盧美蓉，王 靜，黃廣翅，李桂花，劉秀盈，蔡杏琳 (.海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科，海南 海口 57000；.海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 海口 57000；.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院產(chǎn)科，海南 ?？?5700)

卵母細(xì)胞超低溫保存是保持生育能力的重要策略[1]。然而促性腺激素刺激卵母細(xì)胞成熟可能并不適合所有有保存生育能力需求的女性，如多囊卵巢綜合征或激素依賴(lài)性癌癥患者[2]，對(duì)這類(lèi)患者可在沒(méi)有激素刺激的情況下從卵巢中采集未成熟的卵母細(xì)胞[3]。但玻璃化冷凍未成熟卵母細(xì)胞(vitrified immature oocytes，VIOs)經(jīng)過(guò)多次冷凍后，會(huì)影響其減數(shù)分裂和復(fù)蘇后正常發(fā)育能力的恢復(fù)，同時(shí)超低溫保存可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[4-5]。有研究發(fā)現(xiàn)，添加抗凍蛋白或抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控因子可有效提高VIOs的發(fā)育能力，并且在豬VIOs中被證明是適用、有效的方法[5-6]。半胱氨酸蛋白酶Caspase是細(xì)胞凋亡過(guò)程中參與蛋白水解和DNA斷裂的效應(yīng)酶，Z-VAD-FMK是一種廣譜細(xì)胞滲透性Caspase抑制劑，已成功用于逆轉(zhuǎn)豬和牛胚胎及不同體細(xì)胞經(jīng)冷凍誘導(dǎo)的凋亡變性[6-7]。本研究旨在探討Z-VAD-FMK抑制凋亡通路對(duì)體外培養(yǎng)小鼠未成熟VIOs的DNA完整性和發(fā)育潛能的影響，以期為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

200只雌性SPF級(jí)ICR小鼠，5～6周齡，購(gòu)自上海亓上生物醫(yī)學(xué)科技有限公司[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2021-0004]。將小鼠置于22～28 ℃、光照/避光交替12 h環(huán)境下飼養(yǎng)，保證食物和水充足。本研究經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LHK2019012)。除另有說(shuō)明，本研究所有化學(xué)品和試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 未成熟卵母細(xì)胞的獲取

200只雌性ICR小鼠腹腔注射5 IU孕馬血清促性腺激素超排，48 h后頸椎脫位處死。取卵巢，置于1 mL改良小鼠輸卵管液中，加入20%(V/V)牛血清白蛋白，穿刺有腔卵泡，收集覆蓋有致密卵丘細(xì)胞的未成熟卵丘—卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)。

1.3 未成熟COCs的玻璃化冷凍和復(fù)蘇[8]

玻璃化冷凍：將未成熟COCs懸浮于含有7.5%(V/V)乙二醇、7.5%DMSO的平衡溶液中培養(yǎng) 5 min，然后移至含15%(V/V)乙二醇、15%(V/V)丙三醇、0.5 mmol/L蔗糖溶液和20%(V/V)FBS的TCM-199培養(yǎng)基中，置于冷凍薄膜聚丙烯帶45～60 s。將 5～6個(gè)卵母細(xì)胞裝入CryoTop，并立即投入液氮中貯存。復(fù)蘇：冷凍薄膜在37 ℃含有1 mmol/L蔗糖解凍溶液及20%(V/V)FBS的TCM-199培養(yǎng)基中浸泡 1 min，提取玻璃化冷凍的卵母細(xì)胞，并移至含有 0.5 mmol/L蔗糖溶液和20%(V/V)FBS的TCM-199培養(yǎng)基中培養(yǎng) 3 min，然后在不含蔗糖的TCM-199培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 min。

1.4 COCs分組

實(shí)驗(yàn)Ⅰ用于探討玻璃化冷凍是否誘導(dǎo)未成熟卵母細(xì)胞凋亡通路的激活：將未成熟COCs分為陰性對(duì)照組(FOs組，n=31，新鮮COCs)、陽(yáng)性對(duì)照組(HPOs組，n=32，100 μmol/L過(guò)氧化氫溶液暴露COCs約3 h誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡)、2 h VIOs組(n=31，玻璃化復(fù)蘇COCs 2 h)和18 h VIOs組(n=32，玻璃化復(fù)蘇COCs 18 h)。由于在復(fù)蘇后COCs可能開(kāi)始緩慢閉鎖，應(yīng)在孵育后2 h及18 h(小鼠未成熟卵母細(xì)胞體外成熟的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)長(zhǎng))對(duì)VIOs進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)Ⅱ用于探討Z-VAD-FMK對(duì)凋亡標(biāo)志物(未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化、Caspase活性)的影響：將COCs分為VIOs(-/-)組(n=36，正常玻璃化冷凍復(fù)蘇培養(yǎng)基，未添加Z-VAD-FMK)、VIOs(+/-)組(n=37，添加20 μmol/L Z-VAD-FMK至玻璃化冷凍復(fù)蘇培養(yǎng)基中)和VIOs(+/+)組(n=34，添加20 μmol/L Z-VAD-FMK至玻璃化冷凍復(fù)蘇培養(yǎng)基和復(fù)蘇后培養(yǎng)基中)，復(fù)蘇后的VIOs孵育18 h，隨后進(jìn)行凋亡標(biāo)志物檢測(cè)。泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK購(gòu)自美國(guó)MedChemExpress公司，其在所有玻璃化冷凍—復(fù)蘇溶液和體外成熟培養(yǎng)液中的最終濃度為20 μmol/L[盡量使DMSO濃度低于0.1%(V/V)，以避免細(xì)胞毒性]。實(shí)驗(yàn)Ⅲ主要分析Z-VAD-FMK對(duì)VIOs體外發(fā)育潛能的影響：將COCs分為FOs組(n=130)、VIOs(-/-)組(n=129)和VIOs(+/+)組(n=128)，分組操作同上，評(píng)估VIOs的發(fā)育能力。

1.5 凋亡信號(hào)檢測(cè)

采用Cell MeterTM TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)AAT Bioquest公司)和CellEventTMCaspase-3/7 Green檢測(cè)試劑(意大利Thermo Fisher Scientific-Invitrogen公司)于38.5 ℃對(duì)卵母細(xì)胞進(jìn)行染色，孵育1 h，檢測(cè)未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化(TUNEL陽(yáng)性卵母細(xì)胞百分比)和Caspase活性；再用Hoechst33342或DAPI(0.01 mg/mL)進(jìn)行復(fù)染以確定細(xì)胞核；載玻片用抗褪色試劑(FluoromountTMAqueous Mounting培養(yǎng)液)覆蓋，在配備數(shù)碼相機(jī)(AxioCamMRc5，德國(guó)Zeiss)的熒光顯微鏡(Axiovert 100，德國(guó)Zeiss)下觀察，計(jì)算TUNEL陽(yáng)性卵母細(xì)胞數(shù)量(細(xì)胞核區(qū)域顯示亮紅色熒光)以及Caspase活性(即綠色熒光)，使用成像軟件ZEN 2.5 blue版(德國(guó)Carl Zeiss Microscopy)計(jì)算熒光強(qiáng)度。

1.6 體外胚胎培養(yǎng)[9]

卵母細(xì)胞于可控環(huán)境(39 ℃、5% CO2)及20 μL未成熟卵培養(yǎng)液(TCM-199培養(yǎng)基中添加3 mg/mL牛血清白蛋白、0.1 mg/mL半胱氨酸、1.4 mg/mL羥乙基哌嗪乙磺酸、0.25 mg/mL丙酮酸鈉、0.6 mg/mL乳酸鈉、0.15 mg/mL左旋谷氨酰胺、0.055 mg/mL慶大霉素、0.2 IU/mL人促黃體激素和0.5 IU/mL人垂體促卵泡刺激激素)中培養(yǎng)18 h；體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)18 h后，將卵母細(xì)胞從體外成熟培養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到50 μL新鮮體外受精培養(yǎng)基中，培養(yǎng)皿上覆蓋礦物油。體外受精采用成年雄性小鼠常規(guī)睪丸切除術(shù)后獲得的新鮮附睪精子。實(shí)驗(yàn)前睪丸于4 ℃中保存24 h，從睪丸中解剖附睪，從輸精管和附睪尾中獲取精子，用體外受精培養(yǎng)液重懸，30 μm過(guò)濾器過(guò)濾精子懸液，通過(guò)Bürker血細(xì)胞計(jì)數(shù)盤(pán)測(cè)定精子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)和濃度；將精子懸液添加到含卵母細(xì)胞的微滴中至100 μL，最終運(yùn)動(dòng)精子濃度為1×106/mL。每個(gè)試管受精液中含有來(lái)自同一實(shí)驗(yàn)組的7～11個(gè)卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞和精子在可控環(huán)境中(39 ℃、5% CO2)共孵育。體外受精后，所有卵母細(xì)胞在體外培養(yǎng)(in vitro culture，IVC)培養(yǎng)基(Ham’s F-10中添加5%FBS、0.11 mg/mL丙酮酸鈉、0.075 mg/mL左旋谷氨酰胺、0.6 mg/mL慶大霉素)中輕輕洗滌，使用剝離器微量吸液管去除精子和殘余卵丘細(xì)胞后，將胚胎移至覆蓋礦物油的IVC培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h。IVC期間，在高倍倒置顯微鏡下評(píng)估胚胎發(fā)育情況，每24 h 1次。

1.7 成熟率、受精率和胚胎發(fā)育率

體外受精 48 h后，用配有125 μm尖頭的剝離器微量移液管機(jī)械置換未分裂的卵母細(xì)胞，與精子結(jié)合后置于載玻片上，于4 ℃、80%乙醇中固定過(guò)夜。然后通過(guò)碘化丙啶染色(1 mg/mL，1∶100)評(píng)估染色質(zhì)構(gòu)型。生長(zhǎng)中的胚胎培養(yǎng)至120 h或出現(xiàn)閉鎖跡象時(shí)，用碘化丙啶染色，根據(jù)卵裂球核的數(shù)量確定其發(fā)育階段。未受精卵母細(xì)胞的成熟期(中期Ⅱ)通過(guò)存在一組緊密排列的染色體(第一極體)和另一組分布良好的染色體來(lái)確定。體外成熟卵母細(xì)胞總數(shù)為未受精成熟階段卵母細(xì)胞、受精卵母細(xì)胞(即未分裂但顯示原核)和卵裂胚的總和；受精卵母細(xì)胞的數(shù)量為受精卵母細(xì)胞和卵裂胚的總和。通過(guò)記錄卵裂胚(2～4細(xì)胞、5～8細(xì)胞、9～16細(xì)胞)、桑葚胚和囊胚階段評(píng)估胚胎發(fā)育情況，計(jì)算成熟率、受精率和胚胎發(fā)育率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 玻璃化冷凍對(duì)未成熟卵母細(xì)胞凋亡通路的影響(實(shí)驗(yàn)Ⅰ)

HPOs組和18 h VIOs組未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化比例高于FOs組(P<0.05)；18 h VIOs組DNA片段化比例低于HPOs組(P=0.004)，高于2 h VIOs組(P=0.023)；2 h VIOs組DNA片段化比例低于HPOs組(P<0.001)，但是與FOs組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。HPOs組、2 h VIOs組和18 h VIOs組Caspase活性(綠色熒光強(qiáng)度)均高于FOs組(P=0.001)，但是HPOs組、2 h VIOs組和18 h VIOs組Caspase活性比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

表1 未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化和Caspase活性

a：TUNEL染色和Hoechst 33342染色(亮藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核，胞核中的亮紅色熒光表示未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化)；b：Caspase活性檢測(cè)(綠色熒光表示Caspase活性程度，藍(lán)色熒光表示DAPI核染色)

2.2 Z-VAD-FMK對(duì)凋亡標(biāo)志物的影響(實(shí)驗(yàn)Ⅱ)

與VIOs(-/-)組相比，VIOs(+/-)組未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化比例較低(P=0.007)。VIOs(+/+)組未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化比例和Caspase活性低于VIOs(+/-)組和VIOs(-/-)組(P<0.001)，但VIOs(+/-)組和VIOs(-/-)組Caspase活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.588)，見(jiàn)表2。

表2 未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化和Caspase活性

2.3 Z-VAD-FMK對(duì)VIOs體外發(fā)育潛能的影響(實(shí)驗(yàn)Ⅲ)

與FOs組相比，VIOs(-/-)組成熟率較低(P=0.004)，而VIOs(+/+)組成熟率與VIOs(-/-)組、FOs組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.384、0.060)。各組受精率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.082)。VIOs(+/+)組和VIOs(-/-)組閉鎖率高于FOs組(P<0.001)，但VIOs(+/+)組與VIOs(-/-)組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.550)，見(jiàn)表3。此外，VIOs(-/-)組和VIOs(+/+)組的2～4細(xì)胞胚胎發(fā)育率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但5～8細(xì)胞、9～16細(xì)胞胚胎發(fā)育率及桑葚胚發(fā)育率均低于FOs組(P<0.001)，各組2～4細(xì)胞胚胎發(fā)育率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在胚胎發(fā)育后期，VIOs(-/-)組和VIOs(+/+)組均無(wú)囊胚形成，與FOs組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表3 VIOs成熟、受精和閉鎖情況比較[個(gè)(%)]

表4 體外胚胎發(fā)育情況比較[個(gè)(%)]

3 討論

為了克服VIOs的體外成熟和胚胎發(fā)育不良的問(wèn)題，既往研究主要集中于改進(jìn)玻璃化冷凍過(guò)程[4-6]。而本研究通過(guò)靶向凋亡途徑證實(shí)了泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可抑制未成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍誘導(dǎo)的DNA損傷和Caspase的活性，從而使VIOs的成熟率接近于新鮮卵母細(xì)胞的成熟率。

活性氧類(lèi)物質(zhì)(reactive oxygen species，ROS)是正常細(xì)胞氧化過(guò)程的副產(chǎn)物。精子、卵母細(xì)胞和胚胎都會(huì)積累大量ROS，從而導(dǎo)致線粒體損傷、三磷酸腺苷耗竭、細(xì)胞凋亡和發(fā)育障礙[10]，從而影響冷凍卵母細(xì)胞和胚胎的發(fā)育能力。本研究通過(guò)過(guò)氧化氫溶液誘導(dǎo)超低溫保存的未成熟卵母細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化超過(guò)90%。在卵母細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Caspase蛋白酶雖然可以裂解其他多種多肽成分，但是其本身通常也需要被其他酶(如級(jí)聯(lián)中的其他Caspase)裂解才能激活[11]。Caspase活性增加導(dǎo)致一些細(xì)胞成分被破壞，從而激活典型的細(xì)胞凋亡途徑。根據(jù)Caspase在級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的功能，Caspase可分為啟動(dòng)子(如Caspase 8和Caspase 9)和效應(yīng)子(如Caspase 3、Caspase 6和Caspase 7)[12]。本研究實(shí)驗(yàn)Ⅰ結(jié)果顯示，無(wú)論孵育時(shí)間長(zhǎng)短，VIOs組中Caspase活性均高于FOs組；2 h VIOs組與FOs組的未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化比例相似，而18 h VIOs組未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化比例明顯高于FOs組。因此，在復(fù)蘇后不久，Caspase的活性就可以被檢測(cè)到，但有些酶可能需要更長(zhǎng)的時(shí)間才能到達(dá)細(xì)胞核，并開(kāi)始DNA片段化。關(guān)于細(xì)胞凋亡參與VIOs復(fù)蘇后的閉鎖機(jī)制在其他多個(gè)物種中也有報(bào)道[4-5]。我們推測(cè)，通過(guò)作用于凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)成分可能有利于VIOs的生存和發(fā)育。本研究將Z-VAD-FMK用于COCs玻璃化冷凍復(fù)蘇和/或玻璃化冷凍復(fù)蘇及次日培養(yǎng)，結(jié)果顯示，VIOs(+/+)組Caspase活性和未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化比例低于VIOs(+/-)組，說(shuō)明僅在玻璃化冷凍復(fù)蘇過(guò)程中添加Z-VAD-FMK不足以避免DNA損傷，而在孵育18 h過(guò)程中再次添加Z-VAD-FMK可以顯著降低Caspase活性，減少DNA損傷。這可能是由于Caspase抑制劑通過(guò)與Caspase的催化位點(diǎn)結(jié)合并抑制其活性而發(fā)揮作用，只在玻璃化冷凍復(fù)蘇過(guò)程中添加Caspase抑制劑暴露時(shí)間較短，延長(zhǎng)Z-VAD-FMK的時(shí)間有利于抑制凋亡通路的激活。Niu等[7]研究證實(shí)，體外培養(yǎng)玻璃化卵母細(xì)胞暴露于特定的Caspase抑制劑中可降低Caspase活性并提高發(fā)育能力，本研究結(jié)果與之一致。因此，Cryotop玻璃化結(jié)合IVM-IVF-IVC方案對(duì)低溫保存的卵母細(xì)胞體外胚胎培養(yǎng)可能是一個(gè)很好的方案。然而，本研究發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育中，VIOs(+/+)組和VIOs(-/-)組受精率和閉鎖率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，發(fā)育后期進(jìn)展較差，特別是桑葚胚和囊胚階段，說(shuō)明Z-VAD-FMK有利于體外成熟培養(yǎng)，可能是因?yàn)橐种苿┑拇嬖谧柚沽撕笃?即體外受精后)的閉鎖[4,13-15]。另外，在培養(yǎng)過(guò)程中，不能進(jìn)一步發(fā)育的胚胎細(xì)胞分裂停止并開(kāi)始閉鎖，而凋亡抑制劑的存在可能會(huì)抑制這一過(guò)程[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，添加凋亡抑制劑至培養(yǎng)基可以提高胚胎發(fā)育率[17-18]。

此外，凋亡標(biāo)志物的減少并不意味著發(fā)育能力的提高。由于目前沒(méi)有一個(gè)閾值來(lái)區(qū)分健康和死亡細(xì)胞，熒光染色、免疫組化、PCR等方法均不能對(duì)Caspase活性進(jìn)行絕對(duì)定量，DNA片段化的評(píng)估可能是對(duì)卵母細(xì)胞數(shù)量更好的評(píng)價(jià)方式。本研究結(jié)果顯示，VIOs(+/+)組和VIOs(-/-)組未成熟卵母細(xì)胞DNA片段化和Caspase活性有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但胚胎發(fā)育率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，尤其在胚胎發(fā)育后期2組均無(wú)囊胚形成。說(shuō)明完成胚胎形成所需要的前提條件遠(yuǎn)不止DNA的完整性。此外，由于VIOs暴露于Z-VAD-FMK中可抑制Caspase 8的活性，從而導(dǎo)致VIOs發(fā)生壞死性凋亡[17-18]。因此，無(wú)凋亡標(biāo)志物增加并不意味著卵母細(xì)胞健康，胚胎發(fā)育不良可能是由于非凋亡變性所致。

綜上，未成熟卵母細(xì)胞的玻璃化冷凍作用可導(dǎo)致DNA片段化和Caspase活性增加，而在玻璃化冷凍復(fù)蘇和次日培養(yǎng)加入泛Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可有效逆轉(zhuǎn)該過(guò)程。但是Z-VAD-FMK處理的VIOs體外成熟潛能和受精率與新鮮卵母細(xì)胞相似，因此Z-VAD-FMK可能對(duì)胚胎發(fā)育的影響較小，但需進(jìn)一步研究證實(shí)。本研究通過(guò)靶向Caspase凋亡通路，可能為抑制細(xì)胞凋亡、增強(qiáng)VIOs的超低溫耐受性和提高玻璃化冷凍未成熟卵母細(xì)胞發(fā)育能力提供思路。