張 凱 劉培培 張 松 楊 崢 饒石磊 齊書(shū)然 余 杰 王 旸

肺癌在臨床治療中通常采用外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法等綜合措施，但各種報(bào)道顯示，即使在早期進(jìn)行根治性手術(shù)患者5年生存率也相對(duì)不高。隨著腫瘤分子流行病學(xué)的學(xué)科發(fā)展，研究者們發(fā)現(xiàn)了多種與肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織侵襲相關(guān)的腫瘤標(biāo)志物。肺癌患者死亡的主要原因是癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，細(xì)胞外基質(zhì)降解，腫瘤細(xì)胞的粘附和遷移，血管生成和淋巴浸潤(rùn)在肺癌轉(zhuǎn)移中起著重要作用。 在臨床上，肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)理的研究得到了高度重視[1-2]。PTPN12作為細(xì)胞粘附分子選擇素家族的成員之一，僅在內(nèi)皮細(xì)胞被某些刺激激活時(shí)才表達(dá)，并且與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3-4]。研究提示，PTPN12參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，并且在許多良性或惡性腫瘤疾病中可以觀察到血清水平的變化[5-6]。本文將針對(duì)PTPN12低表達(dá)參與調(diào)控肺癌H1299細(xì)胞凋亡的作用進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

研究納入臨床患者為2019年1月至2020年12月我院收治的肺癌患者，樣本量為82例，收集受試對(duì)象相關(guān)資料以備分析討論。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理學(xué)明確診斷，且為首發(fā)肺癌的受試對(duì)象；具有放化療等綜合治療措施適應(yīng)證的確診患者；預(yù)計(jì)生存時(shí)間高于6個(gè)月；患者能配合研究始終。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并冠心病、糖尿病等疾患的受試對(duì)象；并發(fā)其他惡性腫瘤的受試對(duì)象；對(duì)于本研究中包含的治療方案不能耐受，或拒絕接受治療的患者；術(shù)后并發(fā)癥嚴(yán)重的患者。本次研究共納入男性45例，女性37例；年齡41～82歲，平均年齡(64.34±10.75)歲；其中包含肺鱗癌患者33例，肺腺癌49例；腫瘤分期情況(TNM):Ⅰ期16例，Ⅱ期30例，Ⅲ期22例，Ⅳ期14例；既往有吸煙史48例。

1.2 方法

1.2.1 PTPN12-mRNA及蛋白表達(dá)的測(cè)定與分析 通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)分析PTPN12-mRNA表達(dá)特征；同時(shí)對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 PTPN12基因突變 提取DNA：使用10%中性福爾馬林對(duì)標(biāo)本固定完成進(jìn)行石蠟包埋，病理切片采用HE染色，出血壞死部位在觀察過(guò)程中盡量避開(kāi)，從石蠟包埋塊中取出直徑為0.5 cm的組織塊，腫瘤組織集中并重新涂抹石蠟，嵌入5 μm厚的連續(xù)切片(共6個(gè)切片)。 QIAamp DNA FFPE組織試劑盒用于從樣品中提取DNA。研究使用的分光光度計(jì)為NanoDrop 1000型，用于確定樣品中DNA的濃度和純度。用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)提取的DNA，以進(jìn)行濃度檢測(cè)和質(zhì)量評(píng)估。在DNA濃度介于1.8至2.0之間后，將DNA濃度稀釋至2.0 ng/μL，并為每批樣品添加陰性和陽(yáng)性對(duì)照，以確保測(cè)試質(zhì)量。

進(jìn)行PCR檢測(cè)及測(cè)序分析：本研究中相關(guān)試劑盒購(gòu)自廈門(mén)艾德公司。通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)測(cè)序方法和電泳毛細(xì)管(ABI 3130XL)檢測(cè)樣品PTPN12基因外顯子18～21中的突變。該檢測(cè)試劑盒采用八鏈PCR試管設(shè)計(jì)，該試管配備了PTPN12突變檢測(cè)試劑和相應(yīng)的質(zhì)量控制試劑。在檢測(cè)過(guò)程中，將42.3 μL模板DNA和2.7 μL Taq酶混合，并添加5 μL上述相應(yīng)的試管混合物以形成PCR反應(yīng)系統(tǒng)。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，1個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，15個(gè)循環(huán)； 93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s，31個(gè)循環(huán)。在延伸期間在60 ℃收集信號(hào)。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳(western blot)鑒定PCR產(chǎn)物后，通過(guò)核酸外切酶和熱敏磷酸酶去除引物和dNTPs，并對(duì)純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行PCR測(cè)序，反應(yīng)條件為：純化的PCR產(chǎn)物(10 ng/μL)1 μL， BigDye(2.5×)8 μL，引物3.2 pmoL/μL，10 μL去離子水，測(cè)序引物用NaAc和乙醇純化，然后進(jìn)行雙向測(cè)序。使用的儀器是ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器，并通過(guò)相關(guān)軟件分析了測(cè)序結(jié)果。

研究中相關(guān)結(jié)果判讀：突變Ct值≥陰性臨界值29時(shí)，判定陰性，突變Ct值<陽(yáng)性臨界值26時(shí)為強(qiáng)陽(yáng)性(26～29之間為弱陽(yáng)性)。western blot法完成擴(kuò)增產(chǎn)物等蛋白的定性和定量分析：電泳后從玻璃板上剝離凝膠，將其放入沸騰的凝膠盒中，加入25%的乙醇直至乙醇浸透凝膠表面。將膠盒放入微波爐中，在高溫下煮2.5 min，重復(fù)此步驟3次；隨后，加入考馬斯亮藍(lán)染色液(直到染色液浸入凝膠表面)，然后將其放在室溫下的搖床上緩慢旋轉(zhuǎn)30 min，直到清晰可見(jiàn)凝膠帶為止；第三步，用ddH2O沖洗染色的凝膠后，加入5%的乙酸和25%的乙醇的混合物，并緩慢搖晃漂白搖床約1 h，直到染色液基本洗脫出來(lái)。最后，變色完成后用ddH2O沖洗凝膠，將其放置在凝膠圖像掃描分析儀中，并在使用成像軟件處理后拍攝并保存照片。

1.2.3 血清腫瘤標(biāo)志水平測(cè)定 采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)外周血血清腫瘤標(biāo)志物[糖類(lèi)抗原125(CA125)、癌胚抗原(CEA)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、細(xì)胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)、腫瘤特異性生長(zhǎng)因子(TSGF)]，檢測(cè)時(shí)嚴(yán)格依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。參考區(qū)間：CA125 0～25.0 U/mL，CEA 0～5.0 μg/L，NSE 0～15.0 ng/mL，SCC-Ag 0～1.5 μg/L，CYFRA21-1 0～3.3 ng/mL，TSGF 0～64 ng/mL。

1.2.4 放療敏感性分析 采用0 Gy、2 Gy、4 Gy的γ射線(xiàn)照射PTPN12不同表達(dá)的腫瘤細(xì)胞NCI-H446；通過(guò)MTS實(shí)驗(yàn)、集落形成實(shí)驗(yàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖情況進(jìn)行測(cè)定，分析PTPN12對(duì)腫瘤放療敏感性的影響。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)指標(biāo)(均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、中位數(shù)、四分位間距、極差、率、構(gòu)成比、相對(duì)比等)對(duì)研究結(jié)果中的一般資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)描述；對(duì)服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行組間資料的比較，對(duì)不服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用兩組或多組資料的秩和檢驗(yàn)，進(jìn)行組間資料的比較；采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行率的比較；依據(jù)數(shù)據(jù)是否服從二元正態(tài)分別采用pearson或spearman法進(jìn)行相關(guān)分析；無(wú)特殊說(shuō)明情況下顯著性水平ɑ=0.05，所有P值表示雙側(cè)概率。

2 結(jié)果

2.1 PTPN12表達(dá)對(duì)肺癌病情的調(diào)控作用分析

PTPN12表達(dá)對(duì)肺癌病情的調(diào)控作用分析結(jié)果可見(jiàn)，在組織分化和病理分期更嚴(yán)重的患者中PTPN12-mRNA表達(dá)更低，且在隨訪(fǎng)生存期更低的患者中也可見(jiàn)表達(dá)更低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如表1所示。但PTPN12蛋白表達(dá)只在不同病理分期患者中檢出差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且同mRNA表達(dá)規(guī)律相一致；而在不同組織分化和預(yù)后患者間差別尚未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與樣本量等因素限制有關(guān)，見(jiàn)表1。

表1 PTPN12表達(dá)與肺癌病情預(yù)后的關(guān)聯(lián)分析

研究還對(duì)PTPN12基因突變檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了進(jìn)一步分析，NSCLC患者癌組織標(biāo)本PTPN12基因突變的檢測(cè)結(jié)果顯示，外顯子19突變21例、外顯子21突變17例，無(wú)外顯子19與外顯子21的雙突變。見(jiàn)表2、圖1。

注：1a：19外顯子缺失突變，1b與1c：21外顯子點(diǎn)突變。

表2 PTPN12基因突變特點(diǎn)

與此同時(shí)，PTPN12基因突變與PTPN12基因野生型患者血清腫瘤標(biāo)志物水平比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PTPN12基因突變者血清CEA高于PTPN12基因野生型患者，而CA125、CYFRA21-1低于PTPN12基因野生型患者，兩者SCC-Ag、NSE、TSGF水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 PTPN12基因突變與PTPN12基因野生型患者血清腫瘤標(biāo)志物水平比較

采用PCR法擴(kuò)增PTPN12-mRNA片段，并采用Western blot檢測(cè)受試者血清中PTPN12-mRNA表達(dá)特征，結(jié)果顯示，PTPN12突變型組織樣本組在592 bp左右位置處可見(jiàn)清晰條帶(group1～group5)，而 PTPN12野生型樣本組(group6)及DNA marker組(group7)基本無(wú)條帶，表明PTPN12-mRNA在細(xì)胞肺癌患者中發(fā)生特異性表達(dá)的理論依據(jù)成立。詳見(jiàn)圖2。

注：1～5:PTPN12突變型組織樣本；6:PTPN12野生型樣本；7:DNA marker。

2.2 PTPN12表達(dá)調(diào)控肺癌H1299細(xì)胞凋亡及對(duì)患者放療敏感性的影響作用

PCR以及Western blot檢測(cè)結(jié)果提示PTPN12的mRNA水平及其蛋白質(zhì)表達(dá)水平無(wú)論高低與否，轉(zhuǎn)染 shRNA PTPN12進(jìn)行基因下調(diào)的H1299細(xì)胞均可見(jiàn)PTPN12的表達(dá)下降(P<0.05)，詳見(jiàn)表4和圖3所示。轉(zhuǎn)染后H1299-shGFP 及H1299-shPTPN12細(xì)胞對(duì)放療不同劑量照射(0、2、4、6、 8 Gy)敏感性不一，通過(guò)建立兩組細(xì)胞生存曲線(xiàn)并進(jìn)行分析，可見(jiàn)H1299-shGFP及H1299-shPTPN12細(xì)胞的DO值、Dq值以及 SF2值分別(3.01 Gy、3.42 Gy、0.92及1.83 Gy、2.42 Gy、0.70)差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；詳見(jiàn)圖4所示。另外進(jìn)一步以PTPN12表達(dá)為二分類(lèi)自變量，參考其他潛在影響患者放療敏感性的因素(年齡、性別、腫瘤組織分化情況、腫瘤分期情況)，進(jìn)行多因素回歸分析，也提示PTPN12表達(dá)是獨(dú)立影響放療敏感性的因素，OR值為3.404(95%CI 1.258～9.254)，P<0.05。

表4 PTPN12基因表達(dá)變化對(duì)H1299的轉(zhuǎn)染存活的影響分析

圖3 PTPN12基因表達(dá)變化對(duì)H1299存活影響PCR結(jié)果圖

圖4 PTPN12基因表達(dá)對(duì)H1299放療敏感性的影響分析

3 討論

腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移程度決定了肺癌患者的預(yù)后。 腫瘤細(xì)胞通過(guò)與白細(xì)胞的粘附激活相關(guān)的腫瘤信號(hào)通路，積聚在血管中或穿透血管壁。這個(gè)過(guò)程涉及許多粘附分子，其功能是幫助腫瘤細(xì)胞識(shí)別靶器官的血管內(nèi)皮細(xì)胞[7]。PTPN12是表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞，激活相關(guān)的信號(hào)通路分泌粘附分子選擇素，研究證實(shí)，其表達(dá)在癌周組織的血管內(nèi)皮細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)，與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移存在關(guān)聯(lián)性[8]。PTPN12可直接介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮的黏附，同時(shí)與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的選擇素配體具有相互識(shí)別的功能，可增加腫瘤轉(zhuǎn)移的概率[9]。有研究提示，血清PTPN12濃度的升高可能會(huì)增強(qiáng)血管內(nèi)皮對(duì)腫瘤細(xì)胞的攝取能力，也有可能作為促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的信號(hào)分子[10]。PTPN12作為免疫球蛋白黏附因子之一，在多種細(xì)胞膜表面均可表達(dá)，發(fā)揮著抗原識(shí)別、呈遞以及淋巴細(xì)胞殺傷等功用[11]。既往研究結(jié)果證實(shí)[12]，惡性腫瘤患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞會(huì)過(guò)度表達(dá)PTPN12，一方面增加已轉(zhuǎn)移腫瘤細(xì)胞的黏附性，另一方面促進(jìn)特異性蛋白酶水解，增加血清中PTPN12濃度，使腫瘤細(xì)胞逃脫細(xì)胞免疫監(jiān)視。

本研究患者癌組織標(biāo)本檢出PTPN12基因突變，發(fā)生率為37.50%，與其他相關(guān)研究報(bào)道的NSCLC患者PTPN12突變率38.8%的結(jié)果相近，結(jié)果表明，NSCLC患者的PTPN12突變主要集中在外顯子19缺失和外顯子21點(diǎn)突變，外顯子19突變主要是746至750位密碼子缺失突變，產(chǎn)生相應(yīng)的氨基酸序列[13]。PTPN12是跨膜糖蛋白。在NSCLC中，PTPN12高度表達(dá)，并且PTPN12基因突變后DNA或基因中的單個(gè)堿基對(duì)變化可以增加PTPN12對(duì)三磷酸腺苷(ATP)的親和力，并增加NSCLC患者的酪氨酸激酶活性。靶向酪氨酸臨床實(shí)踐中使用的激酶抑制劑如吉非替尼和厄洛替尼優(yōu)先結(jié)合突變蛋白PTPN12的ATP來(lái)取代ATP，然后抑制磷酸化和下游信號(hào)通路的活化，因此其功效與PTPN12突變[14]。目前多數(shù)NSCLC患者在初診時(shí)已達(dá)晚期，無(wú)法獲得足夠的腫瘤組織進(jìn)行PTPN12基因突變檢測(cè)，分析PTPN12突變患者臨床特征有積極意義[15]。外周血循環(huán)腫瘤DNA為一種主要來(lái)自腫瘤組織，因腫瘤細(xì)胞壞死脫落，能較好體現(xiàn)腫瘤遺傳基因的特征，因而監(jiān)測(cè)腫瘤標(biāo)志物水平可能對(duì)推斷PTPN12突變有益。

總之，PTPN12低表達(dá)同肺癌患者的放射敏感性存在關(guān)聯(lián)，PTPN12下調(diào)可以有效增加H1299細(xì)胞的放射敏感性，可以考慮作為提示患者的放射敏感性靶點(diǎn)，并為靶向治療聯(lián)合放療提供更多依據(jù)。