劉怡冰，邢 凱，敖 紅，翟麗維，劉華濤，趙卿堯，石 詠，李 航，馬福平，王楚端*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，北京 102206；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193）

脂肪組織是機(jī)體的重要組成部分，是動(dòng)物體內(nèi)能量的主要儲(chǔ)存形式。對(duì)于生豬產(chǎn)業(yè)，脂肪沉積性狀也是重要的經(jīng)濟(jì)性狀，顯著影響著生豬的生產(chǎn)效率和繁殖水平。豬肉是中國(guó)居民動(dòng)物蛋白食品的主要來(lái)源。隨著生活水平的提高，人們對(duì)豬肉品質(zhì)的要求越來(lái)越高。脂肪性狀是評(píng)價(jià)動(dòng)物肉質(zhì)的主要指標(biāo)之一，也影響著消費(fèi)者對(duì)豬肉的選擇。同時(shí)，由于相似的遺傳特點(diǎn)和生理特點(diǎn)，豬也逐漸成為研究人類肥胖癥和代謝綜合征的理想模式動(dòng)物。尋找影響豬脂肪沉積性狀的分子標(biāo)記是加快其遺傳進(jìn)展的一個(gè)重要途徑，因此，探討豬脂肪沉積的調(diào)控因子和分子機(jī)制具有重要的意義。

脂肪沉積的過(guò)程是一個(gè)復(fù)雜而精確的正負(fù)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，受到多種基因和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，非編碼RNA 在這個(gè)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。非編碼RNA 包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）、microRNA（miRNA）和環(huán)狀RNA（circRNA）等。2011 年，Salmena 等人提出了“競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA（ceRNA）”假說(shuō)，這是非編碼RNA 與蛋白編碼基因通過(guò)miRNA 反應(yīng)元件（MRE）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA 的一種新的分子調(diào)控機(jī)制。例如，lncRNA或circRNA都可以作為miRNA 海綿體吸附miRNA發(fā)揮ceRNA 的作用，對(duì)miRNA 的功能產(chǎn)生影響，進(jìn)而調(diào)節(jié)mRNA 的表達(dá)，最終對(duì)各種生物學(xué)過(guò)程產(chǎn)生調(diào)控作用。目前，ceRNA 的研究思路已大量應(yīng)用于癌癥等疾病相關(guān)的研究，而鮮見(jiàn)針對(duì)豬脂肪沉積性狀的ceRNA 研究。

本文通過(guò)鑒定在具有極端背膘厚度的長(zhǎng)白豬個(gè)體之間差異表達(dá)的lncRNA、miRNA，并對(duì)其進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)和功能富集分析，篩選參與豬脂肪沉積過(guò)程的關(guān)鍵lncRNA、miRNA 及基因，構(gòu)建脂肪沉性狀相關(guān)的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期為非編碼RNA 調(diào)控豬脂肪沉積性狀的相關(guān)研究提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)樣本選擇 本研究的實(shí)驗(yàn)群體為長(zhǎng)白后備母豬群體，來(lái)自天津?qū)幒釉N豬場(chǎng)，共132 頭。在相同的條件（環(huán)境、飲水、日糧等）下飼養(yǎng)至100 kg 左右，使用HONGDA HS-1500 型獸用B 超儀測(cè)定豬只倒數(shù)第3、4 肋間的活體背膘厚度，再結(jié)合系譜信息，選擇3 對(duì)具有極端背膘厚度的全同胞個(gè)體，按表型分為高背膘組（BH，9.86±1.14mm）和低背膘組（BL，3.70±0.80mm）。采集背部皮下脂肪組織，保存于液氮用于后續(xù)RNA 的提取。

1.2 RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 采用TRIzol 試劑盒提取背部皮下脂肪組織中的總RNA，使用NanoDrop 軟件檢測(cè)RNA 濃度及質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 后，構(gòu)建鏈特異性文庫(kù)并利用Illumina Hiseq 2500 測(cè)序儀進(jìn)行雙端RNA 測(cè)序和小RNA 測(cè)序，此工作由北京百邁客生物科技有限公司完成。

1.3 測(cè)序數(shù)據(jù)分析 首先，使用FastQC 和NGSQC Toolkit軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估及過(guò)濾，去除原始序列數(shù)據(jù)中含有接頭及低質(zhì)量的序列得到Clean reads。再使用Tophat2 軟件將過(guò)濾后的測(cè)序數(shù)據(jù)與豬參考基因組（11.1）進(jìn)行比對(duì)，之后使用Cufflinks及Cuffmerge 軟件對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行組裝。接下來(lái)，使用CNCI、CPC 等編碼能力預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)lncRNA，使用mirDeep2 軟件預(yù)測(cè)miRNA。

1.4 差異表達(dá)分析 使用DESeq2 軟件獲得lncRNA、miRNA 及mRNA 的表達(dá)量，并使用R 包edgeR 進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選差異表達(dá)lncRNA、miRNA及mRNA 的條件為2 組中表達(dá)量差異倍數(shù)>2 以及FDR ≤0.05。

1.5 lncRNA、miRNA 的靶基因預(yù)測(cè)及功能分析 使用bedtools 軟件搜索差異表達(dá)lncRNA 上下游50 kb 范圍內(nèi)的順式靶基因，再對(duì)差異表達(dá)lncRNA 和基因的表達(dá)量進(jìn)行spearman 相關(guān)性分析，預(yù)測(cè)lncRNA 的反式靶基因。使用Targetscan 軟件及miRanda 軟件預(yù)測(cè)miRNA 靶基因。使用在線網(wǎng)站DAVID（https://david.ncifcrf.gov/conversion.jsp）對(duì)靶基因進(jìn)行GO 注釋，使用在線網(wǎng)站W(wǎng)ebGestalt（http://www.webgestalt.org/）進(jìn)行KEGG 功能富集分析，值≤0.05 即為顯著富集，得到的結(jié)果使用R 包ggplot2 進(jìn)行繪圖。

1.6 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 使用RNAhybrid 軟件通過(guò)序列互補(bǔ)情況預(yù)測(cè)lncRNA 與miRNA 的靶向關(guān)系，再結(jié)合lncRNA 與miRNA 的靶基因信息，使用cytoscape 軟件進(jìn)行ceRNA 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 差異表達(dá)lncRNA、miRNA 及mRNA 的鑒定 本研究共鑒定得到1 975 個(gè)lncRNA，其中已知lncRNA 334 個(gè)，新預(yù)測(cè)得到的lncRNA 共1 641 個(gè)。進(jìn)行差異表達(dá)分析之后得到220 個(gè)lncRNA 在高、低背膘組間差異表達(dá)，其中116 個(gè)在高背膘組表達(dá)上調(diào)，104 個(gè)在高背膘組表達(dá)下調(diào)（圖1A）。本研究還鑒定得到351個(gè)已知miRNA，其中有18 個(gè)差異表達(dá)miRNA，6 個(gè)在高背膘組表達(dá)上調(diào)，12 個(gè)在高背膘組表達(dá)下調(diào)（圖1B）。此外，本研究同樣鑒定得到18 507 個(gè)基因，其中1 512 個(gè)在高低背膘組間差異表達(dá)，820 個(gè)在高背膘組表達(dá)上調(diào)，692 個(gè)在高背膘組表達(dá)下調(diào)。

圖1 lncRNA 和miRNA 差異表達(dá)分析

2.2 lncRNA 靶基因預(yù)測(cè)及功能富集分析 本研究共鑒定得到差異表達(dá)lncRNA 順式靶基因67 個(gè)，反式靶基因116個(gè)。對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO 注釋功能富集分析，生物過(guò)程類注釋到的條目中，與糖類和脂類合成及代謝相關(guān)的條目包括“脂肪酸生物合成過(guò)程的正調(diào)控”（圖2A）。接下來(lái)，將這些靶基因在KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，在最顯著的前20 條通路中與糖脂代謝相關(guān)的包括“脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路”、“糖酵解/糖異生”、“脂肪酸生物合成”和“類非酒精脂肪肝?。∟AFLD）”等（圖2B）。

圖2 lncRNA 靶基因的功能富集分析

2.3 miRNA 靶基因預(yù)測(cè)及功能富集分析 本研究共鑒定得到差異表達(dá)miRNA 靶基因863 個(gè)。對(duì)這些靶基因進(jìn)行GO 注釋功能富集分析，顯著富集到生物過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能3 類注釋的條目分別為41、14、15條，其中與糖類和脂類合成及代謝相關(guān)的條目包括“糖異生過(guò)程”、“糖酵解過(guò)程”及“脂肪細(xì)胞分化”等（圖3A）。而通過(guò)KEGG 富集共得到29 條顯著富集的代謝通路，其中最顯著的5 條通路分別為“蛋白質(zhì)消化吸收”、“ECM-受體相互作用”、“粘著力”、“類固醇生物合成”和“胰高血糖素信號(hào)通路”（圖3B）。

圖3 miRNA 靶基因的功能富集分析

2.4 ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 差異表達(dá)lncRNA 共預(yù)測(cè)得到183 個(gè)靶基因，其中包括67 個(gè)順式靶基因和116 個(gè)反式靶基因。再經(jīng)過(guò)lncRNA 和miRNA 的靶向關(guān)系預(yù)測(cè)，本研究構(gòu)建了一個(gè)脂肪相關(guān)的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括9 個(gè)lncRNA、6 個(gè)miRNA 和25 個(gè)靶基因，如圖4 所示。其中，有2 個(gè)lncRNA 為已知lncRNA（TCONS_00053896、TCONS_00142079），所有miRNA 均為已知miRNA。網(wǎng)絡(luò)中所有l(wèi)ncRNA 及miRNA 在本研究中均在高、低背膘組間差異表達(dá)，所有靶基因均富集到脂肪生成或代謝相關(guān)的通路。

圖4 脂肪沉積相關(guān)的ceRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

2.5 RT-qPCR 實(shí)驗(yàn) 為了驗(yàn)證RNA 測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，隨機(jī)挑選在高低背膘組間差異表達(dá)的5 個(gè)基因、5 個(gè)lncRNA 和2 個(gè)miRNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖5 所示，同一基因在qRCR 實(shí)驗(yàn)和測(cè)序結(jié)果中表達(dá)趨勢(shì)的變化相同，驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析的結(jié)果。

圖5 RNA-seq 結(jié)果的RT-qPCR 驗(yàn)證

3 討 論

ceRNA 的調(diào)控機(jī)制參與多種生物學(xué)過(guò)程，尤其是在人類的癌癥發(fā)生過(guò)程中具有重要的作用。在Wang等的研究中發(fā)現(xiàn)lncRNA RHPN1-AS1 可以作為miRNA 海綿競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-596，從而提高基因的表達(dá)水平并激活FAK/PI3K/Akt 信號(hào)通路，促進(jìn)卵巢癌腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。并且，脂肪相關(guān)的非編碼RNA 研究也在不斷完善。Huang 等的研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MEG3 通過(guò)基因競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-21，抑制mTOR 通路，從而促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累，進(jìn)一步誘導(dǎo)肝臟脂肪變性導(dǎo)致非酒精性脂肪肝的發(fā)生。在Wang 等的研究中，lncRNA IMFlnc1 通過(guò)吸附miR-199a-5p 促進(jìn)的表達(dá)，從而通過(guò)cAMP 通路促進(jìn)豬肌內(nèi)脂肪細(xì)胞脂肪生成。

本研究成功構(gòu)建了脂肪相關(guān)ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中包括9 個(gè)關(guān)鍵差異表達(dá)lncRNA，均為新預(yù)測(cè)得到的lncRNA。6 個(gè)關(guān)鍵差異表達(dá)miRNA 分別為sscmiR-486、ssc-miR-9、ssc-miR-34c、ssc-miR-31、sscmiR-205 和ssc-miR-133a-3p，他們對(duì)脂肪沉積過(guò)程的調(diào)控作用已在不同物種中被部分證實(shí)。Mentzel 等的研究發(fā)現(xiàn)，miR-9 在肥胖豬的皮下和腹部脂肪組織中顯著高表達(dá)。而在人類糖尿病患者的血清中，miR-9 的表達(dá)水平高于健康人群。miR-34c 是miR-34 家族成員之一，研究發(fā)現(xiàn)在3T3-L1 前脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中miR-34c 的表達(dá)上調(diào)。Jones 等構(gòu)建的miR-34c 早 期過(guò)表達(dá)的小鼠，1 個(gè)月大時(shí)就會(huì)出現(xiàn)胰島素抵抗，隨著年齡的增長(zhǎng)，會(huì)出現(xiàn)葡萄糖代謝受損和內(nèi)臟脂肪生成失調(diào)，這些變化也是成人肥胖和糖尿病的癥狀之一，所以miR-34c 轉(zhuǎn)基因小鼠可以作為研究成人肥胖的良好模型。有研究表明，miR-205 可以通過(guò)靶向基因改善非酒精性脂肪肝中的脂質(zhì)積累。在高脂喂養(yǎng)的非酒精性脂肪肝（NAFLD）小鼠模型中，miR-205 的過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)水平的降低，從而導(dǎo)致小鼠體重和肝臟重量下降，肝臟甘油三酯減少，甘油濃度升高，最終抑制脂質(zhì)積累。Gottmann 等發(fā)現(xiàn)，miR-31在小鼠性腺白色脂肪組織中特異表達(dá)，靶向和等基因，從而參與脂肪生成和胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路。并且miR-31 在人和小鼠中的序列保守，在肥胖人群和二型糖尿病患者的內(nèi)臟脂肪組織和血清中，miR-31 的表達(dá)顯著高于健康人群，這說(shuō)明miR-31 有可能可以作為治療二型糖尿病的新型靶標(biāo)。

另外，ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的25 個(gè)靶基因中，也有一些是已被證實(shí)的脂肪沉積調(diào)控基因。是sscmiR-205 的靶基因，該基因是?；o酶A 合成酶家族成員，編碼線粒體?；o酶A 合成酶，可催化中鏈脂肪酸代謝過(guò)程，進(jìn)而減輕肝臟脂肪變性。是指維生素D 受體，同樣受到ssc-miR-205 的調(diào)控，Xu 等的研究發(fā)現(xiàn)脂肪組織中的過(guò)度表達(dá)會(huì)導(dǎo)致小鼠體重、脂肪量和血清脂質(zhì)水平增加，抑制產(chǎn)熱基因的表達(dá)，進(jìn)一步導(dǎo)致能量代謝下降，說(shuō)明通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪組織的重塑在糖脂代謝和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。而是ssc-miR-205 和lncRNA TCONS_00026612的靶基因。有研究表明，基因可以通過(guò)抑制過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體2（）的轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制脂肪生成，它是脂肪生成的主要促進(jìn)劑。是ssc-miR-133a-3p 的靶基因。該基因編碼的蛋白質(zhì)作為游離脂肪酸（包括omega-3）的受體，通過(guò)快速激活cAMP 的產(chǎn)生促進(jìn)脂肪生成。Ichimura 等發(fā)現(xiàn)，在肥胖人群脂肪組織中的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，其突變體p.R270H 增加了歐洲人群肥胖的風(fēng)險(xiǎn)，因此該基因在控制人類和嚙齒動(dòng)物的能量平衡方面具有關(guān)鍵作用?；虍a(chǎn)生的脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種內(nèi)源性生物活性多肽，在肥胖患者中表達(dá)下調(diào)。Gao 等的研究證明過(guò)表達(dá)可以增強(qiáng)3T3-L1 成纖維細(xì)胞增殖，加速脂肪細(xì)胞分化，沉默該基因則會(huì)抑制豬前脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)積累。在肝臟中，可以增強(qiáng)脂肪酸的氧化，以減輕肝臟脂質(zhì)積累。

4 結(jié) 論

本研究以3 對(duì)具有極端背膘厚度的長(zhǎng)白豬全同胞個(gè)體為研究對(duì)象，通過(guò)鏈特異性建庫(kù)RNA 測(cè)序和小RNA測(cè)序，鑒定了豬脂肪組織中的lncRNA 和miRNA。進(jìn)行差異表達(dá)分析之后共得到220 個(gè)差異表達(dá)lncRNA 和18 個(gè)差異表達(dá)miRNA。進(jìn)一步對(duì)他們進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)和靶向關(guān)系分析，最終本研究成功構(gòu)建了一個(gè)包含9 個(gè)lncRNA、6 個(gè)miRNA 和25 個(gè)靶基因的與脂肪沉積過(guò)程相關(guān)的ceRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為探究豬脂肪沉積性狀的分子調(diào)控機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。