李悅，崔冬冰，鄭迪杰，王秀紅*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 護理學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 組織工程與干細胞實驗中心，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 肝膽外科，貴州 貴陽 550004)

胰腺癌是目前公認的惡性程度極高的腫瘤之一，死亡率高、預(yù)后極差，患者生存率低于7%[1-2]。目前，臨床上治療胰腺癌主要采用手術(shù)切除及化、放療和其它局部對癥治療，治療效果十分有限[3]，所以亟需研發(fā)新的治療方法提高患者生存率。使用藥物抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展，被認為是治療腫瘤的有效方法之一[4]。天然產(chǎn)物是具有生物活性的天然來源化合物，近幾十年來開發(fā)的抗癌藥物有50%源自天然產(chǎn)物提取物發(fā)展而來，具有廣闊的發(fā)展前景[5-7]。有研究表明天然產(chǎn)物能夠通過調(diào)控自噬、誘導(dǎo)鐵死亡從而發(fā)揮抗腫瘤活性作用[8-9]?？ㄍ吆匪?flavokawain B, FKB)是從太平洋島嶼灌木叢中提取的一種天然產(chǎn)物，在胃癌、肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中具有明顯的抗癌作用[10-13]，但在胰腺癌中的研究鮮有報道。因此，本研究探討FKB對人胰腺癌細胞增殖、侵襲和凋亡的作用，為今后開發(fā)新的抗胰腺癌藥物提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞來源 人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1和SW1990購自武漢市同濟醫(yī)院肝膽胰外科實驗室。

1.1.2主要試劑 FKB(美國Abcam公司)，培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清(美國Gibco公司)；6孔板、96孔板、Transwell小室(美國Corning公司)，細胞增殖毒性試劑盒(cell counting kit-8 ,CCK-8)試劑(日本Dojindo研究所)，Matrigel膠(美國BD公司)，波形蛋白(Vimentin)抗體、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體、半胱天冬酶-3(cysteinyl aspartate specific proteinase-3,Caspase-3)抗體、Caspase-9抗體及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體(武漢Proteintech公司)，裂解緩沖液(radio immunoprecipitation ssay,RIPA)試劑、蛋白濃度測定試劑盒(bicinchoninic acid assay,BCA)及二甲基亞颯(dimethyl sulfoxide,DMSO；北京Solabio公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組 人胰腺癌細胞株P(guān)ANC-1和SW1990使用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2含量為5%的恒溫培養(yǎng)箱中孵育；當培養(yǎng)瓶中細胞生長至70%～80%后進行細胞傳代用以后續(xù)實驗；細胞分為對照組(0.1%DMSO)和5、10、20、40 μmol/L FKB組。

1.2.2CCK-8實驗 將處于對數(shù)期生長的PANC-1和SW1990細胞消化并計數(shù)，分別以3×103個/孔將2株胰腺癌細胞種于多個96孔板上，設(shè)5組復(fù)孔。待細胞貼壁后，分別加入DMSO和不同濃度的FKB(分組同1.2.1項下分組方式)，24、48及72 h后吸棄廢液，加PBS清洗，每孔加CCK-8試劑10 μL和無血清DMEM 100 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱孵育3 h，檢測光密度(optical density，OD)值。

1.2.3平板克隆形成實驗 將處于對數(shù)期生長的PANC-1和SW1990細胞消化并計數(shù)，分別以1×103個/孔將2株胰腺癌細胞種于6孔板上；待細胞貼壁后進行加藥處理(分組同1.2.1項下分組方式)，添加DMEM培養(yǎng)液至5 mL；恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d后棄培養(yǎng)基，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗，加4%多聚甲醛1 mL固定30 min，吸棄后加1%結(jié)晶紫1 mL染色30 min，PBS清洗數(shù)遍，烘干，計數(shù)并拍照。

1.2.4Transwell實驗 Matrigel與無血清的DMEM按1∶7的比例稀釋，取50 μL加到Transwell上室待其凝固；將處于對數(shù)期生長的PANC-1和SW1990細胞消化進行饑餓處理24 h，分別取2×104個細胞種于小室內(nèi)，加藥處理(分組同1.2.1項下方式)；補無血清培養(yǎng)基至200 μL，下室加含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液700 μL；恒溫培養(yǎng)箱孵育24 h，PBS清洗；加4%的多聚甲醛固定30 min，吸棄并加1%結(jié)晶紫染色30 min；PBS清洗，烘箱烘干，使用倒置光學(xué)顯微鏡拍照。

1.2.5Western blot檢測凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9以及上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)蛋白Vimentin、E-cadherin及N-鈣黏蛋白(N-cadherin) 將處于對數(shù)期生長的PANC-1和SW1990細胞消化后接種于6孔板中，進行藥物處理(分組同1.2.1項下方式)；置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，吸棄廢液，PBS清洗數(shù)遍，每孔加0.25%胰蛋白酶500 μL消化，1 000 r/min離心5 min，棄上清；加RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，使用BCA蛋白測定濃度試劑盒檢測各分組的蛋白濃度；根據(jù)蛋白上清液按比例1∶5加5×loading buff，置于水中100 ℃煮沸5 min；每孔取蛋白上樣品50 μg進行SDS-PAGE電泳，90 V電泳2 h，恒流300 mA轉(zhuǎn)膜2 h；5%脫脂牛奶封閉30 min，把條帶加入對應(yīng)的Caspase-3、Caspase-9、Vimentin、E-cadherin、N-cadherin一抗中置于4 ℃搖床上過夜；緩沖鹽溶液(tris-HCl tween，TBST)清洗3次，10 min/次，將條帶置于辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠或兔IgG的二抗中孵育2 h，TBST清洗3次，10 min/次；使用增強型化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemiluminescence，ECL)進行顯色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 細胞增殖

FKB的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1A。CCK8實驗檢測細胞的存活率結(jié)果顯示(圖1B和1C)，與DMSO組對比，F(xiàn)KB能抑制胰腺癌細胞的增殖，并且以濃度和時間依賴的方式對PANC-1和SW1990的抑制能力逐漸加強(P<0.05)；平板克隆實驗檢測結(jié)果顯示(圖1D～1F)，隨著FKB的濃度增加，對PANC-1和SW1990的抑制效果越發(fā)明顯(P<0.05)。上述結(jié)果表明，F(xiàn)KB能夠抑制胰腺癌細胞PANC-1和SW1990增殖能力。

注：A為FKB化學(xué)結(jié)構(gòu)式，B、C為CCK-8實驗結(jié)果，D～F分別為細胞平板克隆實驗結(jié)果及定量結(jié)果；(1)與同時點DMSO組比較，P<0.05；(2)與同細胞DMSO組比較，P<0.05。

2.2 細胞侵襲能力

Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，隨著FKB的濃度逐漸增加，穿過小室的胰腺癌細胞數(shù)減少，表明隨著FKB的濃度增加，PANC-1和SW1990的侵襲能力逐漸下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

注：A～C分別為Transwell實驗胰腺癌細胞侵襲能力的形態(tài)學(xué)和定量結(jié)果；(1)與同細胞DMSO組比較，P<0.05。

2.3 Vimentin、N-Cadherin及E-Cadherin蛋白的表達

蛋白質(zhì)印跡實驗表明，與DMSO組對比，當FKB的濃度逐漸上升后，Vimentin蛋白和N-Cadherin蛋白的表達逐漸下降，而E-Cadherin蛋白的表達水平呈上升趨勢(P<0.05)，表明FKB以濃度依賴方式抑制胰腺癌細胞的EMT蛋白表達(圖3)。

注：A為Western blot實驗結(jié)果，B、C為PANC-1和SW1190的EMT蛋白定量結(jié)果；(1)與同蛋白DMSO組比較，P<0.05。

2.4 Caspase-3和Caspase-9的表達

蛋白質(zhì)印跡實驗提示，與DMSO組對比，隨著FKB的濃度逐漸上升后，Caspase-3和Caspase-9的蛋白表達水平逐漸下降(P<0.05)，表明FKB以濃度依賴方式促進胰腺癌細胞的凋亡蛋白表達(圖4)。

注：A為Western blot實驗結(jié)果，B、C為凋亡蛋白定量結(jié)果；(1)與同蛋白DMSO組比較，P<0.05。

3 討論

胰腺癌由于發(fā)病早期無明顯癥狀，轉(zhuǎn)移性強且進展迅速，通?；颊弑辉\斷時已為晚期，失去手術(shù)機會[14]。目前臨床上常用的抗腫瘤藥物為吉西他濱，但因副作用大導(dǎo)致治療效果不理想[15]。所以迫切需要研究新的抗腫瘤藥物。最近有研究表明，天然產(chǎn)物在預(yù)防和治療癌癥方面有一定的應(yīng)用價值[16]。FKB是一種天然產(chǎn)物，源自于南太平洋島嶼學(xué)名為卡瓦的灌木[17]。有流行病學(xué)研究表明，在瓦努阿圖、斐濟及西薩摩亞等飲用卡瓦酒的國家中，居民的腫瘤發(fā)病率只占非卡瓦飲酒國家的1/3[18]。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)FKB通過靶向髓樣分化因子2減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷。Celentano 等[20]研究表明FKB能夠在體外對口腔鱗狀細胞癌細胞發(fā)揮選擇性的抗癌作用。因此將FKB作為本研究對象探尋其是否在體外能對胰腺癌細胞發(fā)揮抗腫瘤活性作用。

本研究CCK-8實驗和平板克隆結(jié)果顯示，與DMSO組相比，F(xiàn)KB以濃度-時間依賴的方式抑制胰腺癌細胞的增殖能力；Transwell侵襲實驗顯示，加藥組胰腺癌細胞中侵襲細胞數(shù)低于DMSO組，表明FKB能有效地減弱胰腺癌細胞的侵襲能力。細胞凋亡即程序性細胞死亡，其過程包括凋亡信號傳導(dǎo)階段、凋亡調(diào)控分子間的相互作用、蛋白水解酶的活化及進入連續(xù)反應(yīng)過程[21]。大量研究表明，Caspase家族在凋亡過程中起著關(guān)鍵性作用[22-23]。當細胞接收凋亡誘導(dǎo)信號后會傳遞給啟動性型Caspase，使其轉(zhuǎn)化為二聚體并活化，開啟細胞內(nèi)的凋亡程序[24]。本研究Western blot實驗結(jié)果顯示，加藥組胰腺癌細胞能夠促進凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9的表達增加，表明FKB能促進胰腺癌細胞的凋亡。

EMT是指上皮細胞通過特定的程序轉(zhuǎn)化為成具有高度遷移能力的間質(zhì)細胞過程，在癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演著重要的角色[25]。在發(fā)生EMT的上皮細胞中，上皮標記物 E-cadherin的表達降低與間充質(zhì)標志物N-cadherin、Vimentin表達升高是EMT的重要特征[26-27]。本研究結(jié)果表明，加藥組胰腺癌細胞中E-cadherin表達增加，N-cadherin和Vimentin的表達呈下降趨勢并呈濃度依賴性，表明FKB能夠抑制胰腺癌細胞的EMT進程，干預(yù)腫瘤細胞的EMT狀態(tài)。

綜上所述，F(xiàn)KB能夠促進胰腺癌細胞E-cadherin的表達，并抑制N-cadherin、Vimentin、Caspase-3和Caspase-9表達，從而促進凋亡并抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲及遷移。本研究證實了FKB在體外能夠抑制胰腺癌細胞，具有治療胰腺癌的新藥物的潛力，但若要進一步用于臨床還需要進行體內(nèi)外研究和臨床研究。