柳家榮 張 琪

甲狀腺乳頭狀癌是女性比較多見的頭頸部腫瘤，常見的病因主要與碘缺乏、內分泌紊亂和精神壓力大等有關[1-2]，臨床癥狀常見甲狀腺濾泡增生、甲狀腺組織腫大，如若出現(xiàn)腫瘤近期迅速增大或者瘤體活動受限或固定等情況，甲狀腺腺瘤則可能發(fā)生癌變，應及時治療。EMT是發(fā)育過程中細胞的生理性重編程現(xiàn)象，但近年研究表明EMT與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關[3]。由于EMT的發(fā)生，細胞遷移能力和增殖能力增強，促進了腫瘤細胞的快速發(fā)生和發(fā)展[4]。ZEB1是位于10號染色體的一種進化相對保守的轉錄因子，屬于鋅指同源結構域轉錄因子。據(jù)報道，ZEB1在甲狀腺癌中有明顯的表達，且基因上調或者下調影響癌細胞的生長或凋亡[5]。本實驗旨在探討ZEB1基因在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的意義及對細胞上皮-間質轉化(EMT)的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取90例2018年4月到2020年7月到我院進行治療的甲狀腺乳頭狀癌患者，作為甲狀腺乳頭狀癌組，其中男性45例、女性45例，年齡21～59歲，臨床病理分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期18例、Ⅲ期33例、Ⅳ期27例。另外選取同期到我院進行體檢的健康者90例作為正常對照組，其中男性48例，女性42例，年齡20～60歲。2組性別、年齡比較，統(tǒng)計學差異不顯著(P>0.05)。

1.2 細胞與試劑

甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1購自美國公司；FBS購自日本Sanyo公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國HyClone公司；qPCR試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、BCA試劑盒、SDS-PAGE試劑盒均購自上海碧云天生物技術研究所；Transwell小室購自美國BD公司；引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 血液樣本采集 對所有受試者(清晨空腹)采集肘靜脈血液5 mL，在低溫高速離心機中，每分鐘3000轉，離心10 min，提取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 細胞培養(yǎng)與分組 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1，待細胞融合度達到90%左右時，消化傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。正常培養(yǎng)TPC-1作為Con組；將siRNA-Con、siRNA-ZEB1轉染進入TPC-1，作為siRNA-Con組和siRNA-ZEB1組，培養(yǎng)48 h，進行后續(xù)實驗。

1.3.3 qPCR檢測ZEB1基因表達 收集各組細胞，采用RNA提取試劑提取細胞總RNA，反轉錄試劑盒將RNA合成cDNA，熒光定量PCR試劑盒進行PCR。采用2-△△Ct法計算相對表達量。

1.3.4 Transwell檢測細胞遷移和侵襲 收集200 μL的細胞接種于Transwell小室上層，培養(yǎng)24 h后，吸去培養(yǎng)液，用PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，30 min后，用0.1%結晶紫染色，10 min后，計數(shù)發(fā)生遷移的細胞數(shù)量。細胞侵襲實驗，在Transwell小室上層加入50 μL基質膠Matrigel，凝固后接種細胞，之后實驗步驟同細胞遷移一樣。

1.3.5 Western blot檢測E-cadherin、N-cadherin、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白表達 RIPA蛋白裂解液裂解細胞，提取總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量。取樣品蛋白50 μg上樣，用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質，將蛋白條帶轉移至PVDF膜。室溫封閉1 h，加入一抗(1∶1000稀釋)，4℃孵育過夜；加入二抗(1∶2000稀釋)，室溫孵育2 h，在暗室中曝光顯影，用Quantity One凝膠分析軟件處理，檢測蛋白條帶的灰度值。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 甲狀腺乳頭狀癌組織中ZEB1基因的表達

與正常對照組ZEB1基因水平(1.01±0.08)相比，甲狀腺乳頭狀癌組ZEB1基因水平(3.42±0.58)顯著升高(t=28.019，P<0.05)。

2.2 ZEB1基因與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關系

以90例甲狀腺乳頭狀癌患者ZEB1基因水平平均值為界，<平均值為低表達，≥平均值為高表達。90例中ZEB1基因低表達35例，高表達55例。

ZEB1基因表達與臨床分期、分化程度、腫瘤大小、淋巴結轉移密切相關(P<0.05)；ZEB1基因表達與年齡無關(P>0.05)。見表1。

表1 ZEB1基因與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理參數(shù)的關系

2.3 ZEB1基因表達對甲狀腺乳頭狀癌的診斷價值

血清ZEB1基因表達對甲狀腺乳頭狀癌的診斷價值，靈敏度為90.20%，特異度為93.88%，AUC曲線下面積為0.945，標準差為0.0217，95%CI為：0.881～0.981，Z統(tǒng)計為20.483，P<0.0001。見圖1。

圖1 價值診斷圖

2.4 抑制ZEB1表達對甲狀腺乳頭狀癌細胞遷移和侵襲的影響

與Con、siRNA-Con組相比，siRNA-ZEB1組ZEB1 mRNA表達水平以及細胞遷移數(shù)、細胞侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 抑制ZEB1表達對甲狀腺乳頭狀癌細胞遷移和侵襲的影響

2.5 抑制ZEB1表達對甲狀腺乳頭狀癌細胞EMT的影響

與Con、siRNA-Con組相比，siRNA-ZEB1組N-cadherin蛋白表達明顯下調(P<0.05)，E-cadherin蛋白表達明顯上調(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 相關蛋白圖

表3 抑制ZEB1表達對甲狀腺乳頭狀癌細胞EMT的影響

2.6 抑制ZEB1表達對MAPK信號通路相關蛋白的影響

與Con、siRNA-Con組相比，siRNA-ZEB1組ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖3，表4。

表4 抑制ZEB1表達對MAPK信號通路相關蛋白的影響

圖3 相關蛋白圖

3 討論

甲狀腺癌主要分為濾泡上皮細胞起源的乳頭狀癌、濾泡狀癌和未分化癌，以及來源于濾泡旁細胞的甲狀腺髓樣癌[6-7]，本論文主要對甲狀腺乳頭狀癌進行了一系列研究。

本實驗研究表明，與正常對照組相比，甲狀腺乳頭狀癌組ZEB1基因表達水平顯著升高。抑制ZEB1 mRNA表達，顯著降低甲狀腺乳頭狀癌細胞遷移數(shù)、細胞侵襲數(shù)和EMT相關蛋白表達。已有研究結果與本實驗一致。李思[8]研究表明，在轉錄后水平上調ZEB1的表達，導致甲狀腺癌細胞發(fā)生EMT，促進癌細胞侵襲、轉移。還有類似的研究表明，沉默F(xiàn)OXQ1基因可逆轉TPC-1細胞的EMT和侵襲遷移能力[9]。沉默TFF3可以降低甲狀腺乳頭狀癌細胞TPC-1細胞株遷移能力、侵襲能力、克隆形成能力[10]。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，血清ZEB1基因表達對甲狀腺乳頭狀癌的診斷價值，靈敏度為90.20%，特異度為93.88%，AUC曲線下面積為0.945。研究表明PDK1,ZEB1和Vimentin聯(lián)合評估可能對甲狀腺乳頭狀癌的預后判斷具有重要作用[11]。已有文獻發(fā)表，賈勐等[12]研究結果顯示血漿cfDNA對甲狀腺腫瘤診斷的靈敏度為95.0%、特異性為94.0%、準確率為95.0%，表明cfDNA有助于惡性甲狀腺腫瘤的診斷。林恩德等[13]研究結果顯示， 單基因檢測BRAF突變在<1 cm結節(jié)中比FNAC有更好的診斷能力，是甲狀腺微小乳頭狀癌一個可靠的診斷指標。

E-cadherin是一種腫瘤抑制蛋白，E-cadherin表達下降，N-cadherin表達上升是細胞發(fā)生EMT過程中最有代表性的分子特征[14-15]。本實驗發(fā)現(xiàn)，抑制ZEB1 mRNA表達，顯著降低細胞N-cadherin蛋白表達，顯著升高細胞E-cadherin蛋白表達。李艷等[16]研究發(fā)現(xiàn)，敲低信號轉導子和轉錄激活子5(Stat5)抑制甲狀腺癌細胞EMT。薛云等[17]研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織中Stat5高表達，且Stat5參與了甲狀腺癌的EMT過程。楊春偉等[18]研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌組織中存在EMT。

MAPK/ERK通路與腫瘤細胞的增殖和凋亡關系密切，并且參與了EMT的發(fā)生和發(fā)展，具有極其重要的作用[19-20]。本實驗結果顯示，抑制ZEB1 mRNA表達，可顯著降低ERK1/2蛋白、p-ERK1/2蛋白表達。而孫國欣等[21]文獻報道，甲狀腺癌與MAPK信號通路有密切的聯(lián)系。

綜上所述，ZEB1基因表達對甲狀腺乳頭狀癌具有較高的診斷價值，抑制ZEB1基因能通過MAPK信號通路降低細胞遷移、侵襲能力，抑制上皮間質轉化。