殷鵬昌, 趙良柱, 閆紅印

平煤神馬集團總醫(yī)院普外科(河南平頂山 461700)

近年來，內分泌惡性腫瘤甲狀腺癌是女性常見癌癥，隨著臨床對頸部超聲檢查及超聲引導下的細針穿刺活檢廣泛應用，其檢出率迅速增加[1-2]。據統(tǒng)計，甲狀腺癌在2000年檢出率為每10萬人中的10.3人，到2012年已增長至每10萬人中的21.5人[3]。而流行病學統(tǒng)計數據顯示，全球每年新增及死亡的甲狀腺癌病例約有56.72萬例及4.11萬例[2]。盡管以外科手術、內分泌治療和放射性核素131I為主的治療手段已達到較好的總生存率，但復發(fā)、轉移仍易導致治療失敗[4]。故尋找與甲狀腺癌復發(fā)、轉移有關的發(fā)生機制，以降低治療失敗率，對改善患者生存具有重要意義。上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)與腫瘤復發(fā)或發(fā)生遠方轉移密切相關，是上皮細胞向間質細胞轉化的過程[5-6]。叉頭框D3蛋白(forkhead box D3，FOXD3)是叉頭框轉錄因子(forkhead box，FOX)蛋白家族成員之一，可以參與調控糖類代謝、免疫調節(jié)、細胞周期調控等多個過程，與上皮性卵巢癌等腫瘤的進展相關[7]。微小RNA(microRNA，miRNA)可通過沉默靶基因，在癌癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的調控作用[8]。研究報道，miR-524-5p能調節(jié)胃癌細胞的增殖和轉移，增強胃癌細胞的順鉑敏感性，并阻止甲狀腺癌進展，是靶向多種類型癌細胞中多個基因的癌癥抑制物[9-10]，但其在甲狀腺癌中的具體作用機制還有待深入研究。本研究于2020年3—10月開展研究，探討miR-524-5p調控FOXD3對甲狀腺癌細胞SW579增殖、凋亡及EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 人甲狀腺癌細胞SW579(美國ATCC細胞庫，貨號：HZ-CC100702)；qRT-PCR試劑盒(美國Promega公司，貨號：K1002S)；negative control-miR-524-5p、hsa-miR-524-5p mimic、FOXD3 siRNA序列及miR-524-5p、FOXD3、U6、GAPDH引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；CCK-8試劑(日本同仁化學研究所，貨號：CK-04)；AnnexinV-FITC/PI試劑盒購自哈爾濱新?；驒z測，貨號：S0185；FOXD3抗體(貨號：ab64807)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體(貨號：ab231303)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)抗體(貨號：ab76057)、波形蛋白(Vimentin)抗體(貨號：ab24525)、纖連蛋白(Fibronectin)抗體(貨號：ab2413)、GAPDH抗體(ab181602)(美國abcam)；ABI 7500 qRT-PCR儀(美國Applied Biosystems)；MODEL550酶標儀(美國Bio-Rad)。研究經我院倫理委員會審核批準(202001-04)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SW579細胞復蘇后，用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，并消化、傳代。

制備SW579細胞單細胞懸液，接種96孔培養(yǎng)板(1×104個/孔)，分為：空白對照組、mimic NC組、miR-524-5p mimic組、siRNA NC組和共轉染組，其中mimic NC組、miR-524-5p mimic組細胞分別轉染negative control-miR-524-5p、hsa-miR-524-5p mimic；siRNA NC組同時轉染hsa-miR-524-5p mimic和NC-siRNA；共轉染組SW579細胞轉染hsa-miR-524-5p mimic與FOXD3 siRNA。

1.2.2 miR-524-5p、FOXD3 mRNA表達檢測 SW579細胞培養(yǎng)48 h，提取總RNA，并逆轉錄合成cDNA，以U6、GAPDH為內參基因，qRT-PCR法檢測miR-524-5p、FOXD3 mRNA表達水平，以2-ΔΔCt法表示。反應程序：95℃ 10 min；循環(huán)40次：95℃ 10 s，55℃ 35 s，72℃ 1 min。miR-524-5p上下游引物為5′-CTACAAAGGGAAGCACTTTTCTCAA-3′和5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；FOXD3上下游引物為5′-AGCAAGCCCAAGAATAGC-3′和5′-TCCAGGGTCCAGTAGTTG-3′；U6上下游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCAC-3′和5′-AACGCTTCACGAATTTGCG-3′；GAPDH上下游引物為5′-GCACCACCAACTGCTTAG-3′和5′-GCATGGACTGTGGTCATGA-3′。

1.2.3 SW579細胞增殖檢測 SW579細胞培養(yǎng)48 h，加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)2 h，酶標儀(450 nm)檢測吸光度(optical density，OD)值。

1.2.4 SW579細胞凋亡檢測 SW579細胞培養(yǎng)48 h，經消化、洗滌，使用緩沖液制備成1×106個/mL細胞懸液，加入Annexin V-FITC、PI各5 μL，孵育1 h，流式細胞儀檢測細胞凋亡，細胞凋亡率=(早期凋亡細胞數+晚期凋亡細胞數)/總細胞數×100%。

1.2.5 SW579細胞侵襲檢測 Matrigel基質膠(無血清培養(yǎng)基稀釋)加入Transwell小室50 μL，37℃ 2 h凝固。將按1.2.1分組處理的SW579細胞稀釋為2.5×105個/mL，向小室上層加200 μL，小室下層加500 μL含血清培養(yǎng)液，孵育24 h，侵襲細胞經固定、染色，用顯微鏡拍照(6個視野)，統(tǒng)計侵襲細胞數。

1.2.6 劃痕試驗檢測各組SW579細胞遷移能力 按照1.2.1分組處理后，將SW579細胞接種于6孔板，長滿80%時使用槍頭劃線，PBS清洗，培養(yǎng)24 h，顯微鏡拍照，進行劃痕寬度測量，計算細胞遷移率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.7 FOXD3及EMT相關因子蛋白表達檢測 SW579細胞培養(yǎng)48 h，提取細胞總蛋白，測定濃度。取定量蛋白電泳、轉膜、封閉1 h，用FOXD3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Fibronectin、GAPDH一抗(1∶500)孵育過夜，用二抗(1∶5 000)孵育1 h，顯色、顯影，拍照并分析條帶灰度。

2 結果

2.1 miR-524-5p、FOXD3 mRNA表達 與mimic NC組相比，miR-524-5p mimic組SW579細胞中miR-524-5p、FOXD3 mRNA表達水平顯著升高(P<0.05)；miR-524-5p mimic組、siRNA NC組SW579細胞中miR-524-5p、FOXD3 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與siRNA NC組相比，共轉染組SW579細胞中miR-524-5p表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，FOXD3 mRNA水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 miR-524-5p、FOXD3 mRNA在各組SW579細胞中表達水平比較(n=6)

2.2 SW579細胞增殖 miR-524-5p mimic組SW579細胞OD值較mimic NC組顯著降低(P<0.05)；與siRNA NC組相比，共轉染組SW579細胞OD值顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組SW579細胞OD值比較(n=6)

2.3 SW579細胞凋亡 miR-524-5p mimic組SW579細胞凋亡率較mimic NC組顯著升高(P<0.05)；與siRNA NC組相比，共轉染組SW579細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組SW579細胞凋亡情況

2.4 SW579細胞侵襲 與mimic NC組相比，miR-524-5p mimic組SW579細胞侵襲細胞數顯著降低(P<0.05)；miR-524-5p mimic組、siRNA NC組SW579細胞侵襲細胞數差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與siRNA NC組相比，共轉染組SW579細胞侵襲細胞數顯著升高(P<0.05)。見圖2、表3。

圖2 各組SW579細胞侵襲情況(×200)

2.5 SW579細胞遷移 miR-524-5p mimic組SW579細胞遷移率較mimic NC組顯著降低(P<0.05)；與siRNA NC組相比，共轉染組SW579細胞遷移率顯著升高(P<0.05)。見圖3、表3。

圖3 各組SW579細胞遷移情況

表3 各組SW579細胞凋亡率、侵襲細胞數、遷移率比較(n=6)

2.6 FOXD3及EMT相關因子蛋白表達 與mimic NC組相比，miR-524-5p mimic組SW579細胞中FOXD3、E-cadherin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)；miR-524-5p mimic組、siRNA NC組SW579細胞中FOXD3、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin與Fibronectin蛋白水平無顯著差異；與siRNA NC組相比，共轉染組SW579細胞中FOXD3、E-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，N-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 各組FOXD3、EMT相關因子蛋白表達情況

表4 FOXD3、EMT相關因子蛋白在各組SW579細胞中表達水平比較(n=6)

3 討論

腫瘤是危害人類健康的嚴重疾病，近年來研究證實，miRNA廣泛參與腫瘤細胞生物學過程，調控腫瘤進展。不同的miRNA在腫瘤中發(fā)揮的作用不同，同一種miRNA在不同腫瘤中也可能發(fā)揮不同作用。Wang等[11]在垂體瘤組織中發(fā)現miR-524-5p表達下調，將其過表達后可抑制垂體瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力。Liu等[12]研究表明，miR-524-5p過表達抑制胃癌細胞的增殖和侵襲，并促進其凋亡。李順樂等[13]研究發(fā)現，結腸癌組織miR-524-5p的表達水平顯著降低，將其過表達可顯著降低結腸癌SW620細胞活力，減少遷移、侵襲細胞數，并提高細胞凋亡率。華國安等[14]也在研究中發(fā)現，胃癌耐藥細胞SGC-7901和MKN-45被順鉑處理后，其中miR-524-5p表達水平較敏感性親代細胞降低，而轉染miR-524-5p模擬物可增強兩者對順鉑的敏感性。但楊豪等[15]在骨肉瘤中發(fā)現，過表達miR-524-5p可逆轉長鏈非編碼RNA LINC-PINT對人骨肉瘤HOS細胞的增殖抑制和凋亡促進作用。

甲狀腺癌是嚴重威脅女性健康的癌癥，雖隨著醫(yī)療手段的進步，對其治療的手段愈發(fā)多樣且有效，但腫瘤復發(fā)仍是導致患者治療失敗的主要原因。因此，尋找可以對抗跟腫瘤復發(fā)有關的癌細胞生物學行為的方法仍至關重要。靶向治療是能針對細胞行為展開治療的方式，而miRNA被認為是極具潛力的治療靶點。研究發(fā)現，miR-524-5p表達與甲狀腺癌關系密切。Jiang等[16]研究表明，人參皂苷Rh2通過激活miR-524-5p抑制甲狀腺癌細胞的遷移和增殖。Liu等[10]研究表明，miR-524-5p通過靶向Foxe1和ITGA3在細胞自噬和循環(huán)途徑中抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的進展。以上研究表明，miR-524-5p在對抗甲狀腺癌細胞惡性生物學行為方面發(fā)揮重要作用。EMT是上皮細胞在特定狀況下向間質細胞轉化的過程，會導致細胞的遷移、運動能力增加，該過程與多種生長因子、轉錄因子、蛋白因子及它們所調控的通路密切相關[17]。有研究發(fā)現，LINC00511通過LINC00511/miR-524-5p/YB1/ZEB1正反饋回路，促進膠質母細胞瘤的發(fā)生和EMT[18]。EMT的發(fā)生與上皮標志物下調及間充質標志物上調有關[19]。故本研究亦打算從EMT方面探討miR-524-5p對甲狀腺癌侵襲、遷移行為的影響。本研究上調miR-524-5p表達后發(fā)現，SW579細胞的凋亡率、E-cadherin蛋白水平升高，細胞的增殖、侵襲、遷移及N-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白表達均受到抑制，提示過表達miR-524-5p可抑制SW579細胞增殖、侵襲、遷移及EMT過程，并誘導其凋亡。miRNA通常通過調控其它基因的轉錄后水平發(fā)揮作用，但miR-524-5p調控SW579細胞行為的機制尚不清楚。

據研究，FOX家族成員可改變上皮細胞的極性和連接功能，是參與EMT過程的一類轉錄因子，常作為多種miRNA的靶基因，被調控發(fā)揮作用[20]。FOXD3是具有翼狀螺旋結構的FOX家族成員。Yin等[21]研究表明，FOXD3下調促進變性甲狀腺癌細胞侵襲性和EMT過程，并減少細胞凋亡。He等[22]研究表明，FOXD3可抑制HepG2、SMMC-7721細胞的增殖、侵襲、遷移和EMT。本研究發(fā)現，上調miR-524-5p后，SW579細胞中FOXD3 mRNA及蛋白水平升高，提示miR-524-5p過表達可促進FOXD3表達。為探究FOXD3表達在miR-524-5p調控SW579細胞行為的機制中的作用，本研究在上調miR-524-5p基礎上進一步下調FOXD3，發(fā)現SW579細胞的OD值、侵襲細胞數、細胞遷移率及N-cadherin、Vimentin、Fibronectin蛋白水平升高，凋亡率、FOXD3 mRNA及蛋白水平、E-cadherin蛋白水平降低，提示下調FOXD3表達可減輕miR-524-5p對SW579細胞增殖、侵襲、遷移及EMT過程的抑制作用，并減少細胞凋亡。以上研究均表明，miR-524-5p可能通過上調FOXD3表達進而影響SW579細胞的生物學功能，但鑒于miRNA通常負調控其靶基因表達發(fā)揮作用，推測miR-524-5p可能存在能負調控FOXD3的靶基因，通過靶基因的間接作用影響FOXD3表達，進而發(fā)揮抑癌基因作用。

綜上所述，miR-524-5p可能通過提高FOXD3表達，從而誘導甲狀腺癌SW579細胞凋亡，抑制增殖、侵襲、遷移和EMT過程。但miR-524-5p調控FOXD3的具體機制尚不完全清楚，后續(xù)實驗會探索其具體機制，且本研究僅探討了miR-524-5p調控FOXD3對一種甲狀腺細胞系的影響，對其他甲狀腺癌細胞系是否有同樣的效果會在后續(xù)實驗中繼續(xù)探討，此外，雖然miR-524-5p、FOXD3對SW579細胞的影響已明確，但由于本研究缺乏在臨床組織中加以驗證，是否能作為腫瘤靶點在甲狀腺癌進展中發(fā)揮作用還有待進一步研究。

利益相關聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻說明：殷鵬昌負責實驗設計、數據分析、修改和論文撰寫；趙良柱負責數據分析、修改；閆紅印負責課題設計、論文撰寫和修改。