白農(nóng)恩，劉李蕾，鄧 巍，姜 林，楊曉燕

（大理大學東喜瑪拉雅研究院/云南省高校洱海流域保護與可持續(xù)發(fā)展研究重點實驗室/三江并流區(qū)域生物多樣性保護與利用云南省創(chuàng)新團隊/中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671003）

【研究意義】葉際是指整個植物地上部分的外表面，生存在葉際表面的微生物稱葉際微生物［1-3］。葉際作為一個獨特的微生境，富含豐富的微生物類群，包括真菌、細菌、病毒和原生動物等［4-5］。已有研究表明，葉際微生物能夠幫助植物對抗病原微生物、耐受逆境（干旱、紫外線、霜凍等）、促進營養(yǎng)吸收，以及調(diào)節(jié)植物代謝平衡等［6］，而葉際微生物除對植物有積極影響外，也會對植物產(chǎn)生許多負面作用，如病原菌的積累會使植物發(fā)?。?］。因此，了解葉際微生物群落結(jié)構(gòu)及其形成機制對植物健康管理和微生物資源開發(fā)具有重要意義。

【前人研究進展】葉際微生物的研究起步較晚，研究的廣度和深度不如根際微生物，但葉際微生物對于植物的健康生長發(fā)育同等重要。目前根際微生物在植物健康方面的研究已經(jīng)相對成熟，但對葉際微生物的研究仍然停留在探索初期［8-11］。這不僅阻礙了對植物與葉際微生物互作關(guān)系的認知，也限制了葉際微生物資源的開發(fā)與應用。細菌是自然環(huán)境中最主要的微生物類群之一，已有研究表明，植物和葉際微生物之間互相影響，雙方處在一個動態(tài)平衡的過程中。相對于根際部分，葉際部分所占植物個體的比例較根際大得多，因此對于葉際微生物的研究，既有挑戰(zhàn)也有機遇。隨著葉際微生物功能（如改變宿主微環(huán)境、防御病害、生物固氮、促進植物生長等）的不斷發(fā)掘，葉際細菌正逐漸被人們所關(guān)注［12-13］。

【本研究切入點】在同一小生境條件下，植物種類差異以及植物與微生物間的相互作用對葉際微生物細菌群落的影響均較大。植物自身特性對細菌群落的影響不僅反映了植物與微生物間的相互作用，還能直接反映植物的健康狀況，能夠為園林植物的健康管理提供具體指導。在小生境下對不同植物的葉際微生物多樣性、群落組成差異等進行比較，探究葉片微生境差異對葉際細菌群落組成的影響，是亟需解決的科學問題?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以云南省大理市大理大學古城校區(qū)一小生境為研究區(qū)域，選擇我國西南片區(qū)最常見的3 種園林喬木為研究對象，使用Illumina 高通量測序技術(shù)對大理大學古城校區(qū)50 m 半徑圓內(nèi)統(tǒng)一朝向東邊栽種的3 種園林植物（枇杷樹Eriobotyra japonica、廣玉蘭Magnolia grandif lora和大青樹Ficus altissima）不同大小葉片上的葉際細菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)進行比較分析。該研究區(qū)域土壤為棕壤，年平均氣溫為14.9 ℃，年日照時數(shù)2 227.5 h，無霜期227 d，年平均降水量1 051.1 mm，屬高原地方性氣候，四季溫差不大，干濕季分明，校園內(nèi)環(huán)境條件基本一致，能夠滿足本研究對小生境的需求。3 種園林植物中，大青樹屬于落葉闊葉植物，而廣玉蘭和枇杷樹屬于常綠闊葉植物。大青樹葉片雙面光滑富含蠟質(zhì)，幼嫩部分稍被毛。廣玉蘭葉面蠟質(zhì)最多，葉片背面有短絨毛。枇杷樹葉面有褶皺，還有一層蠟質(zhì)，且雙面被毛。這3 種植物自身顯著的特性將塑造不同的葉際微生境，為本研究提供了很好的分析基礎。而本研究使用的高通量測序技術(shù)能夠高靈敏度、高效、準確、無偏向性、全面分析葉際細菌的多樣性［14-16］，是目前微生物生態(tài)學研究首選的技術(shù)之一［17-18］。綜上，本研究所選擇的研究對象、研究區(qū)域和試驗技術(shù)均為小生境下3 種園林植物葉際細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性解析提供了保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品采集 2021 年3 月6 日，以大理大學古城校區(qū)（25° 40' 19'' N、100° 9' 17'' E）為研究區(qū)域，選擇以研究區(qū)域內(nèi)最大的1棵大青樹為中心，在其50 m 半徑圓內(nèi)朝向東邊再選擇1 棵廣玉蘭和1 棵枇杷樹，按葉片長度大?。ㄐ。?～10 cm；中：10～15 cm，大：約15 cm）進行樹葉樣品采集。使用無菌剪刀和鑷子分別采集3 種植物不同大小葉片各3 份，共采集27 份樣品，即大青樹3 片大葉子dl1、dl2、dl3，3 片中葉子dm1、dm2、dm3 和3 片小葉子ds1、ds2、ds3；廣玉蘭3 片大葉子gl1、gl2、gl3，3 片中葉子gm1、gm2、gm3 和3 片小葉子gs1、gs2、gs3；枇杷樹3 片大葉子pl1、pl2、pl3，3 片中葉子pm1、pm2、pm3 和3 片小葉子ps1、ps2、ps3。將葉片置于一次性自封袋中，貼上標簽后立即送至實驗室對樣品進行處理。

1.1.2 樣品預處理 向裝有樣品的自封袋中加入25 mL PBS 緩沖液（pH=8），超聲洗滌1 min，渦旋10 s，再以超聲清洗，渦旋2 次，將洗滌液收集于50 mL 無菌離心管中，重復此操作1 次。將兩次操作所得洗滌液置于50 mL 無菌離心管中，8 000 r/min離心10 min，獲得沉淀樣品（液氮速凍），以干冰保存送樣至深圳微科盟科技集團有限公司進行高通量測序分析。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA 提取和PCR 擴增根據(jù)E.Z.N.A.?soil 試劑盒（Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.）說明書提取樣品總DNA，DNA 濃度和純度利用NanoDrop 2000 進行檢測，利用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取質(zhì)量。采用引物對338 F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806 R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對V3～V4 可變區(qū)進行PCR 擴增（PCR 儀：ABI GeneAmp?9700 型），擴增程序為：95 ℃ 預變性3 min；95 ℃ 變性30 s、55 ℃ 退火30 s、72 ℃延伸30 s，27 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增體系為20 μL，包括4 μL 5×FastPfu 緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 5 μmol/L 引物、0.4 μL FastPfu 聚合酶；10 ng DNA 模板［19］。

1.2.2 PCR 產(chǎn)物純化和測序 使用2% 瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences,Union City,CA,USA）對PCR 產(chǎn)物進行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。使用TruSeqDNA PCR-Free Library Preparation Kit（Axygen Biosciences,Union City,CA,USA）建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit 定量和文庫檢測合格后，使用Nova Seq 6000 PE 250 平臺上機測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用Qiitme2 dada2 插件［20］對測序所得序列進行質(zhì)控、修剪、去噪、拼接，以及去除嵌合體，得到擴增子測序變體表格（Amplicon Sequence Variants，ASV）。將ASV 的代表序列與Greengenes數(shù)據(jù)庫（http://greengenes.secondgenome.com，根據(jù)338 F、806 R 引物對將數(shù)據(jù)庫修剪到V3、V4 區(qū)域）進行比對，得到物種的分類信息表。采用Qiime2 feature-table 插件［21］剔除所有污染性的線粒體和葉綠體序列，再使用Qiime2 Core-Diversity［22-23］進行Alpha 多樣性、Beta 多樣性等分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 3 種園林植物葉際細菌群落測序文庫評價

本研究在供試的枇杷樹、廣玉蘭和大青樹所有葉樣中共獲得1 549 867 條細菌的高質(zhì)量序列，平均每片葉片檢測到57 402 條序列，各處理樣品文庫覆蓋率均達到100%。隨機抽取檢測樣本序列，將抽取的序列數(shù)與其代表的ASV 數(shù)繪制稀釋曲線，隨著序列數(shù)的增加，曲線逐漸趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增加檢測樣本沒有產(chǎn)生更多新的ASV（圖1），說明本研究測序深度合適，可以進行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 3 種園林植物葉際細菌群落的Alpha 多樣性稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of alpha diversity in phyllosphere bacterial communities of three garden plants

2.2 3 種園林植物葉際細菌群落注釋比例分析

通過將ASV 的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，得到每個ASV 對應的物種分類信息，共注釋到19 門46 綱75 目148 科259 屬141種。3 種園林植物葉際細菌群落中注釋到各階元的比例如圖2 所示，大青樹注釋到門、綱、目、科、屬、種的比例依次為92.00%、87.84%、76.00%、69.06%、57.32%、25.80%，廣玉蘭注釋到門、綱、目、科、屬、種的比例依次為91.67%、84.21%、83.51%、70.56%、54.07%、22.71%，枇杷樹注釋到門、綱、目、科、屬、種的比例依次為89.47%、89.80%、85.54%、67.97%、60.51%、22.50%?？梢?，3 種園林植物葉際細菌群落注釋到各階元的比例均呈逐漸下降趨勢。

圖2 3 種園林植物葉際細菌群落在各個階元的注釋比例Fig.2 Annotation ratios of phyllosphere bacterial communities of three garden plants in each order

2.3 3 種園林植物葉際細菌群落組成

2.3.1 在門水平上的組成和群落結(jié)構(gòu)分析 在大青樹、廣玉蘭和枇杷樹的葉際共注釋到25 個門的細菌群落（19 個已知門和6 個未知門），其中，變形菌門（Proteobacteria）細菌在3 種園林植物葉際中占絕對優(yōu)勢，占比均達70%以上，其次分別是擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）；軟壁菌門（Tenericutes）只在大青樹和枇杷樹中注釋到，硝化螺旋菌門（Nitrospirae）只在大青樹和廣玉蘭中注釋到（圖3）。

圖3 3 種園林植物葉際細菌群落的門水平組成Fig.3 Phylum level composition of phyllosphere bacterial communities of three garden plants

2.3.2 在屬水平上的組成和群落結(jié)構(gòu)分析 在大青樹、廣玉蘭和枇杷樹的葉際共注釋到259 個屬的細菌群落（圖4），排名前5 的優(yōu)勢菌屬均為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、螺狀菌屬（Spirosoma）、薄層菌屬（Hymenobacter）和無色桿菌屬（Achromobacter）。其中，鞘氨醇單胞菌屬在廣玉蘭、大青樹和枇杷樹的占比相差不大，分別為31.00%、23.00%、22.00%。其余屬在3 種植物中所占比例存在較大差異，甲基桿菌屬在大青樹、廣玉蘭和枇杷樹的占比分別為50.00%、18.00%、10.00%；螺狀菌屬在枇杷樹、廣玉蘭和大青樹中的占比分別為25%、16%、12%；薄層菌屬在枇杷樹中占比最高（47%），在大青樹和廣玉蘭中分別占比7%和6%；無色桿菌屬在枇杷樹中含量最高（41%），在大青樹中占比0.8%，在廣玉蘭中含量最高（2%）。

圖4 3 種園林植物葉際細菌群落的屬水平組成Fig.4 Genus level composition of phyllosphere bacterial communities of three garden plants

由圖5 可知，無色桿菌屬為枇杷樹的第一優(yōu)勢菌屬，薄層菌屬為大青樹的第一優(yōu)勢菌屬，甲基桿菌屬為廣玉蘭的第一優(yōu)勢菌屬，每種植物的第一優(yōu)勢菌屬與其在另外兩種植物的占比均明顯不同。

圖5 27 個葉片樣品葉際細菌群落的屬水平組成Fig.5 Genus level composition of phyllosphere bacterial communities of 27 leaf samples

2.4 3 種園林植物葉際細菌群落多樣性分析

2.4.1 Alp ha 多樣性分析 3 種園林植物葉際細菌群落Alpha 多樣性分析結(jié)果見表1。整體上，枇杷樹葉際細菌群落多樣性水平高于大青樹和廣玉蘭；廣玉蘭的Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均最小；枇杷樹的Chao1 指數(shù)遠大于大青樹，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)略小于大青樹。

表1 3 種園林植物葉際細菌群落的Alpha 多樣性Table 1 Alpha diversity of phyllosphere bacte rial communities of three garden plants

2.4.2 ASV 統(tǒng)計和分類學分析 3 種園林植物葉際細菌群落共有的ASV 序列有454 個，大青樹、廣玉蘭和枇杷樹樣品中特有的ASV 序列分別為808、1 462、1 623，其中廣玉蘭和枇杷樹特有的ASV 數(shù)目遠大于大青樹（圖6）。

圖6 3 種園林植物葉際細菌群落的ASV 韋恩圖Fig.6 ASV Venn diagrams of phyllosphere bacterial communities of three garden plants

2.4.3 B eta 多樣性分析 基于Beta 多樣性分析的3 種園林植物葉際細菌群落的NMDS 分析結(jié)果（圖7）顯示，大青樹、廣玉蘭和枇杷樹的葉片細菌群落明顯分成3 個區(qū)域，其同一植物葉片的細菌群落聚集在一起，不同植物種類的葉片細菌群落分布于不同象限。

圖7 3 種園林植物葉際細菌群落的NMDS 分析結(jié)果Fig.7 NMDS analysis results of phy llosphere bacterial communities of three garden plants

3 討論

3.1 3 種園林植物的葉際細菌群落組成和多樣性存在差異

為了探究小生境條件下由園林植物自身特性造成的葉際細菌群落差異，本研究去除了空間距離、地理位置、季節(jié)、光照等環(huán)境因素對葉際微生物群落構(gòu)建和多樣性產(chǎn)生的影響［24］，選擇以大理大學古城校區(qū)內(nèi)50 m 范圍內(nèi)朝向東邊的枇杷樹、廣玉蘭和大青樹3 種園林植物的葉片為研究對象，聚焦不同植物種類的葉際細菌群落組成和多樣性差異。結(jié)果表明，3 種園林植物的葉際存在結(jié)構(gòu)復雜多樣的細菌群落，細菌多樣性從高到低依次為枇杷樹、廣玉蘭和大青樹。3 種園林植物的葉際細菌群落有共有的門、屬，也有共有的優(yōu)勢門和優(yōu)勢屬，但軟壁菌門只在大青樹和枇杷樹中注釋到，硝化螺旋菌門只在大青樹和廣玉蘭中注釋到，而廣玉蘭和枇杷樹特有的門和屬最多。NMDS 分析結(jié)果表明，不同植物種類的葉際細菌群落存在差異，但同一植物不同大小葉片間的細菌群落相似，且同一植物、不同大小葉片間的第一優(yōu)勢菌屬也一樣。表明3 種植物葉際細菌群落結(jié)構(gòu)存在較大差異，同一植物不同大小葉片間的細菌群落相似，即同一植物的葉際微生境相似。

3.2 植物自身特性會塑造獨特的葉際細菌群落

已有研究發(fā)現(xiàn)，植物葉片蠟質(zhì)層厚度的差異會影響其對微生物的吸附能力，蠟質(zhì)層越厚則葉片吸附的微生物越少，反之，蠟質(zhì)層越薄的葉片能吸附更多的微生物［25］。不同種類的植物葉片被毛情況不相同，被毛的多少間接影響微生物與植物的接觸面積及其棲息環(huán)境，從而影響葉際微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)。本研究選取的3 種園林植物中，枇杷樹葉面不僅有褶皺，還有蠟質(zhì)層，且雙面被毛；廣玉蘭葉片蠟質(zhì)最多，但葉片背面有短絨毛；大青樹葉片雙面光滑富含蠟質(zhì)，幼嫩部分稍被毛。結(jié)果顯示，枇杷樹的Chao1指數(shù)最高，大青樹次之，廣玉蘭最低；枇杷樹和大青樹葉際細菌的Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)無明顯差異，但均高于廣玉蘭，說明蠟質(zhì)層和被毛的有無和多少確實會影響葉際細菌群落。此外，大青樹屬于落葉闊葉植物，而廣玉蘭和枇杷樹屬于常綠闊葉植物，落葉植物的細菌群落構(gòu)建時間短，與植物的相互作用相較于不落葉的植物也更短，因此，廣玉蘭和枇杷樹的葉際細菌相對于大青樹更多樣復雜，表明植物自身特性主導了葉際細菌群落構(gòu)建過程及結(jié)果，即植物自身特性會塑造獨特的葉際細菌群落。

此外，通過高通量測序技術(shù)檢測到的3 種園林植物葉際細菌在種水平上的注釋度僅占20%左右，還存在大量未知細菌，這提示我們在未來的研究中需要繼續(xù)加大純培養(yǎng)力度和宏基因測序深度，從個體到群體對葉際細菌開展持續(xù)研究挖掘葉際細菌資源。

4 結(jié)論

在小生境范圍內(nèi)，大理大學古城校區(qū)3 種主要園林植物（枇杷樹、廣玉蘭和大青樹）的葉際均具有較高的細菌多樣性，不同植物的葉際細菌群落組成和多樣性存在較大差異，而同一植物不同大小葉片間的細菌群落則相似，植物自身特性是造成這種結(jié)果的首要原因，表明植物自身特性主導了葉際細菌群落構(gòu)建的過程和結(jié)果，即植物自身特性會塑造獨特的葉際細菌群落。3 種園林植物葉際都具有菌株資源挖掘潛力。植物葉際細菌群落的構(gòu)建過程及結(jié)果與植物的生長習性高度相關(guān)，在開展后續(xù)相關(guān)研究時需要注意植物種類的選擇。