梁 瀟 劉 嬌 胡 濤 阮婧華 錢海兵*

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550001

國際疼痛研究學(xué)會將疼痛定義為“一種與實(shí)際或潛在組織損傷相關(guān)的感覺、情感、認(rèn)知和社會維度的痛苦體驗(yàn)”[1]，疼痛反應(yīng)嚴(yán)重影響患者的生活。我國民族藥藥物資源豐富，且有多種鎮(zhèn)痛藥物及制劑應(yīng)用于臨床并取得顯著的效果，從傳統(tǒng)藥物中尋找副作用小且鎮(zhèn)痛效果顯著的藥物已成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。苗藥弩藥液為外用制劑，具有活血化瘀-祛風(fēng)止痛的功效，臨床用于骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕等引起的關(guān)節(jié)疼痛，亦可用于癌性疼痛輔助治療，主要由大血藤、飛龍掌血、透骨香、白屈菜和黑骨藤組方而成，實(shí)驗(yàn)研究[2-6]表明，以上藥物對多種疼痛模型均具有顯著鎮(zhèn)痛作用。

本研究采用熱板實(shí)驗(yàn)、醋酸扭體實(shí)驗(yàn)和福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)，以行為學(xué)和血清疼痛因子水平為指標(biāo)，研究弩藥液的鎮(zhèn)痛作用以及可能的作用受體及機(jī)制，旨在闡明弩藥液對不同疼痛模型的作用，為其臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 ICR小鼠(雌性75，雄性25)，體質(zhì)量(20±2)g；SD大鼠(雌性15,雄性15)，體質(zhì)量(200±20)g。所有動物購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(湘)2019-0014，適應(yīng)性喂養(yǎng)7d后參照文獻(xiàn)[7-8]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑 弩藥液由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供，取原液為高劑量、稀釋一倍為中劑量、稀釋兩倍為低劑量；納絡(luò)酮(批號：MB5693，大連美侖生物技術(shù)有限公司)，配制成 5 mg/kg的納絡(luò)酮生理鹽水溶液；福爾馬林(批號：20170204，重慶江川化工集團(tuán)有限公司)，配制成5%福爾馬林生理鹽水溶液；冰醋酸(批號：20190221，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，配制成0.8%冰醋酸生理鹽水溶液；大鼠IL-6(Interleukin 6，批號：KKSX3XLXAQ)、TNF-α(Tumor Necrosis Factor Alpha，批號：CFDS7MDM1E)、PGE2(Prostaglandin E2，批號：F21MQ8N8J6)ELISA試劑盒。

1.3 儀器 熱板測痛儀(由貴州中醫(yī)藥大學(xué)提供)、JJ224BF型電子天平(常熟市雙杰測試儀器廠，編號：W162419080116)、80-1醫(yī)用離心機(jī)(江蘇新康醫(yī)療器械有限公司)、Infinite M200酶標(biāo)儀(北京新風(fēng)機(jī)電技術(shù)公司)。

1.4 小鼠熱板舔足實(shí)驗(yàn) 雌性ICR小鼠50只，置于 55 ℃ 熱板測痛儀上，以小鼠初次舔咬后足反應(yīng)潛伏期為痛閾指標(biāo)即痛閾值(s)，間隔 20 min 測定兩次，取平均值作為基礎(chǔ)痛閾值，隨機(jī)選擇40只基礎(chǔ)痛閾值在5～30 s 內(nèi)且無跳躍反應(yīng)小鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組10只。小鼠腹部以給藥面積 1.5 cm2備皮，模型組涂抹生理鹽水，高、中、低劑量組分別均勻涂抹相應(yīng)藥物，2次/d，連續(xù) 7 d，末次給藥后 30 min、60 min、90 min 各組小鼠分別測定痛閾值(s)，計(jì)算痛閾提高百分率=(給藥后痛閾值-基礎(chǔ)痛閾值)×100%/基礎(chǔ)痛閾值。

1.5 小鼠納絡(luò)酮拮抗-醋酸扭體實(shí)驗(yàn) ICR小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組、納絡(luò)酮+高劑量組，每組10只。除模型組外，其余各組按1.3項(xiàng)下方法給藥，末次給藥后 45 min，除納絡(luò)酮+高劑量組腹腔注射納絡(luò)酮溶液(5 mg/kg，0.1 mL/10 g)外，其余各組均腹腔注射生理鹽水(0.2 mL/只)，15 min 后，模型組和納絡(luò)酮組涂抹生理鹽水，其余各組分別涂抹相應(yīng)藥物，40 min 后各組均腹腔注射0.8%冰醋酸生理鹽水溶液(0.1 mL/10 g)，立即觀察并記錄各組小鼠初次出現(xiàn)扭體反應(yīng)時間即扭體潛伏期(s)和 15 min 內(nèi)出現(xiàn)扭體反應(yīng)的次數(shù)，15 min 內(nèi)未出現(xiàn)扭體的，潛伏期記為 900 s，計(jì)算鎮(zhèn)痛百分率=(模型組扭體次數(shù)-給藥組扭體次數(shù))×100%/模型組扭體次數(shù)。

1.6 大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn) SD大鼠30只，雌雄各半，隨機(jī)分為空白組、模型組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組6只，按1.3項(xiàng)下方法給藥(空白組參照模型組給藥方式)，末次給藥 30 min 后，除空白組外，其余各組大鼠右側(cè)后足皮下注射5%福爾馬林 100 μL，以皮丘形成為注射成功，立即觀察并記錄各組大鼠第一時相(0～5 min)和第二時相(15～60 min)舔咬后足持續(xù)時間(s)，作為疼痛評價(jià)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)完成后，各組大鼠采用腹主動脈取血，于離心機(jī)分離血清，按照ELISA試劑盒說明書分別測定IL-6、TNF-α和PGE2濃度。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 小鼠熱板舔足實(shí)驗(yàn) 各組小鼠基礎(chǔ)痛閾值相比較無顯著性差異(P>0.05)，給藥后 30 min 和 60 min 高劑量組與模型組痛閾值相比有顯著性差異(P<0.05)；高劑量組給藥后 60 min 和 90 min 的痛閾值與給藥后 30 min 相比均有顯著性差異(P<0.05)，各組給藥后 60 min 和 90 min 的痛閾值相比無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 小鼠熱板實(shí)驗(yàn)各組間痛閾值變化

2.1.2 小鼠納絡(luò)酮拮抗-醋酸扭體實(shí)驗(yàn) 模型組、低劑量組及納絡(luò)酮+高劑量組與高劑量組潛伏期及扭體次數(shù)相比均有顯著性差異(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠納絡(luò)酮拮抗醋酸扭體實(shí)驗(yàn)

2.1.3 大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn) 各組大鼠舔咬后足持續(xù)時間第一時相相比無顯著性差異(P>0.05)，高、中劑量組與模型組舔咬后足持續(xù)時間第二時相相比有顯著性差異(P<0.05)。見表3。

表3 大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)

2.2 血清指標(biāo) 空白組、高劑量組和中劑量組大鼠血清IL-6濃度均與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)；空白組血清TNF-α濃度與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)；空白組、高劑量組和中劑量組血清PGE2濃度與模型組相比有顯著性差異(P<0.05)。見表4。

表4 大鼠福爾馬林致痛實(shí)驗(yàn)血清IL-6、TNF-α、PGE2水平

3 討論

疼痛是炎癥和癌癥等病理狀態(tài)下機(jī)體的主要反應(yīng)[9]。本實(shí)驗(yàn)采用物理刺激和化學(xué)刺激兩種致痛模型，以行為學(xué)和血清致痛因子濃度為指標(biāo)研究弩藥液的鎮(zhèn)痛作用。

熱板法是篩選鎮(zhèn)痛藥物的一個經(jīng)典的熱刺激致痛法[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示弩藥液能夠顯著降低小鼠熱板致痛模型末次給藥后 30 min 和 60 min 的痛閾值，高劑量組在末次給藥后 30 min 的痛閾值與末次給藥后 60 min 和 90 min 均有顯著性差異，說明弩藥液對小鼠熱板致痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，且在末次給藥后 30 min 的鎮(zhèn)痛作用最為顯著。

醋酸扭體法是篩選鎮(zhèn)痛藥物的一個常用化學(xué)刺激致痛法[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示弩藥液能夠顯著減少小鼠醋酸扭體致痛模型扭體潛伏期和 15 min 內(nèi)的扭體次數(shù)，說明弩藥液對小鼠醋酸扭體致痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步加入納絡(luò)酮拮抗組，結(jié)果顯示納絡(luò)酮能顯著拮抗弩藥液的鎮(zhèn)痛作用，納絡(luò)酮是阿片類受體拮抗劑，說明弩藥液的鎮(zhèn)痛作用可能作用于阿片類受體。

福爾馬林致痛法是經(jīng)典的炎癥致痛模型，第二時相為體內(nèi)炎癥因子大量產(chǎn)生而導(dǎo)致疼痛的時期[10]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示弩藥液能夠顯著減輕大鼠福爾馬林致痛模型第二時相舔咬后足反應(yīng)的持續(xù)時間，說明弩藥液對大鼠福爾馬林致痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，且可能與下調(diào)炎癥因子表達(dá)有關(guān)。

炎性疼痛是疼痛的主要類型[11]，IL-6、TNF-α和PGE2是與疼痛相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子，福爾馬林致炎后大鼠體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子濃度升高，促進(jìn)疼痛產(chǎn)生[12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠血清IL-6、TNF-α和PGE2濃度均顯著升高，說明造模成功，弩藥液高劑量組和中劑量組血清中IL-6和PGE2濃度與模型組相比均顯著性降低，TNF-α濃度與模型組相比呈降低趨勢但差異不顯著，即弩藥液可顯著降低血清中IL-6和PGE2濃度，降低TNF-α濃度，說明弩藥液的對大鼠福爾馬林致痛模型的鎮(zhèn)痛作用可能與顯著下調(diào)IL-6、PGE2濃度有關(guān)，而與TNF-α濃度相關(guān)性不大。

綜上所述，弩藥液可能是阿片類鎮(zhèn)痛藥，對多種疼痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，且對炎性疼痛模型的作用可能與下調(diào)炎性因子表達(dá)有關(guān)，但具體機(jī)制仍需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。