黃鈺媛，韋雪梅，鄭育秀，劉麗麗 (海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科,海南 ?？?570311)

隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，越來越多老齡患者傾向于手術(shù)治療各種疾病。但部分老齡患者因存在慢性病與器官功能衰退，全麻手術(shù)常導(dǎo)致各種并發(fā)癥。其中，術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是老齡患者全麻手術(shù)后常見的并發(fā)癥，顯著延長了患者住院時間，影響了患者生活質(zhì)量，增加了患者治療費用與病死率[1]。因此，如何防治POCD具有重大意義。已有研究證實，氧化應(yīng)激與神經(jīng)炎癥在POCD病程進(jìn)展中起重要作用[2]。在老齡大鼠海馬中，全麻后腹部手術(shù)造成氧化因子水平升高，Toll樣受體4/核因子κB(Toll-like receptor 4/nuclear factor κB,TLR4/NF-κB)信號通路活化，炎性細(xì)胞因子釋放增加，進(jìn)而出現(xiàn)短暫的POCD[3]。因此，如何降低全麻術(shù)后氧化應(yīng)激反應(yīng)與神經(jīng)炎癥反應(yīng)是POCD治療的關(guān)鍵。

依達(dá)拉奉(Edaravone)是一種強大的自由基清除劑。臨床上，依達(dá)拉奉主要用于治療缺血性中風(fēng)。有研究報道，依達(dá)拉奉為3 mg·kg-1劑量時可以改善缺血性腦卒中大鼠的神經(jīng)功能損傷[4]；另一項研究顯示，3 mg·kg-1依達(dá)拉奉可改善脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥[5]，這提示依達(dá)拉奉可能對POCD的治療有益。然而，臨床上即使依達(dá)拉奉劑量達(dá)到0.5 mg·kg-1(對應(yīng)小鼠應(yīng)用劑量約為6 mg·kg-1)，對POCD的治療效果仍不理想[6-7]。如劉鵬飛等[8]在腹腔熱灌注化療研究中，60例未使用依達(dá)拉奉的患者僅有16例出現(xiàn)了POCD癥狀，而對應(yīng)的60例使用0.5 mg·kg-1依達(dá)拉奉治療的患者仍有10例出現(xiàn)了POCD癥狀。因此，0.5 mg·kg-1依達(dá)拉奉對POCD的防治難以獲得滿意結(jié)果，提高依達(dá)拉奉劑量用于POCD的防治是必要的。本研究擬采用先前報道的多次麻醉/手術(shù)的方式構(gòu)建POCD模型[9-10]，探究高濃度依達(dá)拉奉對POCD的防治作用，以期為依達(dá)拉奉的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

48只雄性Balb/c小鼠，SPF級，14月齡ICR小鼠，體質(zhì)量30～40 g，由海南醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(瓊)2020-0007，動物使用許可證號：SYXK(瓊)2022-0013。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/12 h晝夜循環(huán)，濕度(50±10)%，溫度20～24 ℃，每籠4只。本實驗中所有操作均按照美國國立衛(wèi)生研究院頒布的《實驗動物的護(hù)理和使用指南》規(guī)定執(zhí)行。

1.2 實驗方案

參考文獻(xiàn)中POCD模型構(gòu)建方案[9-10]，采取多次麻醉，輔以開腹手術(shù)模擬臨床上多次全麻手術(shù)過程構(gòu)建。具體操作流程：將小鼠隨機分為對照組(Con組)、七氟醚組(Sev組)、七氟醚+依達(dá)拉奉低劑量組(Sev+Eda-L組,6 mg·kg-1)、七氟醚+依達(dá)拉奉高劑量組(Sev+Eda-H組,12 mg·kg-1)。POCD模型構(gòu)建前，所有小鼠禁食6 h。Con組小鼠吸入空氣—氧氣混合氣體。除Con組外，將其余各組小鼠置于麻醉箱中，通入3%七氟醚(廈門慧嘉生物公司，PPSJ-099064)和30%空氣—氧氣的混合氣體，設(shè)置氧氣流量為 3 L·min-1。待小鼠完全麻醉后，從麻醉箱中取出小鼠，腹部消毒后剪開約2 cm的小口，游離出部分小腸再放回，縫合小鼠腹部，再將小鼠放入麻醉箱中。整個通氣過程維持3 h以模擬較長時間的手術(shù)操作。所有小鼠麻醉過程中使用氣體檢測儀監(jiān)測麻醉箱中七氟醚濃度及CO2濃度，避免小鼠因麻醉過量或窒息死亡。每間隔1周，對七氟醚各組小鼠使用七氟醚吸入麻醉，麻醉條件與第1次相同，但不進(jìn)行開腹手術(shù)以避免后續(xù)水迷宮實驗中出現(xiàn)傷口感染，麻醉操作共3次。每次麻醉結(jié)束后，依達(dá)拉奉組小鼠持續(xù)尾靜脈注射不同劑量依達(dá)拉奉稀釋液(南京先聲東元制藥有限公司，H20031342)，Con組與Sev組注射生理鹽水。

1.3 Morris水迷宮實驗

待小鼠第3次麻醉結(jié)束，次日清醒后開展水迷宮實驗。Morris水迷宮(賽昂斯，江蘇，型號：SA201)是用來測試突觸記憶的實驗方法。水迷宮是一個直徑為110 cm的圓形水池，整個水迷宮分為4個象限，逃生平臺位于第Ⅰ象限中央，水迷宮中注入深約40 cm的溫水以覆蓋逃生平臺。水迷宮頂端設(shè)置1個相機，連接電腦，用于記錄小鼠游泳軌跡。所有小鼠開展4 d的訓(xùn)練以幫助識別并定位逃生平臺，具體內(nèi)容是將小鼠自各個象限丟入水中，記錄小鼠登上逃生平臺的時間，記為逃避潛伏期。訓(xùn)練結(jié)束后，撤去逃生平臺，檢測小鼠突觸記憶。具體內(nèi)容是將小鼠自第Ⅲ象限丟入水中，記錄小鼠游泳速度、在第Ⅰ象限中停留的時間以及到達(dá)逃生平臺的時間。

1.4 ELISA檢測炎性細(xì)胞因子水平

選購TNF-α(70-EK282/3-96)、IL-1β(70-EK201B/3-96)與IL-6(70-EK206/3-96)的ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物公司)。待行為學(xué)測試結(jié)束，小鼠以CO2安樂死，取新鮮腦組織，鑷取出海馬區(qū)樣本，加入PBS并勻漿。超聲處理10 min，將勻漿液在4 °C下以2 000 r/min離心15 min，取上清液。將樣品分別加入試劑盒檢測孔板中，37 ℃孵育2 h。PBST清洗，加入檢測抗體，37 ℃孵育1 h。PBST清洗，加入鏈霉素-HRP工作液，37 ℃孵育30 min。PBST清洗，加入TMB底物顯色5 min左右，加入終止液。在450 nm波長處使用酶標(biāo)儀檢測OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各個樣本中IL-6、IL-1β與TNF-α的含量。

1.5 氧化因子水平檢測

選擇南京建成生物公司的超氧歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒(A001-3-2)。將待測樣本與試劑盒中酶工作液、酶稀釋液和底物應(yīng)用液混合，37 ℃孵育20 min。450 nm處讀取酶標(biāo)儀數(shù)值，根據(jù)對照孔數(shù)值獲得SOD活力，將SOD活力與樣本中蛋白含量相比得到結(jié)果。

選擇南京建成生物公司的丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)含量檢測試劑盒(A003-1-2)。將待測樣本、稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品與試劑盒中不同試劑混合，95 ℃水浴40 min。以3 000 r/min離心10 min后取上清，在532 nm處、1 cm光徑條件下測試各管吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值/濃度曲線計算樣本中MDA含量，將MDA含量與樣本中蛋白含量相比得到結(jié)果。

1.6 免疫熒光檢測Iba1表達(dá)

小鼠心臟灌流后，取腦組織，置于4%多聚甲醛中固定。將腦組織放入梯度蔗糖溶液中脫水，加入冷凍包埋液，冷凍后切成約30 μm厚的冠狀切片。取切片放入含0.01%Triton X-100的PBST中洗滌，室溫下用3%羊血清白蛋白封閉30 min。PBST洗凈切片上的血清，將切片放入兔源單克隆anti-rat Iba1(1∶100,美國abcam公司,ab178847)中，4 ℃孵育過夜。次日取出切片，PBST洗凈一抗稀釋液后，浸入Goat anti-rabbit Alexa 594 IgG(H+L)抗體(1∶500,美國Abcam公司,ab150080)中，室溫下孵育2 h。再以DAPI染液染色15 min，滴加抗熒光猝滅劑，在熒光顯微鏡下拍攝海馬區(qū)Iba1表達(dá)。

1.7 Western blot檢測TLR4/NF-κB信號通路蛋白表達(dá)

取小鼠海馬組織，稱重后加入含有1% PMSF的RIPA裂解液(上海碧云天生物公司，P0013)，4 ℃勻漿形成細(xì)胞懸液，靜置裂解30 min。將總裂解物在4 ℃下以12 000 r/min離心30 min。取離心后上清液通過BCA蛋白定量試劑盒(P0012S，上海碧云天生物)測定蛋白濃度。在上清液中加入上樣緩沖液(上海碧云天生物公司，P0280)，通過SDS-PAGE分離等量的樣品(20 μg蛋白)。設(shè)置電泳時間30 V/30 min，90 V/90 min，以上樣緩沖液到達(dá)底端為終點。濕法轉(zhuǎn)膜將凝膠上蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(美國Thermo公司，88585)上，設(shè)置轉(zhuǎn)膜時間2 mA/60 min，全程冰浴。使用不同一抗孵育過夜：兔多克隆抗NF-κB和抗p-NF-κB抗體(1∶1 000，北京博奧森生物公司，bs-34045R，bs-3543R)，兔多克隆抗TLR4抗體(1∶1 000，北京博奧森生物公司，bs-20379R)，兔多克隆抗NLRP3抗體(1∶1 000，北京博奧森生物公司，bs-23722R)和兔多克隆抗β-actin抗體(1∶3 000，北京博奧森生物公司，bs-0061R)。使用對應(yīng)羊抗鼠/兔IgG(H+L)二抗稀釋液(1∶5 000，武漢三鷹生物公司，SA00001-1、SA00001-2)孵育。取出PVDF膜，PBST洗滌3次，膜上滴加ECL發(fā)光液(南京天能生物公司，180-501，180-5001)，顯影儀(南京天能生物，型號：1600/1600R)下顯影并使用Image J軟件分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 依達(dá)拉奉對七氟醚誘導(dǎo)小鼠認(rèn)知功能的影響

訓(xùn)練期間，各組小鼠逃避潛伏期都出現(xiàn)一定程度縮短。與Con組相比，Sev組小鼠第2～4天逃避潛伏期顯著較長(P<0.05)，Sev+Eda-L組小鼠第3～4天逃避潛伏期顯著較長(P<0.05)。與Sev組相比，Sev+Eda-H組小鼠第3～4天逃避潛伏期顯著較短(P<0.05)。與Sev+Eda-L組相比，Sev+Eda-H組小鼠第4天逃避潛伏期顯著較短(P<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠水迷宮訓(xùn)練期間逃避潛伏期

測試期間，各組小鼠在游泳速率沒有差異的情況下，與Con組相比，Sev組、Sev+Eda-L組小鼠首次到達(dá)平臺時間顯著較長(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)、第Ⅰ象限停留時間顯著較少/短(P<0.05)。與Sev組相比，Sev+Eda-H組小鼠首次到達(dá)平臺時間顯著較短(P<0.05)，穿越平臺次數(shù)、第Ⅰ象限停留時間顯著較多/長(P<0.05)。與Sev+Eda-L組相比，Sev+Eda-H組小鼠首次到達(dá)平臺時間顯著較短(P<0.05)，第Ⅰ象限停留時間顯著較長(P<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠水迷宮測試期間突觸記憶功能指標(biāo)

2.2 依達(dá)拉奉對七氟醚誘導(dǎo)小鼠海馬中氧化應(yīng)激水平的影響

與Con組相比，Sev組和Sev+Eda-L組小鼠海馬中SOD活力顯著降低(P<0.05)，MDA水平顯著升高(P<0.05)。與Sev組和Sev+Eda-L組相比，Sev+Eda-H組小鼠海馬中SOD活力顯著增加(P<0.05)，MDA水平顯著降低(P<0.05)，見表3。

表3 各組小鼠海馬中SOD活力與MDA水平

2.3 依達(dá)拉奉對七氟醚誘導(dǎo)小鼠海馬中Iba1表達(dá)的影響

與Con組相比，Sev組、Sev+Eda-L組小鼠海馬中Iba1表達(dá)顯著增加(P<0.05)；與Sev組相比，Sev+Eda-H組小鼠海馬中Iba1表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖1、2。

2.4 依達(dá)拉奉對七氟醚誘導(dǎo)小鼠海馬中TLR4/NF-κB信號通路的影響

與Con組相比，Sev組小鼠海馬中TLR4、p-NF-κB、NLRP3表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),Sev+Eda-L組TLR4、p-NF-κB表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與Sev組和Sev+Eda-L相比，Sev+Eda-H組小鼠海馬中TLR4、p-NF-κB、NLRP3表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

2.5 依達(dá)拉奉對七氟醚誘導(dǎo)小鼠海馬中炎性細(xì)胞因子水平的影響

與Con組相比，Sev組、Sev+Eda-L組小鼠海馬中IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。與Sev組和Sev+Eda-L組相比，Sev+Eda-H組小鼠海馬中IL-6、IL-1β、TNF-α含量顯著降低(P<0.05)，見表4。

3 討論

本研究采用多次麻醉/手術(shù)的方法構(gòu)建了老齡小鼠POCD模型，并通過Morris水迷宮實驗判斷模型構(gòu)建是否成功。臨床前研究中，Morris水迷宮實驗是探究嚙齒類動物突觸學(xué)習(xí)與記憶能力的常用方法[11]。其中，訓(xùn)練期間逃避潛伏期的變化可以反映小鼠的學(xué)習(xí)能力，測試期間的穿越平臺次數(shù)與逃生平臺象限停留時間可以反映小鼠的空間記憶能力。本研究結(jié)果顯示，Sev組小鼠逃避潛伏期較長，且穿越平臺次數(shù)與平臺象限停留時間較少/短，提示Sev組小鼠學(xué)習(xí)與記憶功能損傷，即老齡小鼠POCD模型構(gòu)建成功。臨床上治療缺血性腦卒中常用的依達(dá)拉奉劑量為30～60 mg·d-1，即為0.5～1.0 mg·kg-1·d-1[12]，由于小鼠與人體表面積換算約為12.3，故小鼠尾靜脈給藥劑量為6～12 mg·kg-1·d-1。然而本研究中，Morris行為學(xué)結(jié)果顯示，6 mg·kg-1依達(dá)拉奉對小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力改善并不明顯，當(dāng)依達(dá)拉奉劑量達(dá)到12 mg·kg-1時，小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力得到顯著改善。因此，臨床治療中依達(dá)拉奉劑量上調(diào)后才能發(fā)揮其對POCD的防治作用。

正常生理條件下，細(xì)胞呼吸會生成高反應(yīng)活性的氧自由基，大量的活性氧自由基會作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生具有生物毒性的MDA，造成細(xì)胞膜、線粒體、溶酶體等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)被破壞[13]。七氟醚全麻手術(shù)可誘發(fā)氧自由基釋放增加，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激。此外，七氟醚刺激會干擾正常生理調(diào)節(jié)機制，抑制抗氧化酶活性，破壞抗氧化系統(tǒng)。本研究結(jié)果顯示，Sev組小鼠腦中氧化指標(biāo)MDA水平升高，而抗氧化指標(biāo)SOD活性降低，提示氧化應(yīng)激的發(fā)生。依達(dá)拉奉作為一種高效的自由基清除劑，可經(jīng)血液穿過血腦屏障，清除腦內(nèi)氧自由基，抑制脂質(zhì)過氧化[14]。本研究結(jié)果顯示，雖然與Sev組相比，Sev+Eda-L組MDA水平與SOD活力沒有明顯變化，提示臨床等效劑量6 mg·kg-1依達(dá)拉奉對七氟醚誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)沒有明顯影響。只有當(dāng)依達(dá)拉奉劑量達(dá)到12 mg·kg-1時，MDA水平與SOD活力恢復(fù)至基值，提示臨床中應(yīng)用60 mg·d-1劑量的依達(dá)拉奉治療成人術(shù)后POCD能夠明顯改善認(rèn)知功能。

有研究報道，POCD中氧化應(yīng)激反應(yīng)往往伴隨著過度激活的炎癥反應(yīng)[15]。氧自由基是炎癥反應(yīng)的效應(yīng)因子，小膠質(zhì)細(xì)胞過度活化是氧化應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果，其特征是Iba1急劇增加[16]。因此，針對氧化應(yīng)激反應(yīng)的治療能夠減輕炎癥反應(yīng)。TLR4是位于小膠質(zhì)細(xì)胞表面的模式識別受體，在氧化應(yīng)激中活化并激活下游多種信號通路，導(dǎo)致NF-κB轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，從而促進(jìn)其他炎性細(xì)胞因子釋放，作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[17]。本研究中，6 mg·kg-1依達(dá)拉奉對Iba1表達(dá)沒有顯著影響，對TLR4/NF-κB信號通路和海馬中IL-6、IL-1β及TNF-α含量也沒有顯著影響；然而，12 mg·kg-1依達(dá)拉奉治療后，POCD小鼠海馬中Iba1表達(dá)明顯減少，TLR4/NF-κB信號通路明顯受到抑制，且IL-6、IL-1β與TNF-α含量明顯降低。該結(jié)果提示，依達(dá)拉奉對POCD小鼠海馬中炎癥反應(yīng)的抑制作用存在劑量依賴性。

綜上所述，因為6 mg·kg-1依達(dá)拉奉的抗氧化作用并不顯著，無法改善多次麻醉/手術(shù)造成的小鼠腦中炎性細(xì)胞因子釋放，對小鼠學(xué)習(xí)與記憶能力改善并不顯著。所以，臨床上0.5 mg·kg-1依達(dá)拉奉防治全麻手術(shù)患者POCD存在一定的局限性。同時本研究顯示，對全麻手術(shù)患者POCD的防治作用可以通過上調(diào)依達(dá)拉奉劑量實現(xiàn)，在12 mg·kg-1依達(dá)拉奉的治療中，POCD小鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)受到明顯抑制，炎癥反應(yīng)明顯減輕，小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善。然而，由于依達(dá)拉奉給藥多為靜脈注射，因此針對依達(dá)拉奉劑量梯度上調(diào)的安全性探索仍待繼續(xù)。