陳媛媛，劉秀巖，劉福順，楊世海

龍葵愈傷組織生長特性及次生代謝產(chǎn)物積累研究

陳媛媛，劉秀巖，劉福順，楊世海*

吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，國家中醫(yī)藥管理局藥用植物栽培與育種實(shí)驗(yàn)室吉林 長春 130118

建立龍葵愈傷組織最優(yōu)培養(yǎng)體系，研究愈傷組織在不同培養(yǎng)時(shí)間下各生理指標(biāo)變化和澳洲茄堿、澳洲茄邊堿的積累，為工業(yè)化制備澳洲茄堿和澳洲茄邊堿奠定基礎(chǔ)。研究不同外植體及培養(yǎng)基對龍葵愈傷組織誘導(dǎo)的影響，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法優(yōu)化愈傷組織誘導(dǎo)的激素配比，運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)G-250法測定可溶性蛋白含量，TTC還原法測定細(xì)胞活力，鄰苯二酚法測定多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性，氮藍(lán)四唑光化還原法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性，硫代巴比妥酸顯色法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，高效液相色譜法測定澳洲茄堿及澳洲茄邊堿含量。愈傷組織誘導(dǎo)最佳外植體為龍葵莖段，最適培養(yǎng)基為MS＋1.43 mg/L NAA＋2.15 mg/L 6-BA＋2.48 mg/L KT，愈傷組織增殖最適培養(yǎng)基為MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA。愈傷組織鮮質(zhì)量增長量呈“S”型趨勢， 20 d時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最高峰值，可溶性蛋白含量與POD活性均呈先升高后降低的趨勢，SOD活性在20 d與30 d出現(xiàn)2個(gè)峰值，MDA含量呈先降低后升高的變化趨勢，在培養(yǎng)后期PPO活性下降，可能與愈傷組織褐化有關(guān)，澳洲茄堿與澳洲茄邊堿含量變化趨勢一致，在第30天時(shí)達(dá)到峰值。龍葵愈傷組織生長期為25 d，同時(shí)也為最適的愈傷組織鮮質(zhì)量收獲期，25 d后會出現(xiàn)不同程度褐化。其愈傷組織中的次生代謝產(chǎn)物積累和細(xì)胞生長過程通常是負(fù)相關(guān)的，次生代謝產(chǎn)物的合成大多在愈傷組織的生長后期。

龍葵；愈傷組織；增殖；生理特性；次生代謝產(chǎn)物；澳洲茄堿；澳洲茄邊堿

龍葵L.為茄科茄屬一至多年生草本雙子葉植物, 主要為地上干燥部分入藥，具有清熱解毒、活血化瘀、利尿等功效，主治感冒發(fā)熱、細(xì)菌性痢疾、急性乳腺炎、慢性支氣管炎、泌尿系感染、癌性胸腹水等疾病[1-3]?，F(xiàn)代藥理研究表明以澳洲茄邊堿和澳洲茄堿為代表的甾體生物堿是龍葵抗腫瘤的主要有效成分，能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖[4]。近年來，野生龍葵難以滿足人們在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)上的需求，而人工種植龍葵受地域、土壤、溫度和大面積占用耕地等諸多因素限制。國內(nèi)外對于龍葵的報(bào)道研究大多集中于有效化學(xué)成分及相關(guān)生物活性[5-10]、對土壤中砷、鎘等重金屬的富集作用[11-12]、種子萌發(fā)特性研究[13]以及再生體系的建立[14]，迄今為止，關(guān)于龍葵愈傷組織誘導(dǎo)和在增殖過程中生理生化特性及其次生代謝產(chǎn)物積累動態(tài)研究鮮有報(bào)道。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物已經(jīng)獲得重大進(jìn)展[15]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物不受季節(jié)和地理等自然條件限制，可以在完全人工控制的條件下生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物。愈傷組織的誘導(dǎo)是建立植物組織培養(yǎng)體系的前提，同時(shí)也為澳洲茄堿和澳洲茄邊堿規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。本研究基于組織培養(yǎng)技術(shù)，篩選龍葵愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體和最適培養(yǎng)基類別，并運(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化龍葵愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基，測定增殖過程中龍葵愈傷組織可溶性蛋白含量和細(xì)胞活力，繪制生長曲線，測定不同階段愈傷組織中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的活性，丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，以及澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的含量；以期獲得龍葵愈傷組織繼代培養(yǎng)的最佳時(shí)間和澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量的最佳獲得周期，為細(xì)胞工程大規(guī)模生產(chǎn)龍葵次生代謝產(chǎn)物提供理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

材料于2019年采自吉林省四平市梨樹縣龍葵規(guī)范化種植基地，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院楊世海教授鑒定為龍葵L.果實(shí)自然成熟干燥種子，置于4 ℃冰箱保存。對照品澳洲茄堿（202023）、澳洲茄邊堿（202026）購自成都埃法生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；MS培養(yǎng)基（青島海博生物技術(shù)有限公司）、瓊脂粉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）、α-萘乙酸（中國惠世生化試劑有限公司）、6-芐基腺嘌呤（中國新興化工試劑研究所）、激動素（中國惠世生化試劑有限公司）、色譜甲醇（北京化工廠）等。

1.2 儀器

VS-840-1型超凈工作臺（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），立式高壓滅菌鍋（寧波久興醫(yī)療器械有限公司），Waters-e2695型檢測器UV2489（美國Waters有限公司），紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器責(zé)任有限公司），BIC-250型程控人工氣候箱（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），BAS124S電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）等。

2 方法

2.1 誘導(dǎo)龍葵無菌苗

在超凈工作臺中將龍葵種子用濃度為0.1%升汞消毒7 min，后用無菌水沖洗3次，每次30 s，將其均勻接種于MS固體培養(yǎng)基中（蔗糖3%，瓊脂0.7%，pH值為5.8～6.0），置于人工氣候箱中培養(yǎng)（溫度25 ℃、光照度60%、光照時(shí)間12 h/d）。2周后，選擇生長狀態(tài)良好的龍葵無菌苗作為誘導(dǎo)愈傷組織的外植體材料。

2.2 最適外植體篩選

使用高壓滅菌過的解剖刀將龍葵無菌苗分為根、莖、葉3部分，根與莖切為1.0 cm左右的小段，葉片切為0.5 cm×0.5 cm大小，接種于MS＋1.43 mg/L NAA＋2.15 mg/L 6-BA＋2.48 mg/L KT誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基表面。每部位處理11瓶，每瓶5個(gè)外植體。置于人工氣候箱中培養(yǎng)（溫度25 ℃、光照度60%、光照時(shí)間12 h/d），28 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

愈傷組織誘導(dǎo)率＝長出愈傷組織外植體數(shù)/接種愈傷組織外植體數(shù)

2.3 最適培養(yǎng)基篩選

根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用龍葵無菌苗的莖段為外植體，分別配制MS、1/2MS、B5、N6、White 5種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（蔗糖3%、瓊脂0.7%、pH值為5.8～6.0），移液槍分別吸取1.43 mg/L NAA、2.15 mg/L 6-BA、2.48 mg/L KT加入各培養(yǎng)基中，在超凈工作臺中將莖段接種于5種培養(yǎng)基，每種培養(yǎng)基接種11瓶，每瓶5個(gè)外植體，置于人工氣候箱中培養(yǎng)（溫度25 ℃，光照度60%，光照時(shí)間12 h/d），28 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

2.4 愈傷組織誘導(dǎo)最適激素配比

采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件，按照Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)，以NAA、6-BA、KT 3種植物生長調(diào)節(jié)劑為因素，每因素設(shè)計(jì)3個(gè)質(zhì)量濃度水平，以愈傷組織誘導(dǎo)率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)（表1）。將龍葵無菌苗的莖段接種于不同激素配比的固體MS培養(yǎng)基表面，共17組處理，每處理接種11瓶，每瓶5個(gè)外植體，培養(yǎng)條件同上，28 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)

Table 1 Box-Behnken design

水平因素/(mg·L?1) NAA6-BAKT 1000 21.51.51.5 33.03.03.0

2.5 最適增殖激素濃度配比

以生長狀態(tài)良好的龍葵愈傷組織為試驗(yàn)材料，采用3因素3水平完全隨機(jī)試驗(yàn)，6-BA（0.5、1、2 mg/L）和NAA（0.1、0.2、0.5 mg/L），共9個(gè)處理，每處理接種11瓶，每瓶接種0.3 g愈傷組織，培養(yǎng)條件同上，于28 d后用定性濾紙吸干其表面水分稱量，統(tǒng)計(jì)愈傷組織增殖倍數(shù)。

愈傷組織增殖倍數(shù)＝(增殖后愈傷組織質(zhì)量?原愈傷組織質(zhì)量)/原愈傷組織質(zhì)量

2.6 愈傷組織增殖培養(yǎng)

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所篩選的最適增殖激素濃度配制培養(yǎng)基，將初代愈傷組織0.3 g轉(zhuǎn)接至增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件同上。于試驗(yàn)的第5、10、15、20、25、30、35天分別取愈傷組織用于生長曲線繪制、生理生化指標(biāo)和澳洲茄堿及澳洲茄邊堿含量測定。

2.7 愈傷組織生長周期測定

在無菌條件下取增殖愈傷組織，用定性濾紙吸干其表面水分，測定鮮質(zhì)量，每5天取樣1次，每次6個(gè)重復(fù)，繪制生長曲線。

2.8 增殖過程中生理生化指標(biāo)測定

采用考馬斯亮藍(lán)G-250法[16]測定可溶性蛋白含量，TTC還原法[17]測定細(xì)胞活力，鄰苯二酚法[18]測定PPO活性，氮藍(lán)四唑光化還原法[16]測定SOD活性，愈創(chuàng)木酚比色法[16]測定POD活性，硫代巴比妥酸顯色法[16]測定MDA含量，各生理指標(biāo)重復(fù)測定3次，取平均值。

2.9 澳洲茄堿與澳洲茄邊堿含量測定

2.9.1 色譜條件 Agilent ZORBAXSB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-2 mmol/L Na2HPO4水溶液（33∶67）為流動相，柱溫為25 ℃，體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL，檢測波長為203 nm。

2.9.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品澳洲茄堿10.4 mg、澳洲茄邊堿10.2 mg置于10 mL量瓶中，以色譜甲醇定容至刻度線，分別制成1.04 mg/mL的澳洲茄堿和1.02 mg/mL澳洲茄邊堿對照品溶液I。取對照品溶液I 3.75 mL于5 mL量瓶中，以色譜甲醇定容至刻度線，分別制成含0.78 mg/mL澳洲茄堿和0.765 mg/mL澳洲茄邊堿對照品溶液Ⅱ，依次取對照品溶液I 2.5、1.25、0.75、0.25 mL于5 mL量瓶中，以色譜甲醇定容至刻度線，混勻，依次得到含0.52、0.26、0.156、0.052 mg/mL的澳洲茄堿和0.51、0.255、0.153、0.051 mg/mL澳洲茄邊堿對照品溶液III、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ。

2.9.3 供試品溶液的制備 于增殖進(jìn)程的第5、10、15、20、25、30、35天取龍葵愈傷組織作為供試樣品，將樣品烘干至恒定質(zhì)量，研磨后過篩，孔徑為0.25 mm。精密稱取各樣品粉末0.1 g置于10 mL離心管中，精密加入2 mL 80%色譜甲醇，稱定并記錄質(zhì)量。超聲處理（50 ℃、300 W、頻率50 kHz）40 min，放冷，再稱定質(zhì)量，以80%的色譜甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，在進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，濾液即為龍葵澳洲茄堿、澳洲茄邊堿待測樣品。

2.10 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析處理，每一實(shí)驗(yàn)處理重復(fù)3次，并用LSD檢測其差異顯著性，并利用Origin 2017進(jìn)行圖表繪制。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同外植體對龍葵愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

以不同外植體為試驗(yàn)材料均可誘導(dǎo)出愈傷組織，但在誘導(dǎo)率和生長狀態(tài)上均存在顯著差異，見圖1，以莖為外植體所得愈傷組織誘導(dǎo)率最佳為80%，以葉為外植體誘導(dǎo)愈傷組織能力次之為49.09%，以根為外植體誘導(dǎo)愈傷組織能力最弱為16.36%。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，以莖為外植體時(shí)，愈傷組織呈黃綠色質(zhì)地水潤較疏松；以葉片和根為外植體時(shí)，愈傷組織呈黃白色生長緩慢，后期多半褐化。因此，莖是誘導(dǎo)龍葵愈傷組織的最適外植體。

不同小寫字母代表差異顯著（P＜0.05），下同

3.2 不同培養(yǎng)基對龍葵愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

不同培養(yǎng)基中所含營養(yǎng)元素不同，誘導(dǎo)愈傷組織的能力也迥然不同，因此，愈傷組織誘導(dǎo)率和生長狀態(tài)間都存在顯著差異。如圖2所示，誘導(dǎo)率：MS（87.27%）＞N6（64.45%）＞1/2MS（54.55%）＞B5（38.18%）＞W(wǎng)hite（0%）。MS和N6培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織較疏松，呈黃綠色質(zhì)地且生長較快，B5培養(yǎng)基誘導(dǎo)出的愈傷組織為淡黃色，而White培養(yǎng)基上的莖段幾乎全部褐化，不能誘導(dǎo)出愈傷組織，故而，MS培養(yǎng)基為誘導(dǎo)龍葵愈傷組織的最適培養(yǎng)基。

圖2 不同培養(yǎng)基對龍葵愈傷組織誘導(dǎo)率的影響(, n = 3)

3.3 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件的Box-Behnken方法設(shè)計(jì)分析試驗(yàn)，以NAA（A）、6-BA（B）、KT（C）3種植物生長調(diào)節(jié)劑為因素，誘導(dǎo)率為響應(yīng)值。對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到誘導(dǎo)率與各因素變量的二次回歸方程:＝21.59＋21.21 A＋27.42 B＋21.36 C－1.21 AB－2.83 AC＋0.61 BC－3.74 A2－6.36 B2－4.75 C2，其二次回歸方程顯著性檢驗(yàn)及方差分析見表3。

表2 愈傷組織誘導(dǎo)BOX-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 2 BOX-Behnken test design and results of callus induction

試驗(yàn)號NAA/(mg·L?1)6-BA/(mg·L?1)C/(mg·L?1)誘導(dǎo)率/% 13.00.01.561.818 21.51.51.581.818 31.50.03.050.909 41.51.51.585.455 51.50.00.045.455 61.51.51.589.091 71.53.03.078.182 80.01.53.074.545 91.53.00.067.273 103.01.50.070.909 110.03.01.569.091 123.03.01.576.364 131.51.51.587.273 143.01.53.072.727 150.00.01.543.636 161.51.51.583.636 170.01.50.047.273

如表3所示，各因素對愈傷組織誘導(dǎo)率影響的大小依次為6-BA＞NAA＞KT，且NAA、6-BA、KT對愈傷組織誘導(dǎo)的線性效應(yīng)極顯著（＜0.01），二次項(xiàng)A2、B2、C2及交互項(xiàng)AC的值均小于0.01，表明對誘導(dǎo)率的影響也極顯著。

回歸方程模型＜0.01，表明該模型較顯著；失擬項(xiàng)值為0.389 8（＞0.05），表明失擬項(xiàng)相對于誤差項(xiàng)不顯著；模型擬合相關(guān)系數(shù)（2）＝0.981 9，校正決定系數(shù)（2adj）＝0.958 7，表明該模型擬合度良好，誤差較小，可用該回歸模型代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)，對誘導(dǎo)龍葵愈傷組織的培養(yǎng)基配比進(jìn)行預(yù)測和分析。

表3 愈傷組織回歸方程顯著性檢驗(yàn)及方差分析

Table 3 Significance test and variance analysis of callus regression equation

項(xiàng)目平方和自由度均方F值P值顯著性 回歸方程模型3 550.85 9394.54 42.30< 0.000 1** A 279.34 1279.34 29.95 0.000 9** B 992.17 1992.17106.37<0.000 1** C 258.25 1258.25 27.69 0.001 2** AB 29.75 1 29.75 3.19 0.117 3 AC 161.98 1161.98 17.37 0.004 2** BC 7.44 1 7.44 0.80 0.401 5 A2 297.75 1297.75 31.92 0.000 8** B2 863.19 1863.19 92.54< 0.000 1** C2 480.42 1480.42 51.51 0.000 2** 殘差 65.29 7 9.33 失擬項(xiàng) 32.23 3 10.74 1.30 0.389 8 誤差項(xiàng) 33.06 4 8.27 總和3 616.1416

**＜0.01，極顯著差異

**< 0.01, the difference is extremely significant

采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件，得到誘導(dǎo)龍葵愈傷組織的最佳培養(yǎng)基：MS＋1.43 mg/L NAA＋2.15 mg/L 6-BA ＋2.48 mg/L KT，預(yù)測龍葵愈傷組織的誘導(dǎo)率為87.069%，為驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，使用誘導(dǎo)龍葵愈傷組織最適培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)所得誘導(dǎo)率為86.363%，與預(yù)測值相差0.706%，表明由響應(yīng)面優(yōu)化法所得激素配比真實(shí)可靠。各因素對愈傷組織誘導(dǎo)率影響的三維響應(yīng)面分析圖及二維等高線圖見圖3。

圖3 不同激素配比與愈傷組織誘導(dǎo)率的響應(yīng)面分析

3.4 不同激素濃度配比對愈傷組織增殖的影響

將初代培養(yǎng)28 d且生長狀況良好的龍葵愈傷組織接種到以下9組培養(yǎng)基中，結(jié)果如表4所示，在組激素濃度配比中第5組增殖倍數(shù)最高為7.70，愈傷組織呈黃綠色且質(zhì)地疏松，生長速度較快，第1組的增殖倍數(shù)最低為5.85，后期愈傷組織幾乎全部褐化。由此可得，龍葵愈傷組織最適增殖培養(yǎng)基為MS＋1.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L NAA。

表4 不同激素濃度配比對愈傷組織增殖的影響

Table 4 Effect of different hormone concentration ratios on callus proliferation

組別6- BA/(mg·L?1)NAA/(mg·L?1)增殖倍數(shù) 10.50.15.85±0.18d 20.50.25.95±0.28cd 30.50.57.07±0.38abc 41.00.16.18±0.45bcd 51.00.27.70±0.49a 61.00.56.79±0.34abcd 72.00.16.29±0.29bcd 82.00.27.26±0.41ab 92.00.56.51±0.26bcd

3.5 龍葵愈傷組織生長曲線

龍葵愈傷組織生長曲線呈“S”型模式，如圖4所示，在外植體接種的第0～10天為生長延遲期，10～25 d為對數(shù)增長期，期間愈傷組織生長速度最快且愈傷組織為較疏松的黃綠色，25～35 d為生長平緩期，愈傷組織鮮質(zhì)量雖然仍在增長，但增長量較低且伴有嚴(yán)重褐化。因此，25 d為龍葵愈傷組織的最適增殖時(shí)間，同時(shí)可以達(dá)到最大增長量的目的，且減少愈傷組織褐化現(xiàn)象。

圖4 龍葵愈傷組織鮮質(zhì)量增長曲線()

3.6 龍葵愈傷組織生理生化特征

3.6.1 細(xì)胞活力變化 龍葵愈傷組織細(xì)胞活力變化如圖5-a所示，第5天時(shí)愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間較短，愈傷組織需要適應(yīng)環(huán)境，細(xì)胞活力為整個(gè)培養(yǎng)過程的最低值1.13 mg/(g·h)，當(dāng)愈傷組織適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境后，5～20 d細(xì)胞活力呈上升趨勢，20 d時(shí)達(dá)到細(xì)胞活力最高峰值為1.25 mg/(g·h)，在20 d之后愈傷組織增殖過快，呼吸作用旺盛，使得培養(yǎng)基內(nèi)養(yǎng)分消耗殆盡，愈傷組織內(nèi)累積有害物質(zhì)，出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，因此后期細(xì)胞活力降低。

3.6.2 可溶性蛋白含量變化 龍葵愈傷組織可溶性蛋白含量變化呈先升高后降低的變化趨勢，如圖5-b，在第5～25天可溶性蛋白含量呈不斷上升趨勢，并且在25 d時(shí)可溶性蛋白含量達(dá)到最高值4.95 mg/g，推測是由于5～25 d愈傷組織增殖能力較強(qiáng)，細(xì)胞分裂速度較快，細(xì)胞內(nèi)合成大量蛋白質(zhì)，以維持細(xì)胞生長分化。25 d后可溶性蛋白含量降低，可能是由于生存環(huán)境逐步惡劣，愈傷組織生長速度變緩慢且伴隨愈傷組織褐化，從而合成蛋白質(zhì)速率降低。

3.6.3 SOD活性變化 龍葵愈傷組織SOD活性變化如圖5-c，其增殖過程中出現(xiàn)2個(gè)峰值，分別為第20、30天。在第20天時(shí)，愈傷組織處于對數(shù)增長期，愈傷組織生長旺盛且細(xì)胞分裂較快，具有較強(qiáng)的抗脅迫能力，因此SOD活性較高。隨后SOD活性降低，30 d時(shí)SOD活性再次升高至20 d時(shí)水平，這一現(xiàn)象可能是由于培養(yǎng)后期，MS培養(yǎng)基中營養(yǎng)元素被不斷消耗，生存環(huán)境不斷惡化，且伴隨著愈傷組織的褐化。為降低愈傷組織衰老細(xì)胞的氧化自由基，刺激細(xì)胞提高SOD活性以抵抗不良環(huán)境。

3.6.4 POD活性變化 龍葵愈傷組織POD活性變化與可溶性蛋白含量變化趨勢較為相似，呈先上升后下降變化趨勢，如圖5-d，在第5～25天 POD活性呈上升趨勢，在第25天 POD活性到達(dá)最高峰值為2 678.67 U/g。在25 d后由于愈傷組織褐化，POD活性隨之逐漸降低。

3.6.5 PPO活性變化 PPO是愈傷組織褐化的關(guān)鍵酶，龍葵愈傷組織在不同培養(yǎng)時(shí)間的PPO活性變化如圖5-e所示。5～10 d PPO活性呈下降趨勢，在第5天時(shí)酶活性比10 d時(shí)高，可能由于外植體接種時(shí)間較短，褐化現(xiàn)象不嚴(yán)重。10～25 d酶活性呈顯著升高趨勢，在第25天時(shí)達(dá)到最高峰值25.73 U/g，此階段愈傷組織增殖速度較快，多為黃綠色，因此PPO活性升高。由于培養(yǎng)環(huán)境惡化，褐化加劇，25～35 d PPO活性再次降低。

圖5 愈傷組織不同培養(yǎng)時(shí)間相關(guān)生理指標(biāo)變化()

3.6.6 MDA含量變化 龍葵愈傷組織MDA含量呈現(xiàn)下降后上升的變化趨勢，如圖5-f所示。5～25 d MDA含量呈顯著下降趨勢，25 d時(shí)為最低峰值0.643 nmol/g。此階段龍葵愈傷組織處于生長旺盛期，細(xì)胞代謝能力較強(qiáng)，愈傷組織受損傷程度較低。25～35 d MDA含量呈逐漸上升趨勢，由于愈傷組織增殖速度較快，培養(yǎng)基養(yǎng)分消耗速度隨之加快，pH值發(fā)生改變，從而使愈傷組織損傷程度加劇。

3.7 澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量測定結(jié)果

根據(jù)“2.9”項(xiàng)方法，繪制澳洲茄堿、澳洲茄邊堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，以澳洲茄堿對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合的回歸方程為＝5×106＋86 350，2＝0.999 4，表明澳洲茄堿對照品梯度濃度線性關(guān)系好。以澳洲茄邊堿對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合的回歸方程為＝4×106＋29 272，2＝0.999 8，表明澳洲茄邊堿對照品梯度濃度線性關(guān)系好。按照“2.9”項(xiàng)方法進(jìn)樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算澳洲茄堿、澳洲茄邊堿含量。

龍葵愈傷組織中澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量積累變化趨勢一致，如圖6，龍葵愈傷組織中澳洲茄和澳洲茄邊堿含量在前20 d增長較為緩慢，20 d后增長速度加快，在第30天時(shí)澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量達(dá)到最高峰值為1.93、2.70 mg/g，隨后出現(xiàn)下降趨勢。龍葵愈傷組織培養(yǎng)前期，增殖速度較快，細(xì)胞活力和愈傷組織獲得量較高，但次生代謝產(chǎn)物含量較低。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，培養(yǎng)基pH值發(fā)生變化，細(xì)胞之間競爭激烈使培養(yǎng)基營養(yǎng)成分被消耗，愈傷組織受到環(huán)境脅迫，細(xì)胞活力降低，次生代謝產(chǎn)物含量增加。在愈傷組織增殖旺盛時(shí)澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量較低，但在培養(yǎng)后期愈傷組織增殖生長緩慢時(shí)澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量反而更高，說明龍葵愈傷組織中澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的合成和愈傷組織的生長是不平行相關(guān)的。

圖6 愈傷組織澳洲茄堿及澳洲茄邊堿含量積累(, n = 3)

4 討論

誘導(dǎo)愈傷組織是建立植物再生體系和遺傳性轉(zhuǎn)化等的重要途徑，而適宜外植體的選擇是愈傷組織誘導(dǎo)的前提條件。王佳興[19]對黃果龍葵的研究表明，葉片為最適宜的愈傷組織外植體來源。本實(shí)驗(yàn)中以龍葵無菌苗葉片、莖段和根為外植體分別誘導(dǎo)愈傷組織，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同外植體之間愈傷組織誘導(dǎo)率和生長速度有顯著性差異，其中莖段＞葉片＞根，莖段為誘導(dǎo)龍葵愈傷組織的最適外植體。不同種類培養(yǎng)基中所含營養(yǎng)成分不同，本實(shí)驗(yàn)中MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)龍葵愈傷組織誘導(dǎo)率最高，這與付航等[20]對防風(fēng)愈傷組織的研究結(jié)果相一致。由于MS培養(yǎng)基中無機(jī)鹽和硝酸鹽濃度較高，因此最適宜培養(yǎng)龍葵愈傷組織，為龍葵愈傷組織提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)且有利于次生代謝產(chǎn)物的累積。植物組織培養(yǎng)過程中，植物細(xì)胞脫分化形成愈傷組織時(shí)，外源激素可以通過影響內(nèi)源激素的合成及代謝來影響內(nèi)源細(xì)胞分裂素和細(xì)胞生長素的水平。王佳興[19]對黃果龍葵愈傷組織誘導(dǎo)中得到的最適培養(yǎng)基為：MS＋KT 2 mg/L＋NAA 0.1 mg/L，良流等[21]對少花龍葵愈傷組織誘導(dǎo)中得到的最適培養(yǎng)基為：MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.4 mg/L。本實(shí)驗(yàn)中采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)分析軟件對龍葵愈傷組織培養(yǎng)體系進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后得到培養(yǎng)龍葵愈傷組織的最適培養(yǎng)基為：MS＋NAA 1.43 mg/L＋6-BA 2.15 mg/L＋KT 2.48 mg/L。采用2因素3水平完全隨機(jī)試驗(yàn)得到龍葵愈傷組織最適增殖培養(yǎng)基為：MS+6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.2 mg/L。

愈傷組織生長曲線是確定愈傷組織收獲時(shí)間的重要依據(jù)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明龍葵愈傷組織的鮮質(zhì)量增長量變化趨勢呈“S”型，與余慧等[22]對歐洲衛(wèi)矛愈傷組織在光照下的鮮質(zhì)量增長量變化趨勢基本一致。25 d為最適的愈傷組織鮮質(zhì)量收獲期，在實(shí)際生產(chǎn)時(shí)可考慮培育25 d后繼代至另一培養(yǎng)基，從而保證在最大程度上使愈傷組織長期處于快速增殖狀態(tài)。細(xì)胞活力的大小代表著細(xì)胞新陳代謝能力的強(qiáng)弱，也意味著線粒體中有氧呼吸的強(qiáng)弱[23]。0～10 d為生長延遲期，愈傷組織增殖速度較慢，因此細(xì)胞活力在前10 d增長趨勢較為平緩。10～25 d為對數(shù)增長期，20 d時(shí)細(xì)胞代謝能力最強(qiáng)，此時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到最高峰值。25 d時(shí)細(xì)胞分裂基本停止，但愈傷組織體積還在增大，25 d后細(xì)胞完全停止分裂，愈傷組織停止增殖，部分愈傷組織出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，新陳代謝能力減弱，細(xì)胞活力出現(xiàn)降低趨勢。

可溶性蛋白含量的變化在一定程度上反映了愈傷組織的生理代謝變化，可溶性蛋白含量高的愈傷組織，新陳代謝和細(xì)胞分裂能力較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，可溶性蛋白含量變化呈先升高后降低的變化趨勢，與孫睿等[24]對雷公藤愈傷組織的研究結(jié)果相似。POD是高等植物中普遍存在的可以清理細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生有害過氧化物的酶，并且與植物的生長分化密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)中，POD活性與可溶性蛋白含量有一定協(xié)同關(guān)系并表現(xiàn)出相同的變化趨勢，先上升后下降，與劉亞菊等[25]對平貝母鱗片離體培養(yǎng)的研究結(jié)果相似。SOD和POD 2種抗氧化酶協(xié)同作用能減少細(xì)胞中的活性氧和有害過氧化物，從而增強(qiáng)植物抵抗逆境脅迫的能力[24]。在龍葵愈傷組織增殖前期，SOD活性處于上升趨勢，在20、30 d時(shí)均出現(xiàn)峰值，表明愈傷組織受到氧化脅迫，需SOD活性上升以消除多余活性氧。在愈傷增殖的前25 d，MDA含量一直處于下降趨勢，且在25 d時(shí)到達(dá)最低值，表明抗氧化系統(tǒng)啟動后，減弱了細(xì)胞受氧化自由基和有害過氧化物的脅迫。25 d后由于培養(yǎng)基營養(yǎng)成分被消耗、pH值改變、愈傷組織褐化等因素使細(xì)胞受到損傷，因此，MDA含量出現(xiàn)上升趨勢。PPO可以氧化多酚類物質(zhì)形成醌，從而導(dǎo)致愈傷組織產(chǎn)生褐化現(xiàn)象[26]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在愈傷組織增殖的前期PPO活性較低，隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，PPO活性呈現(xiàn)上升趨勢，在25 d時(shí)達(dá)到最大值，但此時(shí)愈傷組織基本無褐化。25 d后愈傷組織褐化嚴(yán)重，PPO活性較低。余慧等[22]研究得出PPO活性越高，褐化程度越低，與本研究結(jié)果一致；此外，任振興等[26]的研究結(jié)果表明PPO活性與褐化程度呈正相關(guān)，兩者結(jié)論不一，可能與植物個(gè)體特性有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

愈傷組織中的次生代謝產(chǎn)物積累和細(xì)胞生長過程通常是負(fù)相關(guān)的，次生代謝產(chǎn)物的合成大多在愈傷組織生長的后期[24]。龍葵全草皆可入藥，但青果期的龍葵果實(shí)中所含澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量最高[3]，有研究表明吉林省四平市的龍葵鮮果中澳洲茄堿和澳洲茄邊堿的含量較高為7.08、7.77 mg/g，干果中澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量為5.08、5.11 mg/g[27]。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量變化趨勢一致，在30 d時(shí)含量最高，為1.93、2.70 mg/g，澳洲茄堿和澳洲茄邊堿含量約為鮮果的0.27、0.35倍，約為干果的0.38、0.53倍。利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)誘導(dǎo)龍葵愈傷組織，是生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物快捷高效的一種方法。本研究為建立高效的龍葵愈傷組織培養(yǎng)體系和工業(yè)化生產(chǎn)澳洲茄堿及澳洲茄邊堿提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Growth characteristics and secondary metabolite accumulation of

CHEN Yuan-yuan, LIU Xiu-yan, LIU Fu-shun, YANG Shi-hai

Laboratory of Cultivation and Breeding of Medicinal Plants of National Administration of Traditional Chinese Medicine, College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China

To establish an optimal culture system forcallus, study the changes of physiological indicators and the accumulation of solasonine and solamargine in callus at different culture time, and lay the foundation for the industrial preparation of solasonine and solamargine.The effects of different explants and culture media on callus induction ofwere investigated, response surface test design method was used to optimize the hormone ratio of callus induction, Coomassie brilliant blue G-250 method was used to determine soluble protein content, TTC reduction method was used to determine cell viability, catechol method was used to determine polyphenol oxidase (PPO) enzyme activity, nitrogen blue tetrazolium photochemical reduction method was used to determine superoxide dismutase (SOD) enzyme activity, guaiacol colorimetry was used for the determination of POD enzyme activity, thiobarbituric acid color method was used to determine the content of MDA, and the content of solasonine and solamargine was determined by HPLC.The best explant for callus induction was the stems of, and the best medium was MS + NAA1.43 mg/L + 6-BA 2.15 mg/L + KT 2.48 mg/L, and the most suitable medium for callus proliferation was MS + 6-BA 1.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L. The fresh weight growth of callus showed an "S"-shaped trend, and the cell viability reached the highest peak at 20 d, the soluble protein content and POD activity both increased first and then decreased. SOD activity showed two peaks at 20 d and 30 d, and the MDA content decreased first and then increased. In the later period of culture, the decrease of PPO activity may be related to callus browning. Solasonine and solamargine content changed in the same trend, reaching a peak on the 30th day.The callus growth period ofis 25 d, and it is also the most suitable harvest period for callus fresh weight. After 25 d, browning will appear in varying degrees. The accumulation of secondary metabolites in the callus and the cell growth process are usually negatively correlated, and the synthesis of secondary metabolites is mostly in the late growth period of the callus.

L.;callus; proliferation; physiological characteristics; secondary metabolites; solasonine; solamargine

R286.2

A

0253 - 2670(2022)16 - 5170 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.16.026

2022-01-06

中藥標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目（202021800）

陳媛媛（1996—），女，在讀碩士，研究方向?yàn)橹兴庂Y源學(xué)。Tel: 15849515335 E-mail: 271019399@qq.com

楊世海，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幧锛夹g(shù)、中藥育種、藥用植物栽培。Tel: 15568877267 E-mail: jlyangs@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]