 次，再加入藥物進行干預(yù)，在培養(yǎng)至第10 天時收集細胞爬片進行ColⅡ免疫組織化學染色。具體染色步驟如下：首先將細胞爬片用4%多聚甲醛室溫下固定以便于保存細胞形態(tài)，然后用0.5% Triton 室溫穿孔利于染色，接下來用甲醇+30% H2O2溶液（50∶1）室溫下避光封閉及5%山羊血清（BSA）室溫下封閉以阻斷非特異位點，加入5%BSA 稀釋的一抗（兔抗人ColⅡ單克隆抗體，1∶100）和生物素化二抗（羊抗兔IgG）進行抗原抗體反應(yīng)，最后用DAB 染色液室溫下顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，經(jīng)脫水、透明及封固處理后，倒置光學顯微鏡下觀察，細胞內(nèi)呈棕褐色為陽性染色。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組比較用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，進一步兩兩比較用SNK-q法。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組軟骨細胞ColⅡmRNA 相對表達量的比較

A 組、B 組、C 組、D 組軟骨細胞在第2 天、第4 天時ColⅡmRNA 相對表達量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間軟骨細胞ColⅡmRNA 相對表達量有差異（F=37.080，P=0.000）；②4 組軟骨細胞ColⅡmRNA 相對表達量有差異（F=587.799，P=0.000）；③4 組軟骨細胞ColⅡmRNA 相對表達量變化趨勢有差異（F=4.290，P=0.044）。進一步行兩兩比較，A 組軟骨細胞ColⅡmRNA 相對表達量高于B 組、C 組、D 組（P<0.05），且C 組低于B 組（P<0.05），D 組低于C 組（P<0.05）；隨著時間延長，各組軟骨細胞ColⅡmRNA 相對表達量逐步減弱（P<0.05），A 組減弱程度相對較小。見表2。

表2 各組軟骨細胞ColⅡmRNA相對表達量的比較 （±s）

表2 各組軟骨細胞ColⅡmRNA相對表達量的比較 （±s）

注：①與B組比較，P<0.05；②與C組比較，P<0.05；③與D組比較，P<0.05；④與第2天比較，P<0.05。

第4天1.25±0.17①②③④0.62±0.03②③④0.37±0.04③④0.04±0.03④組別A組B組C組D組第2天1.35±0.09①②③1.08±0.06②③0.53±0.03③0.24±0.02

2.2 各組軟骨細胞ColⅡ蛋白相對表達量的比較

A 組、B 組、C 組、D 組軟骨細胞第2 天、第4 天ColⅡ蛋白相對表達量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間軟骨細胞ColⅡ蛋白相對表達量有差異（F=669.597，P=0.000）；②4 組軟骨細胞Col Ⅱ蛋白相對表達量有差異（F=122.315，P=0.000）；③4 組軟骨細胞ColⅡ蛋白相對表達量變化趨勢有差異（F=47.708，P=0.000）。進一步行兩兩比較，A 組軟骨細胞第2 天時ColⅡ蛋白相對表達量高于B 組、C 組、D 組（P<0.05），且C 組、D 組低于B 組（P<0.05）；A 組軟骨細胞第4 天時ColⅡ蛋白相對表達量高于B、C、D 組（P<0.05），且C 組低于B 組（P<0.05），D 組低于C 組（P<0.05）；隨著時間延長，各組軟骨細胞ColⅡ蛋白相對表達量減弱（P<0.05）。見表3。

表3 各組軟骨細胞ColⅡ蛋白相對表達量的比較（±s）

表3 各組軟骨細胞ColⅡ蛋白相對表達量的比較（±s）

注：①與B組比較，P<0.05；②與C組比較，P<0.05；③與D組比較，P<0.05；④與第2天比較，P<0.05。

組別A組B組C組D組第2天1.00±0.01①②③0.80±0.03②③0.74±0.05 0.67±0.01第4天0.92±0.01①②③④0.51±0.03②③④0.41±0.09③④0.23±0.01④

A 組、B 組、C 組、D 組軟骨細胞第2 天和第4 天ColⅡ蛋白相對表達量經(jīng)灰度分析，結(jié)果顯示：同一時間點，A 組軟骨細胞中ColⅡ灰度最深，B 組、C 組、D 組依次變淺；隨著培養(yǎng)時間延長，各組軟骨電泳條帶的灰度也呈變淺趨勢。見圖1。

圖1 各組軟骨細胞ColⅡ蛋白電泳圖

2.3 ColⅡ免疫組織化學染色結(jié)果

A 組、B 組、C 組、D 組軟骨細胞加藥干預(yù)培養(yǎng)至第10 天時進行免疫組織化學染色后發(fā)現(xiàn)，A 組內(nèi)細胞核周圍胞質(zhì)內(nèi)棕褐色染色最深，B 組次之，C 組及D 組染色較淺（見圖2）。說明加藥干預(yù)培養(yǎng)至第10 天時，A 組軟骨細胞內(nèi)ColⅡ蛋白含量最高。

圖2 各組軟骨細胞ColⅡ免疫組織化學染色結(jié)果（×400）

3 討論

OA 是常見的慢性致殘性疾病，目前尚無一種有效的藥物可以根治OA，只能針對性給予對癥治療[10-11]。目前臨床上較多的是采取關(guān)節(jié)腔注射玻璃酸鈉等對癥治療[12]，我國每年用于治療OA 的費用高達數(shù)億元。因此，找到一種能延緩OA 甚至根治OA 的藥物是臨床急需解決的問題。

OA 的主要病理改變?yōu)檐浌峭诵行愿淖?。軟骨細胞是軟骨組織中唯一的細胞，可以合成并分泌ColⅡ，其生物學特征的變化與OA 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。軟骨細胞對軟骨的正常結(jié)構(gòu)與功能發(fā)揮著重要作用，軟骨細胞合成及分泌ColⅡ異常在OA 的發(fā)生過程中起到重要的作用。軟骨細胞中ColⅡ的含量變化直接關(guān)系到軟骨組織的退變情況，所以ColⅡ成為OA 實驗研究的主要觀測指標。因此，為了初步驗證TN14003、T140 及AMD3100 在延緩關(guān)節(jié)軟骨退變方面的療效，本研究主要觀察這3 種小分子藥物對人OA 軟骨細胞ColⅡ的影響。

SDF-1 在OA 患者膝關(guān)節(jié)液中含量明顯高于正常膝關(guān)節(jié)液中的含量，SDF-1 含量與OA 的嚴重程度呈正相關(guān)，甚至發(fā)現(xiàn)SDF-1 與軟骨下骨硬化有關(guān)[14]。在膝關(guān)節(jié)中，CXCR4 是SDF-1 的特異性受體，兩者結(jié)合后通過啟動SDF-1/CXCR4 信號通路而引起軟骨退變等一系列生物學反應(yīng)[2，15]。因此，目前認為SDF-1/CXCR4 信號通路在OA 的發(fā)生發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。

CXCR4 拮抗劑可以有效阻斷SDF-1/CXCR4 信號通路進而延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，部分CXCR4 拮抗劑已被用于防治OA 的研究中，其中研究較多的有AMD3100 和T140[5-7]。有研究[7]證明，AMD3100 是一種結(jié)合緊密且可以緩慢可逆的小分子非肽類CXCR4 拮抗劑，具有弱激動劑的部分作用，其阻斷效率不完全，屬于CXCR4 不完全拮抗劑。T140是CXCR4 受體的小分子肽類完全拮抗劑，相對于AMD3100 而言，其拮抗效率更高，特異性更強，但穩(wěn)定性稍差[7]。TN14003 是T140 的衍生物，也是含有14 個氨基酸的小分子多肽，通過將T140 的羥基端氨基化等修飾后，TN14003 拮抗效率較T140 有所提高，穩(wěn)定性好且細胞毒性低[8]。從這3 種小分子拮抗劑的拮抗效率來看，TN14003 顯然高于其他2 個拮抗劑，這從本實驗結(jié)果中也可以得到驗證。

本研究中，筆者將TN14003、T140、AMD3100分別對應(yīng)A 組、B 組及C 組，D 組作為對照組。由于OA 患者關(guān)節(jié)液中存在較高濃度的SDF-1，因此筆者在4 組培養(yǎng)基中均加入了SDF-1，以觀察這3 種小分子拮抗劑阻斷SDF-1/CXCR4 信號通路后的情況。通過qRT-PCR 檢測各組軟骨細胞ColⅡmRNA相對表達量后發(fā)現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時間延長，ColⅡmRNA 相對表達量逐漸下降，估計與SDF-1 持續(xù)作用于軟骨細胞引起軟骨細胞減少基質(zhì)的合成有關(guān)。同時還發(fā)現(xiàn)，A 組中ColⅡmRNA 相對表達量均高于其他組，B 組、C 組、D 組中ColⅡmRNA 相對表達量依次遞減，說明TN14003 可以更好地抵抗SDF-1 對軟骨細胞ColⅡmRNA 的影響，T140 稍遜色于TN4003 而優(yōu)于AMD3100。Western blotting 檢測發(fā)現(xiàn)，A 組軟骨細胞內(nèi)ColⅡ蛋白相對表達量隨著干預(yù)時間延長而逐漸減少，A 組細胞內(nèi)ColⅡ蛋白相對表達量均高于B 組、C 組、D 組，說明TN14003較T140 及AMD3100 而言，能更好地拮抗SDF-1 對軟骨細胞中ColⅡ蛋白的降解，進而能更好地延緩軟骨的退變。最后通過免疫組織化學染色鑒定4 組軟骨細胞中Col Ⅱ的表達，體外給予TN14003、T140 及AMD3100 干預(yù)培養(yǎng)至第10 天時，A 組中ColⅡ染色最深，B 組次之，而C 組和D 組染色最淺。說明100 ng/mL 的SDF-1 可以促進軟骨細胞內(nèi)ColⅡ的降解，而TN14003、T140 及AMD3100 可以延緩SDF-1 引起的OA 軟骨細胞ColⅡ的降解，同時發(fā)現(xiàn)TN14003 的延緩效應(yīng)也是最佳的，這與筆者前期的動物實驗趨勢是一致的[16]。

因此，可以這樣認為，TN14003 在緩解人OA軟骨關(guān)節(jié)退變優(yōu)于T140 及AMD3100。 但是，TN14003 作為一種多肽類小分子拮抗劑，藥物的穩(wěn)定性、毒性等問題也是將來需要考慮及觀察的問題，后期還需要進一步實驗進行驗證甚至改進，期待不久的將來臨床上能用上一種高效、安全的延緩OA 靶向治療藥物。