唐玉菲,王 雷,楊成偉,劉必勇

(安徽省第二人民醫(yī)院 職業(yè)衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室,合肥 230022)

丹參作為一種中藥材,有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩、涼血消痛等效用,在臨床中應(yīng)用廣泛。在丹參大規(guī)模人工種植中會(huì)施用農(nóng)藥來(lái)保障其產(chǎn)量與質(zhì)量,而栽培過(guò)程中的不合理用藥,會(huì)引起藥材中部分農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問(wèn)題,這不僅直接影響丹參藥材的安全性和有效性,還會(huì)給人類的生命健康帶來(lái)潛在威脅[1]。為了保障丹參藥材的質(zhì)量,有必要對(duì)丹參中農(nóng)藥的殘留水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)。

在多組分農(nóng)藥殘留的檢測(cè)方法中,氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(GC-MS/MS)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)具有靈敏度高、選擇性好、通量高等優(yōu)點(diǎn),是目前主要的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法[2-3]。測(cè)定前,樣品前處理方法的選擇也很重要,其中Qu ECh ERS是一種基于固相萃取和基質(zhì)固相分散技術(shù)于一身的方法,具有經(jīng)濟(jì)高效、簡(jiǎn)單穩(wěn)定的特點(diǎn),在水果、蔬菜的多農(nóng)藥殘留檢測(cè)方面應(yīng)用廣泛[4-9]。Qu ECh ERS在中藥材檢測(cè)中的應(yīng)用也有報(bào)道,但由于中藥材種類繁多且基質(zhì)復(fù)雜,在采用Qu ECh ERS提取凈化時(shí),需要根據(jù)樣品基質(zhì)和目標(biāo)組分的性質(zhì)選用合適的吸附劑[10-12]。文獻(xiàn)[4]以QuECh ERS提取,分散固相萃取法凈化,LC-MS/MS測(cè)定丹參中農(nóng)藥的殘留量[13],但該方法未涉及內(nèi)吸磷、殺蟲脒等《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)第五法規(guī)定的檢測(cè)項(xiàng)目。文獻(xiàn)[14]以石墨化碳黑(GCB)作吸附劑,結(jié)果顯示,中藥材丹參中有機(jī)磷類和磺隆類農(nóng)藥回收率偏低,推測(cè)和這兩類農(nóng)藥易被GCB吸附、難以洗脫有關(guān)。

本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn),使用傳統(tǒng)的含有GCB 的Qu ECh ERS吸附劑凈化丹參藥材時(shí),不僅存在上述部分農(nóng)藥難以洗脫的現(xiàn)象,還存在內(nèi)吸磷、甲拌磷砜等降解導(dǎo)致回收率偏低的現(xiàn)象。二硫蘇糖醇是一種具有線性分子結(jié)構(gòu)的有機(jī)還原劑,氧化后會(huì)形成穩(wěn)定的氧化態(tài)六元環(huán),常作為還原劑或保護(hù)劑應(yīng)用于環(huán)境或醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[15-16]。鑒于此,本工作以1.0 mol·L-1二硫蘇糖醇溶液作保護(hù)劑,以不添加GCB 的Qu ECh ERS吸附劑進(jìn)行凈化,以超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定丹參中30種農(nóng)藥的殘留量,方法操作簡(jiǎn)便、快捷、靈敏度高、重復(fù)性好,適用于丹參中多種殘留農(nóng)藥的快速高效的定性與定量分析,在滿足農(nóng)殘檢測(cè)要求的同時(shí)避免了部分磺隆類和有機(jī)磷類農(nóng)藥在前處理過(guò)程中的損失。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 II型超高效液相色譜;6470型三重四極桿質(zhì)譜儀;SPEX Geno/Grinder 2010-QuEChERs型高通量動(dòng)植物組織研磨機(jī);ME104E型電子天平;XW-80A 型渦旋儀;N-EVAP型12位氮吹儀;5910R 型高速冷凍離心機(jī)。

30種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:100 mg·L-1,編號(hào)為IST29486。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 mg·L-1,由30種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈稀釋制得,于4℃冰箱中儲(chǔ)存。

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:配制空白樣品溶液6份,分別加入10,20,50,100,150,200μL 混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,加入150 μL 水,用乙腈定容至1 mL,配制成質(zhì)量濃度為10,20,50,100,150,200μg·L-1基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

乙腈、乙酸為色譜純;甲酸、甲酸銨、二硫蘇糖醇、無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水硫酸鈉均為分析純;N-丙基乙二胺(PSA)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、硅膠;試驗(yàn)用水為超純水。

丹參樣品購(gòu)自亳州市某中藥材市場(chǎng)。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

ZORBAX Eclipse plus C18色譜柱(150 mm×3.0 mm,1.8μm);柱溫40 ℃;流動(dòng)相A 為含0.1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的10 mmol·L-1甲酸銨溶液,B為乙腈;流量0.3 mL·min-1;進(jìn)樣量5μL。梯度洗脫程序:0～1 min,A 為95%;1～4 min,A由95%降至40%;4～14 min,A 由40%降至0,保持4 min;18～20 min,A 由0 升至95%,保持6 min。

1.2.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源正離子模式;干燥氣溫度250℃,流量11 L·min-1;鞘氣溫度350 ℃,流量12 L·min-1;噴霧壓力140 kPa;毛細(xì)管電壓3 500 V;噴嘴電壓500 V;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1,其中“*”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab.1 MS parameters

表1 (續(xù))

1.3 試驗(yàn)方法

將樣品均勻粉碎,過(guò)三號(hào)篩[篩網(wǎng)孔徑(355±13)μm],轉(zhuǎn)移至干凈的樣品袋中,于4 ℃冰箱中保存。分取(3±0.05)g樣品,置于50 mL聚苯乙烯離心管中,加入1.0 mol·L-1二硫蘇糖醇溶液100μL和1%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸溶液15 mL,渦旋,使藥粉被充分浸潤(rùn),放置30 min。加入15 mL 乙腈,渦旋混勻,以500 r·min-1轉(zhuǎn)速振蕩5 min,加入質(zhì)量比4∶1 的無(wú)水硫酸鎂和無(wú)水硫酸鈉混合粉末7.5 g,立即搖散,以500 r·min-1轉(zhuǎn)速振蕩3 min,于冰浴中冷卻10 min,以4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min。分取上清液9 mL,置于預(yù)先加好4 種Qu ECh ERS吸附劑(無(wú)水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg)的凈化管中,渦旋混勻后置于振蕩器上劇烈振蕩5 min,以4 000 r·min-1轉(zhuǎn)速離心5 min。分取上清液5 mL于玻璃試管中,于40 ℃氮吹濃縮至約0.4 mL,加入150μL 水,用乙腈定容至1 mL,渦旋混勻后過(guò)0.22μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

圖1 基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of the matrix matched mixed standard solution

2.2 提取條件的選擇

乙腈作為Qu ECh ERS 最常用的提取溶劑,適用于極性分布較寬的多殘留農(nóng)藥組分的同時(shí)提取,因此本工作采用乙腈作為提取溶劑。QuEChERS最佳使用環(huán)境為弱酸性環(huán)境,且大多有機(jī)磷類農(nóng)藥在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定,因此試驗(yàn)選擇在提取前增加乙酸溶液浸泡步驟,并比較了不同體積分?jǐn)?shù)(0.2%,0.5%,1%,2%,3%)乙酸溶液的浸泡效果[17]。結(jié)果顯示:當(dāng)乙酸溶液體積分?jǐn)?shù)不大于1%時(shí),提取溶液為淺紅色;乙酸溶液體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加,提取溶液的顏色隨之加深,說(shuō)明共萃取物色素雜質(zhì)增多?？紤]到基質(zhì)效應(yīng)影響,試驗(yàn)選擇乙酸溶液的體積分?jǐn)?shù)為1%。

為了提高農(nóng)藥在提取溶劑中的溶解度,試驗(yàn)選擇在用乙腈提取時(shí)加入質(zhì)量比4∶1的無(wú)水硫酸鎂和無(wú)水硫酸鈉混合粉末,并考察了混合粉末用量(5,7.5,10 g)對(duì)加標(biāo)樣品中30種農(nóng)藥回收率的影響。結(jié)果顯示:回收率隨著混合粉末用量的增加而增大,尤其是甲胺磷和涕滅威;當(dāng)混合粉末的用量不小于7.5 g時(shí),回收率均達(dá)到80.0%以上,且基本穩(wěn)定,說(shuō)明此時(shí)的鹽析效果較好。綜合考慮,試驗(yàn)選擇混合粉末的用量為7.5 g。

2.3 凈化條件的選擇

分別采用傳統(tǒng)QuECh ERS 吸附劑(無(wú)水硫酸鎂900 mg、PSA 300 mg、C18300 mg、硅膠300 mg、GCB 90 mg)和去除GCB 后的Qu ECh ERS吸附劑(無(wú)水硫酸鎂900 mg,PSA 300 mg,C18300 mg、硅膠300 mg)凈化加標(biāo)樣品(加標(biāo)量0.05 mg·kg-1),并比較了其中殺蟲脒和磺隆類農(nóng)藥回收率的變化。結(jié)果顯示:傳統(tǒng)吸附劑去除丹參中色素的效果稍好,但是由于GCB對(duì)于部分農(nóng)藥有很明顯的吸附,氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆和殺蟲脒的回收率明顯下降,其中殺蟲脒的回收率低于50.0%,磺隆類農(nóng)藥的回收率為69.0%～82.0%;而采用去除GCB后的Qu ECh ERS吸附劑凈化時(shí),殺蟲脒回收率提高至87.2%,磺隆類農(nóng)藥的回收率提高至85.0%～96.0%,且其他農(nóng)藥的回收率沒(méi)有明顯變化。鑒于此,試驗(yàn)選擇采用不添加 GCB 的Qu ECh ERS吸附劑凈化樣品。

2.4 保護(hù)劑種類及用量的選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),樣品溶液在空氣中的暴露時(shí)間(包括樣品前處理時(shí)間和前處理后樣品溶液放置時(shí)間)越長(zhǎng),丹參中部分有機(jī)磷類農(nóng)藥回收率越低。如當(dāng)整個(gè)暴露時(shí)間達(dá)到90 min時(shí),內(nèi)吸磷、甲拌磷砜、苯線磷的回收率分別為48.0%,70.0%和75.0%,推測(cè)丹參提取溶液中這幾種有機(jī)磷類農(nóng)藥在前處理過(guò)程中發(fā)生了氧化或降解。鑒于此,試驗(yàn)選擇在樣品前處理過(guò)程中加入一定量的保護(hù)劑,如抗壞血酸和二硫蘇糖醇等來(lái)降低有機(jī)磷類農(nóng)藥的降解。當(dāng)二硫蘇糖醇溶液和抗壞血酸溶液的質(zhì)量濃度均為1.0 mol·L-1時(shí),比較了添加不同抗氧化劑后30種農(nóng)藥的穩(wěn)定時(shí)間。結(jié)果顯示:添加二硫蘇糖醇溶液后,30種農(nóng)藥峰面積在8 h內(nèi)無(wú)明顯變化;添加抗壞血酸溶液后,內(nèi)吸磷的峰面積在4 h后逐漸降低,8 h時(shí)后下降了33%。因此,試驗(yàn)選擇的保護(hù)劑為二硫蘇糖醇溶液,并考察了不同二硫蘇糖醇溶液用量(0,10,50,100,200μL)對(duì)加標(biāo)樣品(加標(biāo)量0.05 mg·kg-1)中內(nèi)吸磷、甲拌磷砜、苯線磷回收率的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 不同二硫蘇糖醇溶液用量下苯線磷、甲拌磷砜、內(nèi)吸磷的回收率Fig.2 Recoveries of phenophos,phorate sulfone and fenamiphos with different amounts of dithiothreitol solution

由圖2 可知:添加了二硫蘇糖醇溶液后,內(nèi)吸磷、甲拌磷砜和苯線磷的回收率有明顯的提高,且隨著用量的增加而增大,當(dāng)二硫蘇糖醇溶液用量不小于100μL時(shí),回收率較高且保持穩(wěn)定。因此,試驗(yàn)選擇的二硫蘇糖醇溶液用量為100μL,并進(jìn)一步考察了此用量的二硫蘇糖醇溶液添加前后加標(biāo)樣品(加標(biāo)量0.05 mg·kg-1)中30種農(nóng)藥回收率的變化,結(jié)果見表2。

表2 添加二硫蘇糖醇溶液前后30種農(nóng)藥的回收率Tab.2 Recoveries of the 30 pesticides before and after addition of dithiothreitol solution

由表2可知,添加二硫蘇糖醇溶液100μL 后,內(nèi)吸磷、甲拌磷砜和苯線磷的回收率分別從48.0%,70.0%,75.0%提高至94.3%,95.5%,98.7%,其他農(nóng)藥的回收率并無(wú)明顯變化,30種農(nóng)藥的回收率為85.8%～108%,說(shuō)明以二硫蘇糖醇溶液作保護(hù)劑時(shí)方法的準(zhǔn)確度較高。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

為了降低基質(zhì)效應(yīng)的影響,以基質(zhì)匹配法定量。按照試驗(yàn)方法測(cè)定基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,以各農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示,30種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為10～150μg·L-1,其他線性參數(shù)見表3。

以空白樣品溶液加標(biāo)的方法進(jìn)行試驗(yàn),分別以不小于3倍、10倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度計(jì)算檢出限和測(cè)定下限,結(jié)果見表3。

表3 線性參數(shù)、檢出限和測(cè)定下限Tab.3 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

表3 (續(xù))

由表3 可知,30 種農(nóng)藥的檢出限為0.001～0.005 mg·kg-1,測(cè)定下限為0.005～0.020 mg·kg-1。

2.6 精密度和回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)空白樣品進(jìn)行3個(gè)濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)濃度水平均重復(fù)測(cè)定6次,計(jì)算回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表4。

由表4 可知,30 種農(nóng)藥的回收率為81.3%～110%,測(cè)定值的RSD為1.3%～11%,說(shuō)明方法的精密度和準(zhǔn)確度均較好。

表4 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.4 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

表4 (續(xù))

2.7 樣品分析

按照試驗(yàn)方法分析3批市售丹參樣品,僅在一批樣品中檢出滅線磷,檢出量為0.012 mg·kg-1,其他農(nóng)藥均未檢出。

本工作在酸性環(huán)境中,以乙腈作提取溶劑提取丹參樣品中30 種殘留農(nóng)藥;以去除了GCB 的QuEChERS吸附劑凈化樣品溶液,有效降低了丹參中氯磺隆、胺苯磺隆、甲磺隆和殺蟲脒的吸附損失;以二硫蘇糖醇作保護(hù)劑,降低了內(nèi)吸磷、甲拌磷砜和苯線磷的降解損失;以UHPLC-MS/MS測(cè)定30種農(nóng)藥的殘留量,方法檢測(cè)對(duì)象涵蓋了《中華人民共和國(guó)藥典》(2020年版)第五法中全部農(nóng)藥殘留檢測(cè)項(xiàng)目,檢出限、精密度和準(zhǔn)確度滿足農(nóng)藥殘留檢測(cè)的技術(shù)要求,可為中藥材丹參中農(nóng)藥殘留的快速篩查提供一種高效、可靠的分析手段。