董媛媛, 孫桂江, 李遇伯， 李曉萌 △

天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院 1腔鏡檢查科, 2腎臟病血液凈化治療科 (天津 300211)； 3天津中醫(yī)藥大學中藥學院(天津 301600)

細胞是生物的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，多個功能相同或不同的細胞結(jié)合形成不同的細胞群，從而進行生命活動的傳遞。如果這些細胞發(fā)生功能紊亂將會導(dǎo)致疾病的發(fā)生，從微觀角度可以體現(xiàn)在基因的轉(zhuǎn)錄和表達，蛋白質(zhì)合成代謝，細胞分泌以及細胞或細胞群之間的物質(zhì)代謝，信號傳導(dǎo)等的功能紊亂。相比于許多疾病的個體或組織的分析介紹，單細胞分析技術(shù)從單個細胞層面對細胞的結(jié)構(gòu)和功能進行分析從而得到更加全面的信息[1]，這有效地彌補由細胞異質(zhì)性導(dǎo)致個體或組織平均數(shù)值引起的誤差[2-3]，為更加充分地了解疾病發(fā)生、發(fā)展的機制以及個體差異化的研究提供了補充。了解單細胞層面的研究方法有很多，如質(zhì)譜、單細胞測序、微流控芯片、流式細胞術(shù)等技術(shù)[4]。利用這些技術(shù)從“組學”角度探討單個細胞內(nèi)基因、蛋白等分子的分布、動態(tài)變化并揭示其中的關(guān)聯(lián)以發(fā)現(xiàn)未知基因或新的細胞類型等信息[5]。依據(jù)遺傳中心發(fā)展的過程中包含的基因、轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)以及代謝物等物質(zhì)，在單細胞組學中這些物質(zhì)相對應(yīng)的的組學研究依次為單細胞基因組學、單細胞轉(zhuǎn)錄組學、單細胞蛋白質(zhì)組學以及單細胞代謝組學[6]。然而對這些方向的單一研究無法對疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的變化進行全面解釋，于是對基因、蛋白質(zhì)等分子提出整合分析，進而從多組學角度對細胞結(jié)構(gòu)、功能等方面的改變進行分析研究以闡明機體在疾病發(fā)展或藥物治療的過程中的轉(zhuǎn)變，為在人類發(fā)病機制的探索道路上提供新的指向。該綜述將從單細胞基因組學、單細胞轉(zhuǎn)錄組學、單細胞蛋白質(zhì)組學、單細胞代謝組學等方面對近年來的單細胞組學的研究進行簡略的介紹。

1 單細胞基因組學

基因組學是對基因組核酸堿基序列等分子的結(jié)構(gòu)和功能進行分析研究的學科[7-8]。通過基因組學的研究可尋找疾病相關(guān)的基因、疾病發(fā)生發(fā)展或藥物作用于機體后基因表達變化，為疾病的確診、干預(yù)以及預(yù)后保養(yǎng)等方面的研究提供理論依據(jù)[8-10]。

單細胞基因組學不僅可以詳細準確地描述細胞類型和狀態(tài)，還可以尋找到未知的基因[11]。其基本的步驟如下：(1)樣品前處理;(2)分離細胞;(3)提取脫氧核糖核酸(DNA);(4)基因組擴增;(5)構(gòu)建文庫;(6)基因組測序;(7)數(shù)據(jù)分析[12-13]。

許多研究采用單細胞基因組學的技術(shù)為研究提供可靠的數(shù)據(jù)支持，如Velmeshev等[14]對自閉癥譜系障礙和正?；颊叩纳蠈悠油渡渖窠?jīng)元和小膠質(zhì)細胞進行基因組學分析，發(fā)現(xiàn)特定基因集與自閉癥譜系障礙的患病程度之間存在關(guān)聯(lián)，對尋找治療疾病的有效靶點具有深遠的意義。 Ludwig等[15]通過對線粒體突變進行克隆追蹤，測定線粒體中不同水平的DNA突變，提高推斷克隆譜系的準確性。提示通過單細胞基因組學研究不僅能了解基因狀況，還可對疾病治療有重要意義。

2 單細胞轉(zhuǎn)錄組學

轉(zhuǎn)錄組學是指通過對基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及調(diào)控規(guī)律的研究以獲得細胞表型和功能信息的一門學科[16-17]。通過對一個細胞轉(zhuǎn)錄的核糖核酸(RNA)分析獲取細胞內(nèi)基因表達的具體情況，在基因表達水平上分析疾病發(fā)生、發(fā)展、藥物干預(yù)疾病的關(guān)鍵基因以及為進一步的治療或機制研究提供依據(jù)[18-21]。

單細胞轉(zhuǎn)錄組學可對單個細胞中數(shù)千種基因的信使RNA濃度進行同時測量。單細胞RNA測序技術(shù)是單細胞轉(zhuǎn)錄組學研究的重要手段之一，該技術(shù)不僅避免因樣本量過大忽略單個樣品的不足，還可擴大識別的轉(zhuǎn)錄本范圍[22-23]。利用單細胞測序技術(shù)進行單細胞轉(zhuǎn)錄組學分析的基本操作如下：(1)樣品前處理;(2)分離和捕獲單細胞;(3)對細胞裂解或其他處理;(4)提取核糖核酸;(5)制備互補脫氧核糖核酸(cDNA);(6)聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴增;(7)測序;(8)數(shù)據(jù)處理[23-26]。

單細胞測序與其他技術(shù)結(jié)合可突破傳統(tǒng)測序高噪音、可靠性低、數(shù)據(jù)丟失等的局限，進而獲得更加全面的基因表達譜[24,27-29]。例如，Hanchate 等[25]采用逆行病毒追蹤和單細胞轉(zhuǎn)錄組學結(jié)合的方法探討上游神經(jīng)元的分子特性以及調(diào)節(jié)特定神經(jīng)肽的調(diào)控因子。Aynaud等[30]采用單細胞RNA測序技術(shù)將獨立成分分析與EWSR1-FLI1基因結(jié)合位點和開放染色質(zhì)區(qū)域的時間分辨映射結(jié)合，以闡明Ewing肉瘤內(nèi)部異質(zhì)性的來源。由此可見，單細胞測序與其他技術(shù)的結(jié)合分析可以為細胞或疾病的研究提供新的視角。

3 單細胞蛋白質(zhì)組學

蛋白質(zhì)組學是指對在不同條件下的細胞、組織或生物體的蛋白質(zhì)組的表達、加工以及相互作用等過程研究的學科[31-33]。有文獻介紹稱世界上大部分疾病與蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)的生物學過程密切相關(guān)，與基因序列有關(guān)的疾病僅有約2%[34]。這是因為相比于基因組和轉(zhuǎn)錄組幾乎恒定的數(shù)據(jù)的情況，蛋白質(zhì)組因基因轉(zhuǎn)錄表達后的修飾等過程變得更加復(fù)雜化[35-36]。從蛋白質(zhì)組出發(fā)更加詳細地了解疾病發(fā)生、發(fā)展的機制、臨床確診依據(jù)以及藥物作用位置等信息[37-39]。

單細胞蛋白組學旨在分析研究單個細胞內(nèi)蛋白分子的變化情況。其基本程序如下：(1)樣品分離；(2)去除干擾；(3)提取蛋白質(zhì)；(4)處理消化；(5)質(zhì)譜分析；(6)數(shù)據(jù)處理等[40-41]。

近年來已有質(zhì)譜、流式細胞術(shù)、微流控芯片等單細胞蛋白質(zhì)組學分析技術(shù)[42-43]。如 Fuchs等[44]采用流式細胞術(shù)的高維單細胞蛋白質(zhì)組學方法對正常和潰瘍性結(jié)腸炎患者的外周血自然殺傷細胞進行研究，通過比較自然殺傷細胞、卵子頻率以及部分蛋白質(zhì)表達等變化，揭示疾病相對應(yīng)免疫細胞亞群的變化。Palii 等[45]介紹一種使用單細胞質(zhì)譜儀、細胞進行條形碼、流式細胞術(shù)飛行時間、靶向質(zhì)譜法[穩(wěn)定同位素稀釋(SID)-選擇性反應(yīng)監(jiān)測(SRM)]相結(jié)合的可隨時間變化來量化蛋白質(zhì)的絕對濃度的單細胞蛋白質(zhì)組學方法，探究LS-TFs蛋白水平豐度在紅細胞系分化過程中的變化、雙潛能祖細胞中單細胞水平上是否存在共同表達，得到該蛋白豐度的改變是逐漸發(fā)生且其在細胞命運中具有積極促進作用的結(jié)論。然而流式細胞術(shù)具有因標記蛋白的影響以及質(zhì)譜局限性的缺點，據(jù)此,班琳[42]采用具有能夠精確操控優(yōu)勢的微流控芯片技術(shù)，利用探針、芯片電泳以及實時成像平臺相結(jié)合的方法，探索單細胞蛋白質(zhì)表達以及蛋白質(zhì)通量狀況。通過利用不同技術(shù)對單細胞進行蛋白質(zhì)組學分析研究，得到體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達情況。

4 單細胞代謝組學研究

代謝組學是對代謝產(chǎn)物進行研究的一門學科。通過代謝組學研究不僅可以獲得機體代謝物及其產(chǎn)物變化情況，還可以獲取其涉及到的代謝通路相關(guān)的生物學信息，為進一步探究疾病發(fā)生、發(fā)展的原因以及臨床確診、藥物干預(yù)、新材料的應(yīng)用等方面提供有力的理論依據(jù)[46-48]。

單細胞代謝組學是對生物體內(nèi)相對分子質(zhì)量<1 000且與細胞表型相關(guān)的小分子即包括中間產(chǎn)物在內(nèi)的某些代謝物變化情況的研究[2]。相比于多細胞或組織由于細胞異質(zhì)性引起的誤差，單細胞代謝組學分析不僅有效地避免這一缺陷并且可映射單一細胞功能以及揭示細胞異質(zhì)性與代謝間的關(guān)系[49]。其處理過程基本包括以下幾個步驟：(1)細胞分離；(2)樣本處理；(3)單細胞質(zhì)譜等技術(shù)的耦合分析；(4)數(shù)據(jù)篩選，如消除背景噪音、標準化處、峰對照等；(5)使用代謝分析工具進行統(tǒng)計學分析如主成分分析；(6)代謝組數(shù)據(jù)根據(jù)m/z值初步鑒定代謝物;(7)根據(jù)豐度高的離子信號進行MS/MS分析或與數(shù)據(jù)庫配對，獲得細胞內(nèi)的細胞物種或得到差異代謝物或主要代謝途[49-53]。單細胞代謝組分析的步驟并不是完全一樣的，可根據(jù)自身的實驗設(shè)計進行適當?shù)男薷模员銤M足自身條件要求。

目前基于質(zhì)譜的單細胞代謝分析已廣泛應(yīng)用，例如具有較高特異性及重現(xiàn)性、敏感度好等優(yōu)勢的基質(zhì)輔助激光解吸電離、激光燒蝕電噴霧電離、激光捕獲顯微切割-液體渦流捕獲質(zhì)譜法等[2,54-56]。但單細胞質(zhì)譜分析也面臨檢測量低、內(nèi)容物易缺失、基質(zhì)干擾、鑒定代謝分子困難、活細胞內(nèi)代謝物變化快等巨大挑戰(zhàn)[57]。與其他技術(shù)相結(jié)合可以解決這些問題，如Zhu等[52]采用重新設(shè)計的T探針與串聯(lián)質(zhì)譜相結(jié)合技術(shù)，可對懸浮液中活結(jié)腸癌細胞進行實時在線的細胞內(nèi)容物分子結(jié)構(gòu)鑒定，從而獲得細胞的代謝變化，這可解決單細胞質(zhì)譜法在制備和取樣過程中內(nèi)容物丟失以及不能檢測懸浮細胞的障礙。Zhang等[58]應(yīng)用毛細管微取樣電噴霧離子質(zhì)譜結(jié)合離子遷移率分離方法，對單貼壁哺乳動物的黏附細胞分析以及離子的數(shù)據(jù)庫配對分析，得到不同等壓離子的串聯(lián)質(zhì)譜圖從而鑒定單細胞產(chǎn)生的離子，避免了基質(zhì)對于離子信號的干擾。Wei等[59]介紹一種基于脈沖直流電噴霧電離源方法的Pico-ESI策略，不僅能從單細胞等極小型樣品中獲得大量與代謝物相關(guān)的數(shù)據(jù)，還可通過降低樣品流速避免數(shù)據(jù)的大量丟失。此外，也能減少基質(zhì)干擾。這些技術(shù)的結(jié)合對單細胞代謝組學研究發(fā)展具有里程碑的意義。

近年來，已有許多在單個細胞的代謝物上的研究。通過單細胞代謝組的研究，可以更好地了解細胞內(nèi)分子生物化學過程改變以及細胞表型異常等相關(guān)的生物信息，從而能有效地進行生物學評價，臨床診斷等。但單細胞代謝組學依然存在許多挑戰(zhàn)[49,60]，如許多分析工具不能覆蓋更多的代謝物；代謝物及其產(chǎn)物鑒定的困難；如何擁有較高的敏感度將單細胞內(nèi)的代謝物進行定量分析；如何對活的單細胞內(nèi)代謝物隨時間變化的速率進行量化等問題，雖然已有相關(guān)研究，但存在巨大困難亟需解決。

5 單細胞多組學研究

由于單水平的單細胞組學研究只能給出該層面的具體信息而不能詳細介紹關(guān)于該細胞的全面信息，對單細胞多組學數(shù)據(jù)的整合分析研究應(yīng)運而生[61]。已有許多單細胞水平的多組學研究，如Xhangolli等[62]從單細胞轉(zhuǎn)錄組學和蛋白質(zhì)組學層面上對抗原刺激下嵌合抗原受體T(CAR-T)細胞進行分析，從而探究單個嵌合抗原受體T細胞與天然T細胞間的差異控制以及具有抗腫瘤毒性的CAR-T細胞、細胞因子狀態(tài)和細胞分化表型間的關(guān)聯(lián)性，為藥物治療前后的變化評估以及質(zhì)量保證提供新的思路。而Ooi 等[63]介紹一種微流控的工作流程可對具有96個靶點的蛋白質(zhì)和RNA進行定量分析，從而將RNA與蛋白質(zhì)表達聯(lián)系起來呈現(xiàn)出更加全面的動態(tài)生物學過程。Maurer-Alcalá等[64]通過探討美洲大瞼球菌、幾種雙合細菌、大型截形囊和貪婪的捕食性纖毛蟲鼻二式體在單細胞基因和轉(zhuǎn)錄進化模式的復(fù)雜性，為研究不同微生物的生物學特征提供數(shù)據(jù)。多組學研究不僅可以獲取遺傳中心法則中相關(guān)物質(zhì)的關(guān)聯(lián)性以及全面的動態(tài)生物學信息，還能得到微生物相關(guān)的生物譜信息。當然多組學的大規(guī)模數(shù)據(jù)對實驗平臺的要求較高，需要進一步研發(fā)[6]。

6 小結(jié)

綜上所述，單細胞的組學研究不僅消除細胞異質(zhì)性引起的數(shù)據(jù)損失，還可對從基因結(jié)構(gòu)到轉(zhuǎn)錄過程再到功能執(zhí)行的整個過程進行系統(tǒng)地介紹。這為發(fā)現(xiàn)疾病以及診斷、治療和預(yù)后等提供有力的依據(jù)。目前，單細胞組學相關(guān)的研究雖然已有進展，但挑戰(zhàn)依然存在，如多組學整合分析對相關(guān)組學數(shù)據(jù)并不能全面地分析、檢測小樣本量時所需高敏感度的缺少、樣本處理時的損失、其他物質(zhì)干擾等問題需要進一步的研究解決。而在未來，單細胞水平的整合組學研究會逐漸剖開生命奧義，推動醫(yī)藥領(lǐng)域的進展。

利益相關(guān)聲明：所有作者共同認可本文無相關(guān)利益沖突。

作者貢獻說明：綜述撰寫為董媛媛， 綜述設(shè)計為李曉萌，綜述指導(dǎo)為孫桂江，綜述修改為李遇伯。