王 勇，鄭鵬飛，賀麗生，李 俊，陳 俊，高兆明，李文莉，張艾群

(1.中國科學(xué)院深海科學(xué)與工程研究所， 海南 三亞 572000； 2.清華大學(xué)深圳國際研究生院， 廣東 深圳 518055)

1 深海生態(tài)系統(tǒng)特征

海洋占據(jù)了地球表面積的71%，包涵全球97%的水體[1]，其廣闊的水體為生命的起源和各種生命形態(tài)的蓬勃發(fā)展提供了可能。深海通常是指水深超過1 000 m的區(qū)域，一般認(rèn)為是一個(gè)黑暗、高靜水壓、低溫(約4 ℃，熱液除外)和寡營養(yǎng)的極端環(huán)境。在古希臘時(shí)期，人們認(rèn)為深海不存在生命。19世紀(jì)的海洋科考不斷從深海獲取大量生物樣本，探明深海存在大量人類未知的生物且具有超出人類想象的生物多樣性。20世紀(jì)30年代，美國斯科利普斯海洋研究所(Scripps Institution of Oceanography)發(fā)現(xiàn)在海床下數(shù)厘米至數(shù)米的深海沉積物內(nèi)存在細(xì)菌。自從美國“阿爾文號”深潛器在1977年發(fā)現(xiàn)了深海熱液生態(tài)系統(tǒng)，人們認(rèn)識到深海不是“生命的荒漠”[2]。因此，現(xiàn)在及可預(yù)見的未來，深海生物具有重要的科研和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。“新大洋科學(xué)發(fā)現(xiàn)計(jì)劃”(IODP，2012—2023年)將地球深部生命研究(包括深海)作為其四個(gè)研究主題之一。深海生態(tài)系統(tǒng)同樣由生產(chǎn)者和各級消費(fèi)者構(gòu)成。深海微生物參與碳、氮、硫等關(guān)鍵元素循環(huán)，連接地球深部和海洋表面的物質(zhì)循環(huán)，是生物地球化學(xué)循環(huán)過程中重要的組成部分，為各級消費(fèi)者提供營養(yǎng)物質(zhì)，維持著深海生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。這些年新型科考船，載人/無人深潛器等先進(jìn)裝備的發(fā)展為人類了解深海提供了有力的載體和工具，擴(kuò)展了人類探索深海的邊界，但是目前對深海生態(tài)系統(tǒng)和生命過程的一些基礎(chǔ)問題仍然難以回答，例如：①深海有機(jī)物的來源和主要貢獻(xiàn)者；②深海生態(tài)系統(tǒng)的時(shí)空動態(tài)變化規(guī)律和調(diào)控機(jī)制；③深海生物原位活性和生態(tài)功能。對這些問題的探索，有利于我們深刻理解深海生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)性、深海生命的生理生化狀態(tài)和物種的演化過程，同時(shí)為下一步的研究指明方向。

1.1 深海有機(jī)物的來源和主要貢獻(xiàn)者

在深海，生物的分布受到營養(yǎng)來源、溫度等各種環(huán)境因子的驅(qū)動。一般認(rèn)為海洋表層初級生產(chǎn)力產(chǎn)生的大量有機(jī)質(zhì)的垂直沉降是深海最重要的有機(jī)物來源[4]，但是這些有機(jī)質(zhì)是否足夠支持深海遠(yuǎn)超我們想象的大量生物和生態(tài)系統(tǒng)呢？[5]有研究發(fā)現(xiàn)在3 000 m的深海區(qū)，維系生態(tài)系統(tǒng)的有機(jī)物只有約1%來源于海洋表層的有機(jī)顆粒物(particulate organic carbon， POC) 沉降[6]。那么，深海有機(jī)碳的主要來源是什么？化能自養(yǎng)微生物貢獻(xiàn)了多大比例？目前我們對此仍然知之甚少。大量研究也發(fā)現(xiàn)微生物在海洋垂直方向不同深度的水層具有迥然不同的分布特征[3]。據(jù)估算，海水中原核微生物細(xì)胞含量約為1.2×1029個(gè)/mL[7]，而黑暗的深海水體中生活著約占全球生物總量65%的微生物。最近的研究表明，二氧化碳不但在海洋表面被光合微生物吸收，也在深海無光層中被水體中的微生物利用于合成有機(jī)碳[8]。據(jù)估計(jì)，大西洋深海無機(jī)碳固定的速率為每天1.0～2.5 mmol/m2，占真光層(0～200 m)匯入的有機(jī)碳的15%～53%[9]。這些由深?；芪⑸锾峁┑男迈r有機(jī)物支撐了深海生態(tài)系統(tǒng)的正常運(yùn)作，也解釋了深海生物在寡營養(yǎng)條件下的生存之謎。傳統(tǒng)認(rèn)為深海的碳固定與氨氧化過程密切相關(guān)，因?yàn)槎趸脊潭ǖ闹饕袚?dān)者可能是氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea， AOA)。AOA利用氨的有氧氧化產(chǎn)生的還原力，然后通過3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)(3-hydroxypropionate/4-hydroxybutyrate cycle, 3-HP/4-HB cycle)途徑吸收和固定二氧化碳。AOA將氨轉(zhuǎn)化成亞硝酸鹽，而后被亞硝酸鹽氧化細(xì)菌(nitrospirae和nitrospinae)氧化成硝酸鹽。由于氨氧化古菌在海洋中的數(shù)量高于亞硝酸氧化菌(nitrite oxidizing bacteria, NOB)，傳統(tǒng)認(rèn)為前者固定的二氧化碳通量高于后者。但是，最近的原位碳固定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)伴隨亞硝酸氧化過程，NOB固定的二氧化碳通量明顯高于AOA，最高占深海固碳量的45%[10]。這些參與硝化過程的自養(yǎng)微生物占深海微生物群落不足10%，豐度低于AOA，但是卻充當(dāng)著深海初始生產(chǎn)者的重要角色。近期的研究發(fā)現(xiàn)屬于變形菌綱的一些種屬，比如SAR324，可以利用核酮糖1,5-二磷酸羧酶/加氧酶和硫化物氧化耦合來固定二氧化碳[11]，說明依賴于硝化作用和硫氧化作用的化能自養(yǎng)型和混合營養(yǎng)型微生物在深海生物地球化學(xué)循環(huán)過程中也發(fā)揮著重要作用，被認(rèn)為是深海有機(jī)碳來源的另一重要途徑。這些深海自養(yǎng)菌和兼性自養(yǎng)菌可以吸收和利用異養(yǎng)型微生物產(chǎn)生的二氧化碳，形成深海內(nèi)部的碳循環(huán)，同時(shí)也可以吸收大量經(jīng)過海水垂向循環(huán)輸送到深海的二氧化碳。深海異養(yǎng)型微生物以變形桿菌和綠彎菌為主，代表了深海最豐富的微生物類群，參與降解難降解(recalcitrant)有機(jī)質(zhì)(dissolved organic matter， DOM)并釋放二氧化碳[12]。從深淵原位轉(zhuǎn)錄組研究獲知，綠彎菌門的SAR202是深海和深淵最活躍的微生物，對于有機(jī)物的降解和再利用起到至關(guān)重要的作用[13]。深海細(xì)菌SAR11和 SAR406，可能參與有機(jī)物降解和硫元素循環(huán)[14]。在冷泉和熱液噴口附近，來自地球深部和沉積物底部埋藏的水合物釋放了大量還原性物質(zhì)(如氫氣、甲烷和硫化氫等)。這些物質(zhì)的擴(kuò)散導(dǎo)致化能自養(yǎng)微生物介導(dǎo)的有機(jī)物合成異?；钴S[15]，形成了局部繁盛的深海生態(tài)系統(tǒng)。在大型生物體內(nèi)[如貽貝(Bathymodioelusplatifrons)和管蟲(Riftiapachyptila)]也含有大量利用還原性物質(zhì)進(jìn)行固碳的共生微生物[16]。深海微生物利用深海還原性物質(zhì)固定二氧化碳能力為貧瘠的深海提供了豐富的營養(yǎng)來源，同時(shí)提示深海具有巨大的碳埋藏潛力，對實(shí)現(xiàn)全球碳中和目標(biāo)有著重大的應(yīng)用前景。因此，對深海固碳類群和固碳過程的精細(xì)量化和調(diào)控機(jī)制的探索，對進(jìn)一步全面理解深海固碳過程有重要意義。

1.2 深海生物時(shí)空分布規(guī)律

幾乎所有的有機(jī)體，從單細(xì)胞的藍(lán)藻到結(jié)構(gòu)復(fù)雜的哺乳動物，都具有一套感知環(huán)境變化的生物節(jié)律系統(tǒng)，控制著機(jī)體的行為、生理活動，使之更好的適應(yīng)環(huán)境[17]。由于缺乏相關(guān)的研究，目前人們認(rèn)為深海是不存在類似的節(jié)律性。但是最近對深海冷泉貽貝相關(guān)基因的研究表明，深海生物具有節(jié)律性的生物學(xué)基礎(chǔ)，可能受到深海潮汐的影響[18]。

在海洋表層，光照的晝夜變化直接調(diào)節(jié)了初級生產(chǎn)力的速率，構(gòu)建了海洋表層生物的晝夜節(jié)律。但在深海，海洋表面的初級生產(chǎn)力對超過3 000 m的深海影響輕微。但長期來看，由于沉降帶來的有機(jī)物和宏生物(如魚類)垂直周期洄游活動帶來的有機(jī)物，使深海間接受到海洋表面光合生產(chǎn)力的影響。已有研究發(fā)現(xiàn)，深海微生物受到大洋環(huán)流等環(huán)境變化影響，存在明顯的季節(jié)性變化[19-21]，但對深海微生物晝夜節(jié)律變化鮮有報(bào)道[18]。對中國南海北坡海洋中層帶魚類棲息環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)研究表明，由于受到海洋魚類垂直周期洄游活動的影響，該魚類棲息環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)也具有明顯的晝夜群落結(jié)構(gòu)變化[22]。影響深海生態(tài)系統(tǒng)的節(jié)律因素必然與能量轉(zhuǎn)換和物質(zhì)循環(huán)密切相關(guān)，因此探究深海生物的節(jié)律規(guī)律對進(jìn)一步理解深海物質(zhì)循環(huán)有重要意義。研究在深海不同層次和生境條件下，生物進(jìn)化出何種節(jié)律特征，需要對深海進(jìn)行大范圍和連續(xù)時(shí)空的生態(tài)觀測數(shù)據(jù)收集和統(tǒng)計(jì)分析。而目前主流的研究方法和手段只能獲得大洋某個(gè)深度和時(shí)間點(diǎn)的觀測數(shù)據(jù)，無法滿足我們對深海生態(tài)系統(tǒng)的動態(tài)規(guī)律研究。

2 深海生態(tài)系統(tǒng)原位觀測

2.1 深海研究的挑戰(zhàn)和技術(shù)瓶頸

人類對海洋的研究雖然經(jīng)歷了一個(gè)多世紀(jì)的堅(jiān)持不懈的努力，但我們對深海生態(tài)系統(tǒng)的理解仍然不完整。國際上，“TARA”和國際黃昏帶研究計(jì)劃(joint exploration of the twilight zone ocean network, JETZON)計(jì)劃完成了對全球海洋0～1 000 m的生物調(diào)查和相關(guān)環(huán)境因子的采集，實(shí)現(xiàn)了對不同大洋站位的海洋表面和黃昏帶的覆蓋[23-24]。中國科學(xué)家已經(jīng)完成了針對挑戰(zhàn)者深淵的大量生物學(xué)調(diào)查和研究[25-27]。目前對深海生態(tài)系統(tǒng)的研究和調(diào)查正在從某個(gè)時(shí)間點(diǎn)在單個(gè)站位取樣進(jìn)行研究，逐漸過渡到連續(xù)時(shí)空觀測階段。然而在深海實(shí)現(xiàn)對不同站位和時(shí)間季節(jié)的連續(xù)觀測和調(diào)查難度極高；深達(dá)萬米的高靜水壓對裝置的耐壓性能和自動化程度要求甚高；長時(shí)間連續(xù)觀測對裝置的能源供給和水下通訊提出了巨大的考驗(yàn)。這些瓶頸問題的解決需要深海工程技術(shù)方面的配合和同步推進(jìn)，而目前相關(guān)技術(shù)的研發(fā)基礎(chǔ)較為薄弱，限制了海洋學(xué)家對深海生物和生態(tài)系統(tǒng)的進(jìn)一步探索。進(jìn)入新世紀(jì)后，伴隨著國家深海戰(zhàn)略發(fā)展的需要，相關(guān)深海原位監(jiān)測技術(shù)取得了長足的進(jìn)步。比如，萬米載人深潛器，達(dá)到了世界先進(jìn)水平，給我國科學(xué)家提供了在萬米深海長時(shí)間直接觀察深海生物的機(jī)會。

雖然人們認(rèn)識到深海生物/微生物巨大的應(yīng)用和科研價(jià)值，然而深海生物由于其獨(dú)特的生存環(huán)境，使得對其取樣、培養(yǎng)和研究整個(gè)過程都存在極大挑戰(zhàn)。深海的有機(jī)物相對匱乏，使得深海生物進(jìn)化出各種探測環(huán)境變化的器官和胞外傳感系統(tǒng)[28]。深海生物，尤其是微生物對環(huán)境因素變化(氧含量變化、壓力變化等)的響應(yīng)十分敏銳，相關(guān)表達(dá)系統(tǒng)可以快速響應(yīng)并觸發(fā)相關(guān)功能基因的表達(dá)[29]，尤其是涉及有機(jī)物合成必需的二氧化碳、甲烷和氨氣等。因此，通過對這些相關(guān)基因表達(dá)變化進(jìn)行檢測，可以以此作為衡量深海環(huán)境變化的天然指標(biāo)。然而傳統(tǒng)采樣使用水樣瓶將深海海水帶到船載實(shí)驗(yàn)室過濾，這一過程中的壓力、溫度和氣體成分發(fā)生明顯改變，進(jìn)而導(dǎo)致部分菌群快速增殖和發(fā)生應(yīng)激性改變[29-30]，使得原位基因表達(dá)信息丟失(圖1)。這樣的樣品在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室研究中會產(chǎn)生很多不合理的假象，因而影響對生物學(xué)上相關(guān)指標(biāo)(DNA、RNA和蛋白質(zhì)等物質(zhì)的含量與組成，及各種功能基因的量化指標(biāo))的精確測量。傳統(tǒng)采樣方式對深海生物樣品影響較大，限制了對深海極端環(huán)境下生命過程和適應(yīng)機(jī)制的研究，甚至帶來錯(cuò)誤的認(rèn)知。其次，深海微生物所處環(huán)境的特殊性使在實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)高仿真模擬培養(yǎng)變得幾乎不可能。

盡管利用深海環(huán)境模擬進(jìn)行生物培養(yǎng)工作難度較大，但仍然是國際上微生物地球化學(xué)研究領(lǐng)域的一種重要方法。 在深海微生物培養(yǎng)系統(tǒng)研制方面比較先進(jìn)的主要有美國明尼蘇達(dá)大學(xué)地質(zhì)地球物理系、加州大學(xué)伯克利分校，伍茲霍爾研究所(Woods Hole Oceanographic Institution)以及日本海洋科學(xué)研究中心(Japan Agency for Marine-Earth Science and Technology)。國內(nèi)在實(shí)驗(yàn)室模擬培養(yǎng)方面的研究起步較晚。這些可培養(yǎng)微生物在實(shí)驗(yàn)室條件下，由于生存條件改變，連續(xù)的傳代培養(yǎng)會產(chǎn)生“馴化效果”。培養(yǎng)基中添加有機(jī)碳源最終會導(dǎo)致化能自養(yǎng)菌基因組漸漸發(fā)生變化，出現(xiàn)異養(yǎng)性基因橫向轉(zhuǎn)移，變成兼性菌。因此，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)菌株很難真實(shí)反映其原位生境的真實(shí)代謝狀況。模擬培養(yǎng)可以解決微生物基礎(chǔ)生理特性等問題，但無法完成對微生物原位生態(tài)功能和動態(tài)變化的監(jiān)測和評估。因此，深海原位研究在生態(tài)學(xué)上有更重要的意義。浙江大學(xué)等相關(guān)單位合作成功研制了我國首個(gè)深海水體原位微生物培養(yǎng)系統(tǒng)，由控制室、培養(yǎng)室、浮力材等組成。國家海洋局與杭州電子科技大學(xué)聯(lián)合研制的一套能夠在深海原位環(huán)境下獨(dú)立開展工作的深海原位生物實(shí)驗(yàn)平臺，主體由16個(gè)培養(yǎng)倉、原位環(huán)境監(jiān)測傳感器、聲學(xué)釋放器、浮力材料和重力錨等組成[31-32]。系統(tǒng)設(shè)計(jì)最大工作水深6 000 m，可布放到海水與沉積物界面處，進(jìn)行深海微生物的原位長期培養(yǎng)。

隨著深海宏生物采樣和觀測手段的進(jìn)步，依靠國內(nèi)外不斷增加的海洋科考航次，我們對深海生態(tài)系統(tǒng)的認(rèn)識在不斷加深和完善。由于技術(shù)條件限制，對深海宏生物的早期研究主要使用拖網(wǎng)等傳統(tǒng)方法，但捕獲的生物個(gè)體少且多數(shù)情況下難以獲得完整樣本。近年來依靠載人潛器和深潛機(jī)器人的發(fā)展，研究人員獲得高質(zhì)量的生物樣品和原位實(shí)證資料(照片、視頻等)，使人類對深海生態(tài)系統(tǒng)的基本構(gòu)成和分布規(guī)律有了直觀的初步了解。例如，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，深海宏生物遠(yuǎn)比想象的豐富，深海獅子魚最深分布于8 250 m左右，而鉤蝦和海參可生活在挑戰(zhàn)者深淵的最深處。冷泉附近聚集了大量的甲殼類和管蟲等生物[33]。由于深海與科考船或岸上巨大的靜水壓差，多數(shù)生物從深海到實(shí)驗(yàn)室發(fā)生明顯的形態(tài)變化(圖1)。具體而言，對多數(shù)宏生物，巨大的氣壓差異，使細(xì)胞和組織發(fā)生爆裂，無法還原樣品原位環(huán)境下功能基因的表達(dá)信息和蛋白活性特征[34-36]；海參等生物會發(fā)生自融；深淵獅子魚柔軟的表層皮膚會剝離(圖1)。

總之，盡管深海生物調(diào)查與研究已經(jīng)開展了多年，目前所有深海典型生境的生態(tài)學(xué)研究結(jié)果也只能反映某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的靜態(tài)狀況，對于深海生物的繁殖、進(jìn)化、生理特性、種群演替和生態(tài)系統(tǒng)(種群間)物質(zhì)能量傳遞交換知之甚少。實(shí)驗(yàn)室難以模擬深海生物生長所占據(jù)的環(huán)境獨(dú)特特征(高靜水壓、獨(dú)特的營養(yǎng)構(gòu)成)。為了能夠更加準(zhǔn)確、全面的認(rèn)知深海環(huán)境中獨(dú)特的生態(tài)系統(tǒng)和生命過程，進(jìn)行深海生物原位光學(xué)成像觀測和功能基因檢測幾乎是唯一可行的、有效的、高保真的技術(shù)手段。

圖1 傳統(tǒng)深海生物采樣過程對深海生物樣品的潛在影響Fig. 1 Potential impacts of traditional deep-sea biological sampling process on deep-sea biological specimens

2.2 深海原位生物研究策略和裝備研發(fā)

深海生物的新陳代謝、適應(yīng)性和生物多樣性是國內(nèi)外海洋研究的前沿課題。由于生態(tài)脅迫作用, 深海生物在適應(yīng)深海的極端環(huán)境過程中,必定產(chǎn)生了有著特殊功能的基因、蛋白和次級代謝產(chǎn)物。為深入研究深海生態(tài)系統(tǒng)構(gòu)成、演化和功能等重要科學(xué)問題，我們急需新的研究平臺和技術(shù)，其中深海原位生物研究和探測是重點(diǎn)突破方向，它涵蓋了深海原位光學(xué)成像，理化因素檢測，生物原位采樣和基因活性測定等，將引領(lǐng)深海生命科學(xué)研究跨入一個(gè)新階段。

圖2 美國蒙特利灣研究所的環(huán)境樣品處理器和深海升級版D-ESPFig. 2 ESP and D-ESP from MBARI(a)環(huán)境樣品處理器;(b)、(c)深海升級版D-ESP。修改自文獻(xiàn)[39]和[40]。

盡管國內(nèi)外已經(jīng)開發(fā)了一些深海微生物原位保壓取樣裝置，但由于保壓取樣器容量小、不保溫等因素，深海特有基因和生命過程的研究仍無法進(jìn)行[37-38]。2007年，美國蒙特利灣水族館研究所(Monterey Bay Aquarium Research Institute，MBARI)和伍茲霍爾海洋研究所實(shí)驗(yàn)室的海洋學(xué)家研發(fā)了1 000 m級環(huán)境樣品處理器(environmental sample processor， ESP)[39]，對海洋微生物和毒性物質(zhì)進(jìn)行了原位基因芯片檢測。2010年，他們還成功地利用4 000 m級環(huán)境樣品處理器(D-ESP)進(jìn)行了深海甲烷氧化基因pmoA的定量PCR擴(kuò)增(qPCR)實(shí)驗(yàn)，對目標(biāo)基因的表達(dá)量和特定菌群的豐度進(jìn)行了實(shí)時(shí)檢測[40]，而且利用生物基因探測到的甲烷濃度低于化學(xué)傳感器的檢測限。這些原位基因檢測都是依賴原位微生物的富集、過濾、裂解和核酸純化過程[圖2(a)、(c)]。原位過濾后的海水中的物質(zhì)還通過D-ESP集成的深海質(zhì)譜儀進(jìn)行了檢測。這一整套裝置已經(jīng)應(yīng)用于4 000 m深的海底和800 m深的甲烷滲漏區(qū)的原位檢測，并接入MBARI的MARS(Monterey Accelerated Research System)海底觀測網(wǎng)絡(luò)。2014年，美國夏威夷大學(xué)利用ESP系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)了海洋表面微生物存在短周期節(jié)律性過程[17,40-41]?？偟膩碚f，ESP的相關(guān)成果極大促進(jìn)了科學(xué)家對深海原位觀測的重視[40,42]。

2.3 深海原位組學(xué)研究進(jìn)展

深海原位組學(xué)是使用新一代測序技術(shù)對深海原位提取核酸和固定樣品進(jìn)行高通量測序和組學(xué)分析，為全面準(zhǔn)確地揭示深海微生物在深海的適應(yīng)機(jī)制、物質(zhì)循環(huán)和動態(tài)變化規(guī)律提供了可行性[13,36]。深海生物轉(zhuǎn)錄組的瓶頸問題是RNA分子容易降解，半衰期最多只有12 min[30]。對RNA分子進(jìn)行原位固定或者提取，防止生物在回收過程中RNA出現(xiàn)變化和降解是研究深海生物原位活性和生理代謝特征的前提。通過利用深海原位提取的RNA進(jìn)行宏轉(zhuǎn)錄組分析，我們可以在轉(zhuǎn)錄層面定量或半定量地揭示哪些微生物以何種方式參與深海碳、氮、硫循環(huán)，它們的貢獻(xiàn)率是多少，能夠更精細(xì)地量化深海物質(zhì)循環(huán)過程。同時(shí)，深海的有機(jī)物相對匱乏，使得深海微生物進(jìn)化出各種探測環(huán)境變化的跨膜傳感系統(tǒng)，對環(huán)境的響應(yīng)十分敏銳[29]。原位宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)或許能捕捉到深海微生物對環(huán)境響應(yīng)的即時(shí)變化。為了準(zhǔn)確地探知深海生物功能基因的表達(dá)和作用機(jī)制，發(fā)掘深海生物的未知功能基因，原位生物樣品處理與探測關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)勢在必行。

深海原位宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析離不開相應(yīng)的深海宏基因組作為本底參照。后者利用高通量測序和生物信息學(xué)方法對深海環(huán)境樣品DNA直接測序，通過組裝和分揀，獲得同一類群微生物的基因組草圖(metagenome-assembled genome， MAG)，進(jìn)而對其MAG的分類地位、新陳代謝方式進(jìn)行解析。目前由于大多數(shù)微生物不可培養(yǎng)，對基因組草圖的研究是深海微生物研究的主要手段[43]。通過這種方法，近些年來報(bào)告了大量海洋廣泛分布的氨氧化古菌SAR202和 SAR406等類群的基因組及其特征[13-14,44-45]。通過相關(guān)算法，可以把宏轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)譜和宏基因組中獲得的MAG聯(lián)系起來，進(jìn)而揭示深海原位微生物類群中活躍的微生物，同時(shí)可以定量或半定量研究微生物的代謝過程。然而，深海原位宏基因組研究難點(diǎn)在于復(fù)雜生態(tài)環(huán)境中難以分離到高質(zhì)量的MAG，其主要原因是目前技術(shù)手段得到的總DNA量較低且質(zhì)量不高，并且群落復(fù)雜。這樣的深海DNA可通過加大二代高通量Illumina測序深度等手段進(jìn)行補(bǔ)救，但難以用于三代高通量測序獲得長片段基因組序列。這一瓶頸問題可以通過深海原位大體積微生物過濾和固定裝置解決。中國科學(xué)院深?？茖W(xué)與工程研究所(深海所)自主研發(fā)了一套可在全海深環(huán)境下自動完成海水中微生物過濾和RNA固定的裝置(insitumicrobial filtration and fixation, ISMIFF)，可以最大程度上避免了壓力和溫度等環(huán)境因子驟變對核酸的破壞[36]。

深海微生物原位核酸提取裝置(multipleinsitunucleic acid collections， MISNAC)是由深海所自主研發(fā)的一套可在深海環(huán)境下自動完成海水過濾、微生物裂解和核酸提取的深海原位生物實(shí)驗(yàn)裝置[46][圖3(a)、(b)]。該裝置安裝于“鳳凰”號深海原位生物研究平臺上，最多可以完成9個(gè)不同時(shí)間序列的核酸樣品采集，而且所有步驟均自動完成[圖3(c)至(e)]。該平臺不僅可以用于研究不同時(shí)間段微生物群落變化，還可以開展微生物定向富集培養(yǎng)，研究不同底物作用下的原位微生物生理代謝活性。

2019年的“鳳凰”號海試中，MISNAC獲得的連續(xù)時(shí)段微生物核酸揭示了深海1 000 m水深的微生物群落結(jié)構(gòu)[46]。最近，基于原位獲得的核酸進(jìn)行的組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：相對于傳統(tǒng)采樣方式使用的Niskin瓶，MISNAC可以最大程度地還原深海原位的群落結(jié)構(gòu)和原位微生物基因表達(dá)活性，可以對連續(xù)晝夜條件下的微生物動態(tài)變化進(jìn)行深入解析。通過對MISNAC裝置和Niskin水樣瓶獲得樣品的比較發(fā)現(xiàn)，真核和原核微生物群落結(jié)構(gòu)都具有明顯差異。Niskin采水瓶樣品中含有大量MISNAC原位樣品中很少的厚壁菌(firmicutes), 且在轉(zhuǎn)錄組中沒有活性，表示這些菌在大量增殖后變成了休眠的孢子[圖4(a)]；Niskin水樣瓶樣品還含有MISNAC原位樣品中很少出現(xiàn)的子囊菌門(Ascomycota)和刺胞動物門(Cnidaria)。 通過比較原位宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組中的真核生物群落，我們發(fā)現(xiàn)MISNAC樣品中較少的纖毛亞門(Ciliophora)，卻是轉(zhuǎn)錄組中最活躍的，而占真核微生物群落42%的有孔蟲門(Reraria)幾乎沒有轉(zhuǎn)錄活性，暗示這些深海的有孔蟲是休眠或死掉的生物[圖4(b)]。這些結(jié)果在不同時(shí)間段的樣品分析中重復(fù)出現(xiàn)，可信度很高，說明基于深海宏基因組的相關(guān)分析很可能無法真實(shí)反映深海生物原位的生態(tài)貢獻(xiàn)。

MISNAC可以對數(shù)天內(nèi)若干個(gè)小的時(shí)間間隔(幾個(gè)小時(shí)到幾十分鐘)的微生物的基因表達(dá)和群落變化進(jìn)行連續(xù)、比較精確的定量或半定量研究。在更長的時(shí)間尺度上，深海原位研究可聯(lián)合物理、化學(xué)傳感器提供的長期連續(xù)觀測數(shù)據(jù)，基于各種算法挖掘出與微生物的群落或微生物參與的某些代謝特征的相關(guān)痕跡，即通過多參數(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)耦合，才能實(shí)現(xiàn)對某目標(biāo)海域微生物介導(dǎo)的物質(zhì)循環(huán)進(jìn)行連續(xù)動態(tài)觀測和量化分析。中科院南海海洋研究所已經(jīng)完成了“深海紫外激光微生物檢測儀”的研制和海試，通過對不同深海細(xì)菌的紫外光譜可以辨別出主要深海類群的特征譜峰[47]，可以實(shí)現(xiàn)較長時(shí)間范圍內(nèi)對微生物主要類群的檢測。

圖3 深海原位微生物核酸提取裝置工作原理圖和安裝于“鳳凰”號的深海原位生物實(shí)驗(yàn)平臺的深海原位工作圖Fig. 3 Schematic model of MISNAC and in situ working in cruise on Phoenix deep-sea biology experimental station(a)、(b)為工作原理圖；(c)至(e)為深海原位工作圖。

圖4 不同采樣方式對群落結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Impacts of sampling methods on microbial community structureMISNAC和Niskin獲得的南海1 000 m水深環(huán)境樣品的宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組中基于原核生物16S核糖體(a)和真核生物18S核糖體片段(miTags)(b)的群落結(jié)構(gòu)比較分析。小類(<2%)進(jìn)行了合并處理。

2.4 深海原位生態(tài)監(jiān)測和原位生物實(shí)驗(yàn)室構(gòu)想

對深海進(jìn)行原位、實(shí)時(shí)和連續(xù)的生態(tài)監(jiān)測是未來揭示深海生物適應(yīng)機(jī)制和深海物質(zhì)循環(huán)的重要手段，各國深?？茖W(xué)研究機(jī)構(gòu)都開始致力于探索和發(fā)展深海原位技術(shù)。原位生物實(shí)驗(yàn)室，簡單來說，就是能夠在深海自動完成原位光學(xué)成像觀測、樣品采集、分離、處理和檢測等流程的綜合實(shí)驗(yàn)體系。它包括了光學(xué)成像系統(tǒng)、實(shí)驗(yàn)分析測試系統(tǒng)和支撐實(shí)驗(yàn)室長期連續(xù)工作的數(shù)據(jù)傳輸、能源、電氣系統(tǒng)等(圖5)，可以記錄樣品采集和實(shí)驗(yàn)過程中的環(huán)境要素信息(溫度、鹽度和溶解氧等)，把微生物樣品分離成單細(xì)胞，或者直接裂解后提取高純度核酸和蛋白質(zhì)，甚至得到基因組測序數(shù)據(jù)和基因定量PCR數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)室所需裝備(比如通用測序系統(tǒng)、基因檢測系統(tǒng)、化學(xué)物質(zhì)檢測系統(tǒng))的深海轉(zhuǎn)移應(yīng)用需要對其進(jìn)行改裝，使其小型化和低能耗，適合深海高壓環(huán)境下自動化作業(yè)和數(shù)據(jù)自行處理。同時(shí)利用聲學(xué)、激光等海洋通訊技術(shù)，結(jié)合船載和衛(wèi)星通訊技術(shù)，可以將觀測數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)傳回到岸基數(shù)據(jù)中心。利用高機(jī)動載體構(gòu)建深海原位生物實(shí)驗(yàn)室水下網(wǎng)絡(luò)，實(shí)現(xiàn)深海原位生物實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)化、在線化。

2.4.1 深海實(shí)時(shí)生態(tài)觀測及數(shù)據(jù)傳輸系統(tǒng) 利用智能深海平臺的長期連續(xù)工作能力，深海生物小型化實(shí)時(shí)光學(xué)觀測裝置可以用于深海各深度的生態(tài)觀測和統(tǒng)計(jì)。深海影像技術(shù)是深海原位生物實(shí)驗(yàn)室的重要應(yīng)用領(lǐng)域，可開展遠(yuǎn)程監(jiān)測、遠(yuǎn)程直播，甚至遠(yuǎn)程實(shí)驗(yàn)操控等應(yīng)用前景。1992年美國伍茲霍爾海洋研究所提出了浮游生物錄像機(jī)(video plankton recorder，VPR)，成為了現(xiàn)代浮游生物原位探測系統(tǒng)的先驅(qū)。伴隨著半導(dǎo)體技術(shù)的突飛猛進(jìn)，浮游動物水下攝像機(jī)探測技術(shù)得到迅速發(fā)展，出現(xiàn)了多種基于水下攝像機(jī)的浮游動物探測成像系統(tǒng)，如UVP(underwater vision profiler)、VPRⅠ/Ⅱ/Ⅲ以及ISIIS(insituichthyoplankton imging system)等[48]。

2015年2月，歐盟UTOFIA (underwater time of flight image acquisition)計(jì)劃啟動了用于漁業(yè)資源評估的“下一代水下攝像機(jī)”的研制工作，由歐洲不同國家的7個(gè)單位參與。UTOFIA攝像機(jī)具備視頻幀頻三維成像功能，相比于傳統(tǒng)水下成像，探測距離提高2～3倍。由中國科學(xué)院半導(dǎo)體研究所研制的深海原位生物三維成像系統(tǒng)“鳳眼”， 以“鳳凰”號為載體，可在水下構(gòu)建非機(jī)械光立體采樣區(qū)，并同時(shí)獲取高分辨率的生物二維強(qiáng)度圖像和三維圖形圖像，從而利用三維圖像中目標(biāo)間的空間差異，提高交疊目標(biāo)的數(shù)量統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確度，結(jié)合光立體采樣區(qū)的體積信息還可反演出生物豐度信息等[49]?！傍P眼”系統(tǒng)最大工作深度3 000 m，是國際上首次將激光選通三維成像技術(shù)用于深海宏生物探測。

利用海底觀測網(wǎng)和海底光電纜可以實(shí)現(xiàn)我國南海從淺海到4 000 m深海的實(shí)時(shí)播放，對研究我國南海海域的生態(tài)系統(tǒng)特征、冷泉區(qū)演變過程以及海底生態(tài)年際變化等重大科學(xué)問題提供數(shù)據(jù)和樣品方面的需求[50-51]。2020年11月，中國科學(xué)院等多家機(jī)構(gòu)聯(lián)合研制的“奮斗者”載人潛水器和深海視頻著陸器“滄海”和“凌云”在馬里亞納海溝進(jìn)行了聯(lián)合作業(yè)，實(shí)現(xiàn)了全海深4K超高清視頻拍攝傳輸和全球首次萬米海底電視直播，對于實(shí)現(xiàn)深海生態(tài)的長期原位觀測驗(yàn)證了技術(shù)上的可行性。

2.4.2 深海生物樣品處理和通用測序系統(tǒng) 隨著基因測序技術(shù)的發(fā)展，以納米孔測序?yàn)橹鞯母咄壳倚⌒突男乱淮鷨畏肿訙y序平臺逐漸成為主流，為其深海原位應(yīng)用提供了可操作性。在已有的深海原位樣品富集、細(xì)胞裂解和核酸收集裝置的基礎(chǔ)上，我們可以進(jìn)一步擴(kuò)展下游核酸純化技術(shù)，整合實(shí)現(xiàn)深海原位條件下的一體化測序平臺。同時(shí)，在平臺上游，配套利用流式細(xì)胞儀對深海微生物和幼蟲進(jìn)行原位分揀，亦或通過微液滴包埋分揀技術(shù)進(jìn)行微生物高通量化的分揀和原位培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)對深海生物的隔離檢測，提高檢測的定向性(圖5)。

2.4.3 深海生物原位基因檢測系統(tǒng) 深海原位基因檢測系統(tǒng)是通過構(gòu)建深海生物保守的核糖體 RNA基因片段和深海微生物物質(zhì)循環(huán)關(guān)鍵功能基因(氨氧化、反硝化、產(chǎn)甲烷和硫還原等)的探針序列，集成高通量基因芯片技術(shù)作為深海生物原位核酸純化裝置的下游配套設(shè)備，實(shí)現(xiàn)不經(jīng)測序的基因檢測和物種鑒定，以實(shí)時(shí)動態(tài)監(jiān)測深海原位微生物的類群組成和功能基因代謝活性。

2.4.4 深海生物代謝物檢測系統(tǒng) 深海的高靜水壓給生命相關(guān)物質(zhì)的檢測構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn)。拉曼光譜是研究生命相關(guān)物質(zhì)的有效方法之一，其通過對分子官能團(tuán)震動模式的測量，得到具有指紋特性的震動光譜，從而反映分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)，可在接近自然狀態(tài)下研究生物大分子的結(jié)構(gòu)及其變化。利用紫外拉曼和電化學(xué)傳感器等新興的物質(zhì)檢測技術(shù)，建立深海生物代謝物質(zhì)數(shù)據(jù)庫，將設(shè)備封裝應(yīng)用于深海，實(shí)現(xiàn)原位條件下實(shí)時(shí)的代謝物質(zhì)檢測，以利于還原深海生物真實(shí)的物質(zhì)代謝類別和水平，整合利用多波段的激光檢測儀器可實(shí)現(xiàn)物質(zhì)間的交差檢測。

近些年，我國多個(gè)科研團(tuán)隊(duì)基于該技術(shù)在深?；瘜W(xué)物質(zhì)探測上取得了突破。中國科學(xué)院海洋研究所利用我國自主研發(fā)的深海激光拉曼光譜原位探測系統(tǒng)在深海熱液區(qū)(1 400 m)發(fā)現(xiàn)了具有超臨界二氧化碳流體噴發(fā)的熱液噴口[52]，同時(shí)借助該工具首次在深海熱液區(qū)發(fā)現(xiàn)氣態(tài)水[53]?！吧詈Ｔ惶綔y深紫外激光拉曼光譜儀”由中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所自主研發(fā)，在深海原位環(huán)境下深紫外拉曼光譜儀器完美解決了常規(guī)拉曼光譜易受海洋微生物及有機(jī)質(zhì)熒光干擾的問題，并克服了深海高壓和著陸沖擊等困難，成功于南海獲得DNA分子信號，為進(jìn)一步探究深海環(huán)境中存在的生物大分子信息提供了新的途徑。深海生物細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的原位紫外拉曼檢測方法和深海培養(yǎng)菌株的拉曼光譜數(shù)據(jù)庫也逐漸成熟。

圖5 深海原位生物實(shí)驗(yàn)室設(shè)想Fig. 5 Concept of deep-sea in situ biological laboratory

3 深海原位生物實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用前景和展望

3.1 深海原位微生物固碳與碳中和

針對地球二氧化碳濃度不斷升高，全球提出了“碳中和(carbon neutrality)”目標(biāo)，這是本世紀(jì)中葉各個(gè)國家重要的控制目標(biāo)。其中對碳匯研究方面，即碳固定方面，深海微生物豐富高效的碳固定途徑已經(jīng)引起很多研究者的注意。深海1 000 m以下的微生物在全球碳吸收和控制溫室氣體排放方面可能具有不可估量的作用，但是深海固碳能力的評估和實(shí)現(xiàn)途徑依賴于人們對深海的認(rèn)識，其中深海原位微生物無機(jī)碳吸收過程和量化的研究尚處于起步階段。

Jiao等(2010)提出的“微型生物碳泵(microbial carbon pump， MCP)指明了深海碳循環(huán)的可能機(jī)制[8]，解釋了海洋巨大溶解有機(jī)碳庫的來源，得到國際同行的廣泛關(guān)注和認(rèn)同。 為了響應(yīng)國家的“碳中和”計(jì)劃，基于MCP理論的“海洋負(fù)排放”機(jī)制和技術(shù)實(shí)現(xiàn)是目前的研究熱點(diǎn)[54-55]，但是目前對海洋儲碳機(jī)制還有很多問題需要研究，尤其是深海微生物原位固碳能力和機(jī)制資料較少[4]，很多基本問題尚未解答，例如深海參與固碳的微生物有哪些？通量是多少？其代謝機(jī)制受到哪些因素調(diào)控？氨氧化古菌和細(xì)菌在深海固碳過程中，互作機(jī)制是什么？二氧化碳如何輸送到深海？這些問題的回答都需要長期、多學(xué)科交叉的持續(xù)研究。這些問題都需要深海原位生物實(shí)驗(yàn)室提供長期、連續(xù)和第一手的資料為“碳中和”的“海洋負(fù)排放”機(jī)制和技術(shù)可行性、經(jīng)濟(jì)性和可選路徑提供最基礎(chǔ)的數(shù)據(jù)支撐。這些凸顯出深海原位生物實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的重要性和必要性。

3.2 深?；蛸Y源的挖掘和利用

深海環(huán)境原位宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的獲得，將有助于我們發(fā)現(xiàn)更多新的深海微生物類群和深入探究深海“暗物質(zhì)”微生物的生理特征[56]。同時(shí)深海微生物生命過程的原位觀測，有助于深入探討海洋環(huán)境中微生物的生態(tài)功能，精細(xì)量化其物質(zhì)通量，揭示海洋環(huán)境物質(zhì)循環(huán)和能量流動的分子機(jī)制和規(guī)律。隨著生物信息學(xué)分析、三代測序技術(shù)及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，結(jié)合新型原位實(shí)驗(yàn)設(shè)備的研制，我們不僅能通過分離培養(yǎng)獲得更多的深海微生物類群，還可以利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過過表達(dá)細(xì)胞內(nèi)目的基因、抑制和敲除等分子手段，探究大量未知基因的功能，挖掘和利用深海生物基因資源。

3.3 推動海洋高端裝備產(chǎn)業(yè)

工程技術(shù)與生物學(xué)研究的需求相結(jié)合將會產(chǎn)生更多功能強(qiáng)大的采樣設(shè)備。相關(guān)設(shè)備的研制可以帶動我國深海原位檢測和研究設(shè)備的研發(fā)和關(guān)鍵技術(shù)的突破。例如我國萬米載人深潛器“奮斗者”號的研制成功，不僅實(shí)現(xiàn)了相關(guān)產(chǎn)業(yè)和技術(shù)的國產(chǎn)化替代，同時(shí)培養(yǎng)了一大批相關(guān)產(chǎn)業(yè)技術(shù)團(tuán)隊(duì)和公司，為國內(nèi)深海裝備的產(chǎn)業(yè)化帶來了示范效應(yīng)。深海原位生物實(shí)驗(yàn)室的研發(fā)同樣需要材料、設(shè)備制造和配套軟件等相關(guān)產(chǎn)業(yè)的協(xié)同發(fā)展，對我國海洋產(chǎn)業(yè)走向深海、走向高端和產(chǎn)生高附加值是一個(gè)重要機(jī)會。

綜上所述，深海原位生物實(shí)驗(yàn)室及其配套技術(shù)的發(fā)展是科學(xué)研究走向深海的必經(jīng)之路，同時(shí)也為我國社會科技和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展提供了新的契機(jī)。