周志坤 田艷紅 徐 婷 趙美玲 岳 穎

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是臨床常見發(fā)于頭頸部的惡性腫瘤，盡管現(xiàn)代技術(shù)方法已經(jīng)得到改善和提高，但晚期OSCC患者5年生存率不到一半，給患者生命健康造成嚴(yán)重威脅[1]。OSCC發(fā)生發(fā)展是由多因素、多信號(hào)調(diào)控以及多種環(huán)境共同參與的復(fù)雜過(guò)程[2]。切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross complementing 1，ERCC1)編碼一種DNA核酸內(nèi)切酶，該酶是核苷酸切除修復(fù)途徑的關(guān)鍵酶，其與腫瘤的發(fā)生和預(yù)后有密切關(guān)系[3]。研究顯示[4]，ERCC1與口腔鱗狀細(xì)胞癌惡性基因表型有關(guān)，其異常表達(dá)與腫瘤發(fā)生、臨床分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性。既往研究顯示[5]，ERCC1低表達(dá)提示宮頸癌預(yù)后不良。由于ERCC1基因存在不同的基因多態(tài)性，不同個(gè)體的DNA核苷酸切除修復(fù)能力也不同，從而表現(xiàn)出的臨床特征也不同。既往研究顯示[6]，ERCC1基因多態(tài)性可以影響基因表達(dá)量，從而在多種腫瘤的化療反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。本研究采用免疫組化法分析ERCC1在OSCC癌組織和癌旁組織中蛋白表達(dá)情況，探討ERCC1表達(dá)差異及基因多態(tài)性與OSCC臨床特征、生存期的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月至2018年7月我院收治的口腔鱗狀細(xì)胞癌患者62例作為觀察對(duì)象。所有患者均在本院行外科手術(shù)后接受輔助化療治療，且患者經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡>18歲；患者預(yù)計(jì)生存時(shí)間>3月；首次確診并接受治療；患者及患者家屬對(duì)本項(xiàng)研究知情且自愿簽署知情同意書；臨床資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重惡液質(zhì)的患者；合并其他惡性腫瘤患者；存在其他重要器官嚴(yán)重?fù)p傷患者；中途更改治療方案患者。本研究已獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并實(shí)施。

1.2 主要試劑

鼠抗人ERCC1蛋白單克隆抗體購(gòu)于江西江藍(lán)純生物試劑有限公司；質(zhì)譜儀購(gòu)于上海賽默飛色譜質(zhì)譜；研究中所用試劑盒購(gòu)于杭州博日科技股份有限公司。1.3 免疫組化檢測(cè)ERCC1蛋白表達(dá)

手術(shù)切取患者癌組織和癌旁組織，將組織樣本采用常規(guī)石蠟包埋，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水處理后采用免疫組化二步法進(jìn)行免疫組化染色，采用雙氧杉二氨基聯(lián)苯胺進(jìn)行反應(yīng)染色，PBS溶液充分沖洗，蘇木精復(fù)染，1%鹽酸乙醇分化，梯度酒精脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片，普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。著色評(píng)分：不著色計(jì)為0分；淡黃色計(jì)為1分；棕黃色計(jì)為2分；褐色計(jì)為3分。染色腫瘤細(xì)胞所占比例評(píng)分 ：≤10%計(jì)為0分；>10%～30%計(jì)為1分；>30%～60%計(jì)為2分；>60%計(jì)為3分。合計(jì)兩項(xiàng)得分后≥3分定義為陽(yáng)性，<3分定義為陰性。

1.4 DNA提取及其多態(tài)性分析

采集患者外周靜脈血5 mL于抗凝管中，采用TaKaRa全血DNA試劑盒操作步驟進(jìn)行提取DNA，采用質(zhì)譜法分析ERCC1 C8092A位點(diǎn)分布情況。

1.5 隨訪

隨訪自病理確診之日開始計(jì)算，隨訪36個(gè)月。隨訪方式為電話、短信、門診復(fù)查、住院觀察等多種形式相結(jié)合，隨訪頻率為每3、6個(gè)月隨訪1次，所有患者都獲得完整隨訪。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 ERCC1在OSCC組織和癌旁組織中表達(dá)情況

癌組織中ERCC1染色面積大、著色程度強(qiáng)、主要細(xì)胞質(zhì)著色?？谇击[狀癌組織中ERCC1陽(yáng)性表達(dá)45例，陽(yáng)性表達(dá)率72.58%；癌旁組織中ERCC1陽(yáng)性表達(dá)17例，陽(yáng)性表達(dá)率27.42%。ERCC1在OSCC 癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁組織中陽(yáng)性表達(dá)率(χ2=25.290，P<0.05)。

2.2 ERCC1表達(dá)與OSCC患者臨床參數(shù)相關(guān)性分析

ERCC1表達(dá)陽(yáng)性與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、分化程度、腫瘤分期和腫瘤大小無(wú)關(guān)(P>0.05)。見表1。

2.3 ERCC1差異表達(dá)與OSCC患者生存期的關(guān)系

隨訪36個(gè)月，結(jié)果顯示，45例ERCC1陽(yáng)性表達(dá)患者中位生存期為27.80個(gè)月，17例ERCC1陰性表達(dá)患者中位生存期為30.00個(gè)月，兩者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 ERCC1差異表達(dá)與OSCC患者生存期的關(guān)系

2.4 患者ERCC1基因C8092A位點(diǎn)相關(guān)分析

ERCC1基因C8092A位點(diǎn)有3種基因型：野生型(CC)、雜合型(CA)和突變純合型(AA)。ERCC1陽(yáng)性表達(dá)患者CA基因型分布最多(60.00%)，ERCC1陰性表達(dá)患者CC基因型分布最多(62.50%)，ERCC1陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者C8092A基因型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 62例患者ERCC1基因C8092A位點(diǎn)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)(例，%)

2.5 ERCC1基因C8092A位點(diǎn)與OSCC患者生存期的關(guān)系

在C8092A位點(diǎn)上，CC患者18例，CA患者32例，AA患者12例。36個(gè)月隨訪，CC和CA患者中位生存期為31.10個(gè)月和32.80個(gè)月，均長(zhǎng)于AA患者中位生存期21.80個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CC和CA患者中位生存期比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見圖2。

圖2 C8092A位點(diǎn)上的生存期

3 討論

OSCC臨床特征多不顯著，臨床診斷容易被忽視，其發(fā)病率和死亡率常年居高不下。OSCC臨床常采用手術(shù)治療，但術(shù)后患者面容及口腔咀嚼功能常常受損，嚴(yán)重影響進(jìn)食、語(yǔ)言和社會(huì)交往等[7]。越來(lái)越多的研究者致力于分析OSCC發(fā)病的分子機(jī)制，試圖實(shí)現(xiàn)OSCC的早期發(fā)現(xiàn)和早期治療。

本研究結(jié)果顯示，癌旁組織中ERCC1陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌組織，這與前人的多數(shù)研究結(jié)果基本一致[8]。在ERCC1表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系上，ERCC1異常表達(dá)與患者年齡、性別、分化程度、腫瘤分期、腫瘤大小以及發(fā)病部位無(wú)關(guān)，僅在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期中存在顯著性差異。但有研究結(jié)果表現(xiàn)在分化程度上ERCC1表達(dá)也有差異[9]，究其原因可能與ERCC1檢查方法、評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)以及樣本量等因素有關(guān)。本研究結(jié)果說(shuō)明ERCC1異常表達(dá)與OSCC臨床惡性表型有關(guān)。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是多基因共同調(diào)控的生理過(guò)程，癌基因和抑癌基因的表達(dá)出現(xiàn)失衡是OSCC 患者主要病機(jī)[10]。本研究結(jié)果顯示ERCC1蛋白表達(dá)與患者生存期無(wú)明顯關(guān)聯(lián)，而在分析患者ERCC1基因多態(tài)性C8092A位點(diǎn)后，發(fā)現(xiàn)ERCC1陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)患者C8092A基因型分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究結(jié)果說(shuō)明ERCC1差異表達(dá)對(duì)患者預(yù)后影響較小，而ERCC1基因多態(tài)性C8092A位點(diǎn)不同基因分型可能與患者生存期有關(guān)。為此，本文進(jìn)一步比較不同基因型患者生存期，發(fā)現(xiàn)CC和CA患者中位生存期長(zhǎng)于AA患者，其與患者生存期存在一定程度的關(guān)系。ERCC1是第一個(gè)克隆而得的人類DNA損傷修復(fù)基因，研究顯示，ERCC1基因表達(dá)可以提示患者DNA修復(fù)功能較差、病情反復(fù)且通?；颊哳A(yù)后不佳[11]。既往研究顯示[12]，食管鱗狀上皮癌患者ERCC1基因在C80921A位點(diǎn)時(shí)，CC、CA和AA患者生存時(shí)間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究顯示[13]，ERCC1基因多態(tài)性可能影響ERCC1表達(dá)以及蛋白功能，限制性內(nèi)切酶功能受損，增加基因組的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。但本文并未對(duì)此深入探究，這是本文的局限性之一。本研究結(jié)果提示，ERCC1基因多態(tài)性C8092A位點(diǎn)CC和CA基因患者生存期較長(zhǎng)，預(yù)后較AA基因型患者好，AA基因型攜帶者罹患OSCC更容易發(fā)生腫瘤惡化。

綜上所述，ERCC1表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)，可作為OSCC診斷指標(biāo)，用于評(píng)估患者預(yù)后情況。ERCC1表達(dá)與患者生存期無(wú)顯著性關(guān)系；而CC和CA患者中位生存期長(zhǎng)于AA患者中位生存期，臨床治療和改善OSCC患者預(yù)后可從ERCC1基因分型著手，重點(diǎn)關(guān)注CC和CA基因型患者。盡管本研究可為臨床治療此類患者提供數(shù)據(jù)支持，但本研究尚存在一定的局限性。首先，本研究樣本量相對(duì)偏小，且為單中心研究，數(shù)據(jù)可能存在偏倚；其次，缺乏ERCC1基因多態(tài)性影響ERCC1基因表達(dá)的直接數(shù)據(jù)；最后，本文僅分析單一基因及其多態(tài)性在OSCC中的作用，然而腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程往往伴隨著多基因的突變與調(diào)控。這些不足之處將是今后研究的重點(diǎn)。